Gebaseerd op netwerkfarmacologie en dierexperimenten om het effect van fenylethanoïdeglycoside van Cistanche Tubulosa op het effect van diabetische nefropathie te onderzoeken
May 15, 2024
Samenvatting: Doelstelling Het effect onderzoeken vanKanton Cistanchefenylethanolglycosiden(CPhG's) aandiabetische nierziekte(DKD) gebaseerd op netwerkfarmacologie en dierproeven. Methoden De UHPLC-QE-MS-methode werd gebruikt om dechemische componenten van CPhG's. TCMSP- en Swiss Target Prediction-databases werden gebruikt om kerncomponenten te screenen. OMIM- en GeneCards-databases werden gebruikt om DKD-gerelateerde doelen te verkrijgen. Na het verkrijgen van gemeenschappelijke doelen werd de STRING-website gebruikt om een eiwitinteractienetwerk te construeren. De DAVID-database werd gebruikt voor GO, KEGG-pathway-analyse en Cytoscape-software werd gebruikt om het "CPhGs core component-target-pathway" -netwerk te construeren. Tien ratten werden willekeurig geselecteerd als de normale groep, en de overige ratten werden gevoed met voer met een hoog suiker- en vetgehalte en kregen een enkele intraperitoneale injectie met STZ om een DKD-model vast te stellen. Ze werden onderverdeeld in modelgroep, dapagliflozine (1 mg/kg) groep en CPhG's hoge en gemiddelde en lage dosis (500, 25{{40}}, 125 mg/kg) groepen, 10 dieren in elke groep, medicamenteuze interventie gedurende 6 weken, de algemene omstandigheden werden geobserveerd, het lichaamsgewicht werd bepaald en de bloedglucose werd elke week getest; Na de laatste dosis werd 24-uurs urine verzameld. Detecteer 24-uur totaal urine-eiwit (24-UTP); verzamel bloed uit de abdominale aorta en offer het op, scheid serum en detecteer ureumstikstof (BUN), urinezuur (UA), totaal cholesterol (TC), triglyceriden (TG) en hoge bloeddruk. Niveaus van lipoproteïne met hoge dichtheid (HDL) en lipoproteïne met lage dichtheid (LDL), HE-kleuring en Masson-kleuring werden gebruikt om pathologische veranderingen in nierweefsel waar te nemen, ELISA werd gebruikt om serum IL-1, IL{{17} te detecteren }, en TNF-niveaus, en Western blot werd gebruikt om nierweefsel te detecteren. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3-eiwitexpressie. Resultaten In totaal werden 699 componenten gedetecteerd met behulp van de UHPLC-QE-MS-technologie. Na screening werden 16 kerncomponenten van CPhG's en 323 gerelateerde doelen verkregen. CPhGs en DKD deelden 99 doelen. De belangrijkste doelwitten waren STAT3, SRC, EGFR, etc. KEGG-pathway-analyse screende 151 signaalroutes, wat aantoont dat de IL-17-signaleringsroute, PI3K/Akt-signaleringsroute, TNF-signaleringsroute, etc. een sleutelrol kunnen spelen in de behandeling van DKD door CPhG's. CPhG's kunnen het lichaamsgewicht van DKD-ratten verhogen (P=0,01), het waterverbruik verminderen (P=0,01), het glucose- en lipidenmetabolisme reguleren, 24-UTP- en BUN-niveaus verlagen (P=0,01) en het nierweefsel verbeteren . Pathologische schade verminderde de eiwitexpressie van p-JAK2/JAK2 en p-STAT3/STAT3 in nierweefsel (P=0,01) en verhoogde de eiwitexpressie van SOCS3 (P=0,01). Conclusie CPhGs interveniëren in DKD via meerdere componenten, meerdere doelwitten en meerdere routes, mogelijk door JAK2/ te remmen.
STAT3-signaalroute.
Trefwoorden: Cistanche fenylethanolglycoside; diabetische nefropathie; UHPLC-QE-MS; netwerkfarmacologie; dierproef; JAK2 /STAT3-signaleringsroute
HOE LANG DUURT HET VOORDAT CISTANCHE BIJ NIERPATIËNTEN WERKT?
Diabetische nierziekte (DKD), als een van de belangrijkste microvasculaire complicaties van diabetes, is niet alleen de voornaamste oorzaak hiervanchronische nierziektemaar ook de belangrijkste oorzaak van nierziekte in het eindstadium (ESRD) wereldwijd. Reden [1-2]. De klinische behandeling van DKD omvat voornamelijk het controleren van de bloedsuikerspiegel, bloeddruk en bloedlipiden, en ten tweede het beschermen van de nierfunctie, het vermijden van het gebruik van nefrotoxische geneesmiddelen en het verbeteren van de levensstijl [3-4]. Vanwege de complexe pathogenese van DKD en het ontbreken van specifieke interventiedoelen hebben de huidige behandelingsopties echter beperkingen en zijn ze niet effectief. De incidentie van DKD in het eindstadium neemt nog steeds toe. Daarom is het van groot belang om effectieve natuurlijke medicijnen te vinden.
Cistanche Deserticola Y． C． Mama ofCistanche C.De gedroogde, vlezige stengels vanCistanche tubulosa (Schenk) Wightmet geschubde bladeren [5] werden voor het eerst opgenomen in de "Shen Nong's Materia Medica" en werden vermeld als topkwaliteit. Ze staan bekend als "woestijnginseng" [6]. Ze zijn zoet, zout en warm. , keert terug naar de meridianen van de nieren en de dikke darm en heeft de effecten van het voeden van nieryang, het aanvullen van essentie en bloed, het bevochtigen van de darmen en laxerend. Onderzoek toont aan dat fenylethanoïdeglycosiden (CPhG's) een van de belangrijkste actieve ingrediënten zijn en verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling ervan.
De materiële basis voor het uitoefenen van farmacologische effecten; Cistanche-extract heeft antidiabetische [7-8], anti-leverkanker [9], nierbescherming [10-11], neuroprotectieve [12-13] en andere farmacologische effecten, maar momenteel zijn er CPhG's zijn niet effectief bij de behandeling van DKD. De effecten en mechanismen ervan zijn onduidelijk.
Deze studie maakte gebruik van netwerkfarmacologie en moleculaire dockingmethoden [14], waarbij CPhGs als onderzoeksobject werden genomen, de belangrijkste actieve ingrediënten en potentiële doelwitten voor de behandeling van DKD werden voorspeld en geanalyseerd, en vervolgens een combinatie van door streptozocine (STZ) geïnduceerde hoge concentraties werd vastgesteld. Het DKD-rattenmodel gevoed met lipidenvoer werd gebruikt als onderwerp van in vivo onderzoek, als referentie voor de klinische uitbreiding en toepassing van gerelateerde behandelingen en verder onderzoek naar het werkingsmechanisme.
1 materiaal
1.1 Dieren
70-mannelijke SD-ratten van een week oud met SPF-niveau, lichaamsgewicht (240 ± 20) g, werden gekocht bij het Animal Experiment Center van Xinjiang Medical University [Experimental Animal Use License No. SYXK (nieuw) {{4} }], op De dieren werden gedurende 1 week adaptief grootgebracht bij een temperatuur van (22 ± 2) graden, een relatieve vochtigheid van 50% tot 70%, en een afwisselende licht- en donkercyclus van 12 uur/12 uur. Het experiment werd goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Medical Experimental Animal Center van de Xinjiang Medical University (ethieknummer IACUC-20220127-19).
1.2 Reagentia en medicijnen
CPhGs (batch number 201610, purity >80%) werd geleverd door Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozine (batchnummer NB2248) werd gekocht bij AstraZeneca, VK. Voer met een hoog suiker- en vetgehalte (Cat. nr. Boaigang-B1135DM) en STZ (Batch nr. 2021110307) werden gekocht bij Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; urine-microalbumine (partijnummer 20220611), ureumstikstof (partijnummer 20220626), urinezuur (partijnummer 20220613), totaal cholesterol (partijnummer 20220615), triglyceriden (partijnummer 20220616), lipoproteïne met hoge dichtheid (partijnummer 20220614 ), en lipoproteïne met lage dichtheid (batchnummer 20220615) werden gekocht bij het Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; interleukine-6 (IL-6, lotnummer JL20896), interleukine-1 (IL-1, lotnummer JL20884), en tumornecrosefactor- (TNF-, lotnummer 13202 ) werden gekocht bij Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; JAK2 polyklonaal antilichaam van konijn (lotnummer 22v9316), p-JAK2 polyklonaal konijnenantilichaam (lotnummer 78g9360), STAT3 polyklonaal konijnenantilichaam (lotnummer 15x8824), p-STAT3 polyklonaal antilichaam van konijn (lotnummer 74m1478), SOCS3 polyklonaal antilichaam van konijn (lotnummer 74m1478), SOCS3 polyklonaal antilichaam van konijn (partijnummer nummer 31d4841) werden allemaal gekocht bij Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; Met HRP gemerkt geit-anti-konijn-IgG polyklonaal antilichaam (batchnummer 20000758) werd gekocht bij Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -actine monoklonaal antilichaam van konijn (partijnummer AC230205001), RIPA-lysebuffer (partijnummer 20220416), BCA Kits voor het bepalen van de eiwitconcentratie (partijnummer 20230401) werden gekocht bij Beijing Solebao Technology Co., Ltd.
1. 3 Instrumenten
Vanquish ultra-high performance vloeistofchromatografie, Q Exactive Focus massaspectrometer met hoge resolutie, Heraeus Fresco17-centrifuge, FC automatische microplaatlezer (Thermo Fisher Scientific, VS); JXFSTPRP-24 molen (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV-zuiverwatermeter (Duitsland Merck Millipore Company); ACQUITY UPLC BEH C18-kolom (1, 7 μm, 2, 1 mm x 100 mm) (American Waters Company); Accu Chek Performa-bloedglucosemeter (Zwitserse Roche Company); CM1850UV cryostaat, DM300 rechtopstaande fluorescentiemicroscoop (Leica Company, Duitsland); GL-88B vortexmeter (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektronische analytische balans (Bio-Rad Company, VS).
2 methoden
2. 1 UHPLC-QE-MS-analyse
2.1.1 Bereiding van de testoplossing
Weeg 100 mg CPhG's, voeg 500 μl 80% methanol toe, vortex gedurende 30 seconden, ultrasone trillingen in een ijswaterbad gedurende 1 uur, laat 1 uur staan bij -40 graden, centrifugeer bij 4 graden , 12 000 r/min gedurende 15 minuten, zuig het supernatant op, 0. Filtreer door een microporeus membraan van 22 μm en bewaar in een koelkast van -80 graden.
2.1.2 Chromatografische omstandigheden
ACQUITY UPLC BEH C18-kolom (1, 7 μm, 2, 1 mm × 100 mm); acetonitril in de mobiele fase (A) -1% mierenzuur (B), gradiëntelutie (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 tot 12 min, 75% tot 98% A; 12 tot 14 min, 98% A; 14 tot 14,1 min, 98% tot 15% A; 14, 1 tot 15 min, 15% A); Luchthoeveelheid 0 . 5 ml/min; kolomtemperatuur 35 graden; injectievolume 5 μl.
2.1.3 Massaspectrometrieomstandigheden
volledige scan ddMS2 volledige scanmodus; volumestroom van omhulselgas 45 arb; volumestroom hulpgas 15 arb; capillaire temperatuur 400 graden ; botsingsenergie in NCE-modus 15% ~ 30% ~ 45% cyclus; spuitspanning ± 4,0 kV.
2.2 Netwerkfarmacologisch onderzoek
2. 2. 1 CPhG's
Screening van doelcomponenten: Sorteer de chemische componenten die zijn geanalyseerd door UHPLC-QE-MS op basis van hun relatieve inhoud, en verwijder de componenten waarvan de chemische structuren nog niet zijn bepaald. Voer het InChIKey-serienummer van de gescreende ingrediënten in de TCMSP-database in om de farmacokinetische parameters van elk ingrediënt te verkrijgen. Op basis van de voorwaarden van orale biologische beschikbaarheid (OB) > 30% en geneesmiddelgelijkenis (DL) > 0,18, zullen kandidaten die aan de vereisten voldoen worden gescreend. Voer het SMILES-nummer van elke component in de Swiss Target Prediction-database in om het doelwit te voorspellen en het doel van de chemische component van de CPhG te verkrijgen.
2. 2. 2 DKD
Screening op ziektedoelen Gebruik "diabetische nefropathie" als zoekterm om te zoeken naar ziektedoelen in OMIM-, GeneCards- en NCBI-databases.
2. 2. 3 Constructie van netwerkcomponenten voor doelziekten
De cross-targets van CPhGs-componenten en ziekten werden verkregen door middel van R-software mapping, en Cytoscape 3.7.2-software werd gebruikt om een component-target netwerksysteem te construeren, waarin de analyseplug-in kerndoelen detecteerde.
2. 2. 4 Constructie van een eiwit-eiwit-interactienetwerk (PPI)
Importeer de kruispuntdoeleiwitten van componenten en ziekten in de STRING-database, bouw een eiwit-eiwitinteractienetwerk (PPI), verwijder eiwitten zonder verbonden knooppunten in het netwerk en stel het betrouwbaarheidsniveau van de laagste eiwitinteractiescore in op {{1} }.700. Bouw een PPI-netwerk, download de resultaten in TSV-formaat, importeer ze in Cytoscape 3.7.2-software en gebruik de analyseplug-in om de kerndoelen verder te screenen.
2. 2. 5 GO, KEGG-analyse
Gebruik de sectie Functionele annotatie in de DAVID-database om verrijkingsanalyses uit te voeren op de kruispuntdoelen van componentziekten. Stel eerst de analyseparameters in, voer het kruispuntdoel in het vak Genenlijst in, selecteer officieel gensymbool als doelidentificatie, selecteer Genenlijst als gegevenstype (Lijsttype) en selecteer "Homo Sapiens (Species)" als het doelbron (soort). Race)", start de analyse na het bevestigen van de analyseparameters, verkrijg de GO- en KEGG-analyseresultaten en gebruik vervolgens het ImageGP online tekenplatform om het bellendiagram van de KEGG- en GO-analyseresultaten te tekenen. Cytoscape 3.7.2-software construeert de component -doel-pad netwerkbeeld.
2. 2. 6 Moleculaire koppeling
Download eerst het 3D-structuurdiagram van het actieve ingrediënt in SDF-formaat uit de PubChem-database, download vervolgens het 3D-structuurdiagram van het kruispuntdoel in PDB-formaat uit de US Global Protein Database (PDB) en upload het ten slotte naar het CB-Dock website voor moleculaire docking. Screen de dominante dockingconformaties en visualiseer ze met Pymol.
2.3 Dierproeven
2.3.1 Modellering, groepering en medicijntoediening
10 ratten werden willekeurig geselecteerd als de normale groep en gevoed met gewoon voer, en de overige ratten werden gevoed met voer met een hoog suiker- en vetgehalte. Na 6 weken kregen ze een eenmalige intraperitoneale injectie van 30 mg/kg STZ (0,1 mmol/L STZ opgelost in pH 4,5 natriumcitraatbuffer) en 72 uur later werd bloed uit de staartader afgenomen. om nuchtere bloedglucose (FBG) te detecteren. Als FBG groter dan of gelijk is aan 16,7 mmol/L, werd het diabetesmodel met succes vastgesteld [15]; vervolg Ze kregen 2 weken lang suikerrijk en vetrijk voer. DKD-modellering bleek succesvol op basis van urineglucose-positiviteit en 24-uur totaal urine-eiwit (24-UTP) groter dan of gelijk aan 20 mg. Onder hen stierven er 3 tijdens het modelleringsproces en 7 waren niet succesvol. , in totaal waren er 50 succesvol. De ratten die met succes werden gemodelleerd, werden willekeurig verdeeld in de modelgroep, de dapagliflozinegroep (1 mg/kg) en de CPhG-groepen met hoge, gemiddelde en lage dosis (500, 250, 125 mg/kg). Elke toedieningsgroep werd intragastrisch toegediend. De ratten in de normale groep en de modelgroep kregen overeenkomstige medicijnen, en de ratten in de normale groep en de modelgroep kregen dezelfde hoeveelheid normale zoutoplossing via maagsonde, eenmaal per dag gedurende een totaal van zes weken. Tijdens de toedieningsperiode bleven ratten in elke groep behalve de normale groep vetrijk voer krijgen.
2.3.2 Detectie van biochemische indicatoren
Na zes weken CPhG-interventie werd 24-uur urine verzameld van de ratten en werd 24-uur totaal urine-eiwit (24-UTP) gemeten; bloed werd verzameld uit de nuchtere staartader om FBG-niveaus te detecteren; bloed werd verzameld uit de abdominale aorta, 4 graden, 1500 r/min. Centrifugeer gedurende 10 minuten om het serum te scheiden en serumureumstikstof te detecteren.
BUN), urinezuur (UA), totaal cholesterol (TC), triglyceriden (TG), lipoproteïne met hoge dichtheid (HDL), lipoproteïne met lage dichtheid (lipoproteïne met lage dichtheid LDL).
2.3.3 Observatie van pathologische morfologie van nierweefsel
De ratten werden verdoofd met natriumpentobarbital en gedood. De nieren werden afgepeld, gewogen, gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd, transparant, in was gedompeld, ingebed en in secties gesneden voor kleuring met hematoxyline-eosine (HE).
Na Masson-kleuring werd de weefselmorfologie onder een microscoop waargenomen en werd Image-Pro Plus 6.0-software gebruikt om de geïntegreerde optische dichtheid te analyseren en het relatieve collageenvezelgebied te kwantificeren.
2. 3. 4 ELISA
De methode werd gebruikt om de niveaus van serumontstekingsfactoren bij ratten te detecteren. De niveaus van IL-6, IL-1 en TNF- werden gedetecteerd volgens de instructies van de kit.
2. 3. 5 Western blot-methode om gerelateerde eiwitexpressie te detecteren
Er werd nierweefsel van de rat afgenomen, RIPA-lysaat werd toegevoegd om het totale eiwit te extraheren en de concentratie werd bepaald met de BCA-methode.
Na natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese, overdracht naar PVDF-membraan en na blokkering, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1: 2000), SOCS3 (1:2000), -actine (1:2000) antilichamen, incubeer een nacht bij 4 graden, voeg HRP-gelabeld IgG secundair antilichaam toe (1:5000) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, ontwikkeld met elektroluminescentiekit, blootgesteld door eiwitgel-imager, met behulp van Image J-software
Kwantitatieve analyse van stukken. Met behulp van -actine als interne referentie is de verhouding tussen de grijswaarde van de doelband en de interne referentieband de relatieve eiwitexpressie.
2.4 Statistische analyse
De gegevens zijn verwerkt door SPSS 25.0-software en de gegevens zijn uitgedrukt als (x±s). Voor de vergelijking tussen groepen werd eenzijdige variantieanalyse gebruikt. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.
