Gunstige effecten van totale fenylethanoïde glycosidefractie geïsoleerd uit Cistanche Deserticola op botmicrostructuur bij ratten die ovariëctomie hebben ondergaan

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang en Xueqin Ma

1 Afdeling Farmaceutische Analyse, School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, China

2 School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, 692 Shenli Street, Yinchuan 750004, China

3 Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, China

Dit is een open-access-artikel dat wordt gedistribueerd onder de Creative Commons Attribution-licentie, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie op elk medium toestaat, op voorwaarde dat het originele werk correct wordt geciteerd.

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstract

De huidige studie was ontworpen om de antiosteoporotische activiteit van de totale fenylethanoïde glycosidefractie geïsoleerd uit te schattenCistanchedeserticola(CDP) op ratten geïnduceerd door ovariëctomie (OVX) en de gerelateerde mechanismen. Na 3 maanden orale toediening waren de verminderde botmineraaldichtheid, serum Ca en P bij OVX-ratten hersteld en was de verslechterde microarchitectuur van het trabeculaire bot gedeeltelijk verbeterd door interventie van Cistanche deserticola (60, 120 en 240 mg/kg), de activiteiten van botresorptiemarkers werden neerwaarts gereguleerd en de bioactieve van de botvormingsindex werd opgereguleerd; ondertussen was het gehalte aan MDA afgenomen en werd GSH verhoogd door CDP-behandeling. Samenstelling werden 8 fenylethanoïde glycoside verbindingen geïdentificeerd inCistanchedeserticola(CDP), waarbij de totale inhoud werd gekwantificeerd als 50,3 procent met behulp van de HPLC-methode. mechanisch,Cistanchedeserticola(CDP) de niveaus van TRAF6, RANKL en RANK verlaagden, waardoor RANKL/RANK/TRAF6-geïnduceerde activering van stroomafwaartse NF-KB- en PI3K/AKT-signaleringsroutes werd onderdrukt en uiteindelijk activiteiten van de belangrijkste osteoclastogene eiwitten van NFAT2 en c werden voorkomen. -Fos. Alle bovenstaande gegevens impliceerden dat CDP gunstige effecten vertoonde op de botmicrostructuur bij ratten waarbij de eierstokken waren verwijderd, en deze effecten kunnen verband houden met de NF-KB- en PI3K/AKT-signaleringsroutes die werden geactiveerd door de binding van RANKL, RANK en TRAF6.

Cistanche tubulosaheeft veel effecten, klik hier om meer te weten

1. Inleiding

Postmenopauzale osteoporose, waar 1 op de 3 vrouwen ouder dan 50 jaar aan zal lijden, wordt het grootste gezondheidsrisico dat meer dan 200 miljoen vrouwen over de hele wereld treft [1]. Tijdens de menopauze leidt de scherpe daling van het oestrogeengehalte gewoonlijk tot een overschrijding van de botresorptie veroorzaakt door een verhoogde osteoclastogenese; vervolgens werd de balans tussen osteoblast-geïnduceerde botvorming en osteoclast-geïnduceerde botresorptie verstoord, en de versnelde botresorptie veroorzaakte uiteindelijk osteoporose en zelfs heup- of wervelkolomfractuur [2]. Er werd aangenomen dat de differentiatie van de osteoclast werd geactiveerd wanneer de receptoractivator van nucleaire factor kappa B (RANK) werd gebonden aan RANKL, het ligand van RANK. De combinatie van RANK tot RANKL kan echter niet worden geactiveerd tenzij eiwit tumornecrosefactorreceptor-geassocieerde factor 6 (TRAF6) erin werd samengevoegd [3], gevolgd door de stimulatie van stroomafwaartse signaalroutes, waaronder PI3K/AKT en NF-KB. En ten slotte werden de expressies van de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen c2 (NFAT2) en c-Fos gereguleerd [4] om de differentiatie van de osteoclast en de botresorptie te moduleren. Zo werd aangenomen dat de factoren en regulatoren die direct of indirect verband houden met de activering en differentiatie van osteoclast, cruciale doelen zijn voor het voorkomen van botverlies.

Er zijn inderdaad enkele klinische en synthetische hormoonvervangende therapiegeneesmiddelen zoals estradiolvaleraat die effectief zijn bij de behandeling van postmenopauzale osteoporose. Helaas verhoogden sommige hiervan het risico op ernstige kankers, waaronder borst- en endometriumkanker [5], wat hun klinische toepassingen beperkte. Daarom is het noodzakelijk om andere alternatieven te kiezen met zowel werkzaamheid als minimale bijwerkingen. Traditionele Chinese medicijnen (TCM), evenals de geïsoleerde bioactieve verbindingen en fracties [6-9], bleken effectief te zijn bij verschillende aandoeningen, waaronder postmenopauzale osteoporose. Onder deze bioactieve componenten en fracties werden fenylethanoïde glycoside (PhG) verbindingen met potentiële werkzaamheid beschouwd als veelbelovende middelen voor de behandeling van osteoporose [10-12]. De structuren van PhG's bestaan ​​uit kaneelzuuraglycon, een hydroxylfenylethylgroep die via een glycosidische binding wordt gecombineerd met -glucopyranose, apiose, galactose, rhamnose of xylose. Ze komen veel voor in geneeskrachtige soorten van het geslachtCistanche[13]. CistanchedeserticolaYC Ma is een officiële TCM die is vastgelegd in de Chinese farmacopee, en behalve dat het een belangrijke TCM is [14], is C deserticola ook een anti-aging tonisch kruid met weinig bijwerkingen dat is ontwikkeld tot medicinale drank en voedingsvloeistof die is goedgekeurd door de State Food en Geneesmiddelenadministratie. Gebaseerd op het record van Chinese farmacopee, werd C. deserticola traditioneel gebruikt door inboorlingen om nieressentiedeficiëntieproblemen zoals spierzwakte en lumbale zwakte aan te pakken, en fenylethanoïde glycosideverbindingen, waaronder echinacoside en acteoside, zijn de belangrijkste bioactieve bestanddelen in dit kruid. Volgens de TCM-theorie van "nier-govern-bone", wordt het botsysteem bepaald door nieressentie [15], en botgerelateerde problemen zoals osteoporose kunnen worden hersteld door kruiden of verbindingen die de activiteit bezitten van het voeden van de nieressentie. Daarom veronderstelden we dat de totale fenylethanoïde glycosidefractie geïsoleerd uit C. deserticola, althans gedeeltelijk, gunstig was bij de behandeling van osteoporose. Het huidige experiment is daarom bedacht om onze hypothese te valideren door gebruik te maken van een ovariëctomie (OVX) ratmodel; naast de botresorptie- en vormingsmarkers die moeten worden geschat, werden ook de antioxidatie-index en de door RANKL/RANK/TRAF6- geïnduceerde PI3K/AKT- en NF-KB-signaleringsroutes gebruikt om de belangrijkste mechanismen van de antiosteoporotische biologische activiteit te onderzoeken .

2. Materialen en methode

2.1. Plantaardige materialen en voorbereiding.

In totaal 30 kg stelen vanCistanchedeserticolaY.C. Ma werden in september 2015 in Yongning County opgehaald met de coördinaten 106.026597 en 38.262816, provincie Ningxia, China. Het kruid werd geïdentificeerd door Dr. Lin Dong (afdeling Farmacognosie, Ningxia Medical University) en een overeenkomstig exemplaar (#201509{{40}}1) werd bewaard in de afdeling Farmaceutische Analyse. Eerst werd 30,0 kg poedervormig C. deserticola geëxtraheerd met behulp van de refluxmethode met 70 procent ethanol als oplosmiddel; de verhouding van materiaal tot oplosmiddel werd ingesteld op 1:10 en de refluxtijd was 3 keer 2 uur. Vervolgens werden alle filtraten gecombineerd en onder verminderde druk bij 60 ° C gecondenseerd. Ten tweede werden AB-8 macroporeuze harskolommen gebruikt voor de voorlopige scheiding en verschillende verhoudingen van ethanol in water (0 procent, 20 procent, 30 procent, 40 procent, 50 procent en 60 procent, elk 60 L) werden gebruikt voor het elueren. Ten derde werden de 40 procent en 50 procent eluens gecombineerd en verder gezuiverd door herhaalde AB-8 macroporeuze harskolommen te gebruiken met de eluens van 0 procent, 20 procent, 30 procent, 40 procent en 50 procent ethanol in water, en elk eluens was 12 L. Ten slotte werd de 40%-fractie verzameld en onder verminderde druk gecondenseerd om 150 g lichtgele sediment-fenylethanoïde-glycosidefractie van C. deserticola (CDP, de opbrengst was 0,5%) te verkrijgen. Voor in vivo experimenten werd 0,5 procent CMC-Na-oplosmiddel gebruikt om CDP op te lossen; orale toediening aan dieren werd ingesteld op 1 ml/100 g lichaamsgewicht; voor in vitro Western-blot-analyse werd CDP opgelost met DMSO en vervolgens verdund met DMEM om de uiteindelijke concentraties van 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml en 0,001 mg/ml te verkrijgen.

2.2. Chemicaliën en oplosmiddelen.

Estradiolvaleraat (EV) was van Delpharm Lille SAS, Frankrijk; alkalische fosfatase (ALP), bot-gla-eiwit (BGP), tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) en deoxypyridinoline (DPD) crosslink ELISA-kits van Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China, 201605; malondialdehyde (MDA, 20181221), superoxide dismutase (SOD, 20121218) en glutathion (GSH, 20181221) reagenskits van het Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, China; lntact parathormoon (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonine (2L9ISN7AIU) en oestrogeengerelateerde receptor-alfa (ERR, Y3AY8QEWB3) verknopen ELISA-kits van Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, China; cathepsine K ELISA-reagenskit van BioVision, Amerika, 1l300141; primaire antilichamen van RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-KB p65 (AH04138226), PI3 kinase p85 alfa (AC09021266) , AKT 1 (AF05173234), -actine (17AV0411), en secundaire antilichamen van met mierikswortelperoxidase geconjugeerd geiten-antikonijn-IgG van ZSGB-BIO, China, 136080; totale BCA-eiwittestkit en de commerciële kit voor de detectie van oste-oclastvorming en foetaal runderserum en Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) van HyClone, Logan, UT, VS; polyvinylideen flfluoride (PVDF) membraan van Millipore Life Sciences, Billerica, MA, VS; penicilline en streptomycine van Gibco, Rockville, MD, VS. Alle andere gebruikte chemische middelen waren van AR-kwaliteit.

2.3. HPLC-kwantificering van Cistanche Deserticola P.

Een Agilent 1220 HPLC-instrument werd gebruikt om de samenstelling van CDP te identificeren en te kwantificeren. De chromatografieomstandigheden waren als volgt: C18-kolom (TSK-GEL, 4 6 Id x 250 mm, 5 m); gradiëntelutie bevatte oplosmiddelen A (acetonitril) en B (water met 0,5 procent azijnzuur) (0-10 min: 17-20 procent A; 10-30 min: 20-25 procent A; en 30-40 min: 25-30 procent A); de detectiegolflengte was 333 nm; omgevingstemperatuur; stroomsnelheid was 1,0 ml/min; monsterinjectievolume was 5 L. Acht PhG-verbindingen, namelijk cistanoside F, echinacoside, 6′-acetylacteoside, cistanoside C, cistanoside A, acteoside, 2′-acetylacteoside en isoacteoside, werden geïdentificeerd; door gebruik te maken van de overeenkomstige referentiestoffen en een externe standaardmethode, werd de inhoud van de bovenstaande 8 PhG's gekwantificeerd door HPLC-analyse (Figuur 1).

2.4. Dierexperimenteel protocol.

Een totaal van 60 vrouwelijke volwassen Sprague-Dawley-ratten van 3 maanden oud, afkomstig van het centrum voor dierproeven van de Ningxia Medical University, met een gemiddeld aanvankelijk lichaamsgewicht van ongeveer 234 ± 25 g. De ratten werden gehuisvest in een standaard specifieke pathogeenvrije omgeving om gedurende 1 week te acclimatiseren. Vervolgens werden alle ratten alleen verdoofd (chloraalhydraat, 100 mg/kg, ip) of schijn-ovariëctomie (SHAM), of twee eierstokken werden beide verwijderd en vervolgens willekeurig verdeeld in 5 subgroepen: oraal behandeld met vehikel (0,5 procent CMC- Na) werd ingesteld als de modelgroep (OVX), estradiolvaleraat (1 mg/kg/dag) als de positieve groep (EV) en 60, 120 en 240 mg/kg/dag van CDP als laag (CDPL), respectievelijk matige (CDPM) en hoge (CDPH) doseringsgroepen. Alle ratten werden dagelijks oraal toegediend en duurden 3 maanden, waarbij de dosering elke 2 weken werd aangepast, afhankelijk van de verandering van het totale lichaamsgewicht. Op de laatste dag van de dierproef werd 24-uururine verkregen met behulp van metabole kooien; serum werd verzameld uit de dijbeenslagader van verdoofde ratten; de rechter femora, tibia en alle organen werden ontleed en bewaard bij -80 graad C voor verdere analyse. De dierproeven die we hebben uitgevoerd, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Ningxia Medical University.

2.5. Bepaling van botmineraaldichtheid en micro-CT-analyse.

Ten eerste werd een dual-energy röntgenabsorptiometriemachine (Lunar, VS) gebruikt om de totale botmineraaldichtheid van het rechter dijbeen van elke rat te schatten; ten tweede werd hetzelfde dijbeen gebruikt om het 3D-beeld van trabeculaire botmicroarchitectuur te schatten door gebruik te maken van een micro-CT-scannerapparaat (GE, Amerika). De isotrope resolutie werd ingesteld op 14 m om een ​​ideaal 3D-beeld te verkrijgen; het interessegebied (ROI) werd gekozen door dezelfde coördinaten in de groeiplaat van het dijbeen van elk monster in te stellen; en de botmorfometrische parameters, waaronder trabeculaire scheiding (Tb. Sp), trabeculair aantal (Tb. N), trabeculaire dikte (Tb. Th), botmineraalgehalte (BMC), weefselmineraaldichtheid (TMD) en weefselmineraalgehalte (TMC ) werden verkregen door de ROI te analyseren.

2.6. Serum en urine biochemische test.

De activiteiten van serum cathepsine K, TRAP, SOD en GSH, evenals de inhoud van serum PTH, calcitonine, ERR, MDA, BGP en urine DPD, werden bepaald door overeenkomstige reagenskits te gebruiken volgens de instructies van de fabrikant, en de het niveau van alkalische fosfatase (ALP) en de inhoud van serum- en urinecalcium (Ca) en fosfor (P) werden geschat met behulp van een automatische machine (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, VS).

2.7. Western Blot-analyse.

Osteoclasten werden geïnduceerd met behulp van RAW 264.7-cellen waaraan macrofaagkoloniestimulerende factor (MCSF) en RANKL waren toegevoegd. In het kort werden 1 × 107 RAW 264,7-cellen gekweekt in een 6-well-plaat in aanwezigheid van 30 ng/mL MCSF en 25 ng/mL RANKL. Na 6 dagen inductie werden de gerijpte osteoclastcellen geïdentificeerd met behulp van de TRAP-gekleurde methode met de overeenkomstige kit, vervolgens behandeld met CDP (0.1, 0.01 en 0.001 mg/ml , respectievelijk) gedurende 24 uur; vervolgens werden de cellen gelyseerd met een lysisbuffer die 0,5 mmol fenylmethylsulfonylfluoride, protease en fosfataseremmers bevatte. Het lysaat werd vervolgens gescheiden met behulp van 10% SDS-PAGE en overgebracht naar een PVDF-membraan, dat werd onderzocht met AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos en -actine (1: 400) na 2 uur blokkeren met 5 procent magere melk. Dezelfde membranen werden gestript en opnieuw onderzocht met respectievelijk de bovengenoemde 9 overeenkomstige antilichamen, en werden vervolgens aan het einde gedetecteerd door de Image Lab-software. De experimenten werden drie keer herhaald.

2.8. Statistische analyse.

Alle gegevens verkregen uit in vivo en in vitro experimenten, beschreven als de gemiddelde ± SD, werden geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA gevolgd door Dunnett's test (SPSS 22.0 software, SPSS, VS); p < 0="" 05="" was="" statistisch="">

Resultaten

3.1. Chemische samenstelling van Cistanche Deserticola P.

Door gebruik te maken van de HPLC-methode, achtfenylethanoïde glycosideverbindingen werden in deze fractie gevonden, zoals figuur 1 laat zien. Door gebruik te maken van standaardreferenties en een externe standaardmethode werden de verbindingen en hun inhoud als volgt geïdentificeerd en gekwantificeerd: (1) acteoside F (3,6 procent), (2) echinacoside (8,8 procent), (3) cistanoside A (5.{ {9}} procent), (4) acteoside (13,3 procent), (5) isoacteoside (3,3 procent), (6) acteoside C (3,6 procent), (7) 2′-acetylacteoside (9,9 procent), en (8 ) 6′-acetylacteoside (3,2 procent). De totale inhoud van deze acht componenten werd gekwantificeerd op 50,7 procent.

3.2. Effecten van Cistanche Deserticola P op botmineraaldichtheid en microarchitectuur van trabecula.

De totale botmineraaldichtheid van de ratten in verschillende subgroepen wordt weergegeven in figuur 2. Een afnemende trend in het gehalte aan botmineraaldichtheid werd waargenomen bij ratten van de OVX-modelgroep, die na afloop met bijna 12.0 procent afnam. 12 weken operatie in vergelijking met de ratten van de SHAM-groep (p < 0="" 001).="" alle="" met="" cdp="" behandelde="" ratten="" vertoonden="" een="" significant="" verhoogde="" botmineraaldichtheid="" met="" respectievelijk="" 11,2="" procent,="" 12,{9}}="" procent="" en="" 10,7="" procent="" (p="">< 0="" 01),="" in="" vergelijking="" met="" de="" ratten="" van="" het="" ovx-model="" groep.="" bovendien="" toonden="" micro-ct-reconstructie="" en="" histomorfometrische="" bepaling="" van="" het="" dijbeen,="" in="" overeenstemming="" met="" de="" gegevens="" van="" de="" totale="" botmineraaldichtheid,="" aan="" dat="" de="" ratten="" in="" de="" ovx-groep="" een="" duidelijke="" verslechtering="" van="" de="" trabeculaire="" architectuur="" vertoonden,="" wat="" blijkt="" uit="" het="" opmerkelijk="" verminderde="" aantal="" en="" het="" gebied="" van="" trabecula.="" als="" duidelijk="" verhoogde="" tb.="" sp="" in="" vergelijking="" met="" de="" ratten="" van="" de="" sham-groep.="" behandeling="" met="" cdp="" verhinderde="" de="" door="" ovx="" geïnduceerde="" verslechtering="" van="" de="" trabeculaire="" architectuur;="" zoals="" figuur="" 3="" laat="" zien,="" zijn="" de="" bmc,="" tmc="" en="" tb.="" n-waarden="" waren="" significant="" verhoogd="" en="" het="" gebied="" van="" tb.="" sp="" was="" opmerkelijk="" gedaald,="" terwijl="" de="" waarden="" van="" tmd="" en="" tb.="" het="" leek="" niet="" significant="" beïnvloed="" door="" de="" ovx-operatie="" en="" onze="">

3.3. Effecten van Cistanche Deserticola P op biochemische parameters van urine en serum.

Zoals figuur 4 laat zien, werden significante dalingstrends van het urineniveau van P en serumgehalte van calcitonine bij ratten van de OVX-modelgroep gedetecteerd, die bijna 30 procent en 60 procent minder waren dan de SHAM-ratten (p < 0="" 001="" ),="" respectievelijk,="" terwijl="" er="" geen="" duidelijke="" stijgende="" of="" dalende="" trends="" in="" urinaire="" niveaus="" van="" ca="" en="" serum="" ca="" evenals="" serum="" p="" en="" serum="" pth="" werden="" waargenomen="" tussen="" ovx-="" en="" sham-groepen.="" behandeling="" met="" cdp="" verhinderde="" significant="" het="" verlies="" van="" het="" serum="" p="" en="" ca="" bij="" ovx-ratten,="" wat="" blijkt="" uit="" de="" niveaus="" van="" serum="" p="" en="" ca="" die="" met="" name="" omhoog="" gereguleerd="" waren="" (p="">< 0="" 05)="" in="" vergelijking="" met="" de="" ratten="" van="" de="" ovx-modelgroep.="" bovendien="" werden="" verhoogde="" maar="" niet-statistisch="" significante="" trends="" van="" calcitonine="" waargenomen="" in="" zowel="" de="" lage="" als="" de="" hoge="" doseringsgroepen="" van="" cdp="" in="" vergelijking="" met="" de="">

3.4. Effecten van Cistanche Deserticola P op botvorming en botresorptiemarkers.

De gunstige effecten van CDP op de botvormingsindex, evenals de remmingsinvloeden op botresorptiemarkers, werden beschreven in figuur 5. Wat de botvormingsmarkers betreft, werden de serum-BGP-spiegels bijna niet beïnvloed door de ovariëctomiechirurgie, zoals blijkt uit niet- significante veranderingen waargenomen in alle behandelde groepen, terwijl statistisch significante verbeteringen van serum ALP werden verkregen in zowel lage (60 mg/kg) als matige (120 mg/kg) doseringen van CDP-interventiegroepen wanneer vergeleken met de ratten van de SHAM-groep (p < 0="" 01).="" wat="" de="" botresorptie-index="" betreft,="" waren="" de="" niveaus="" van="" serum="" cathepsine="" k="" en="" dpd,="" evenals="" trap="" bij="" ratten="" van="" de="" ovx-modelgroep,="" significant="" verhoogd="" met="" respectievelijk="" ongeveer="" 75,0="" procent,="" 41,4="" procent="" en="" 21,0="" procent="" in="" vergelijking="" met="" de="" sham-ratten="" ,="" en="" bij="" behandeling="" met="" cdp,="" vooral="" de="" lage="" dosering="" van="" 60="" mg/kg,="" werden="" de="" eigenschappen="" van="" cathepsine="" k="" en="" dpd="" evenals="" trap="" in="" de="" ovx-modelgroep="" met="" name="" geremd="" met="" respectievelijk="" 67,3="" procent,="" 41,4="" procent="" en="" 25,9="" procent,="" aangezien="" vergeleken="" met="" de="" ratten="" in="" de="">

3.5. Effecten van Cistanche Deserticola P op de vagina en baarmoeder, evenals op het hele lichaamsgewicht.

Niet-significante verschillen in het aanvankelijke totale lichaamsgewicht van ratten werden vóór behandeling waargenomen in zes groepen (Figuur 6). De operatie waarbij de eierstokken waren verwijderd leidde echter tot een significante toename van het uiteindelijke lichaamsgewicht van ratten in de OVX-modelgroep, namelijk bijna 36,0 procent, terwijl het natte gewicht van de baarmoeder en de vagina drastisch was afgenomen met bijna 9{{4 }}.0 procent en 60,0 procent, respectievelijk, in vergelijking met de SHAM-ratten (p < 0="" 001).="" hoewel="" de="" inhoud="" van="" err="" geen="" significant="" verschil="" vertoonde="" tussen="" ovx-="" en="" sham-groepen,="" verhoogden="" alle="" behandelingsgroepen,="" inclusief="" cdp="" en="" ev,="" het="" niveau="" van="" err="" aanzienlijk.="" bovendien="" werden,="" wanneer="" ze="" werden="" behandeld="" met="" ev,="" het="" bovenvermelde="" totale="" lichaamsgewicht,="" evenals="" het="" verlies="" van="" vagina-="" en="" baarmoedergewicht="" van="" ovx-ratten,="" gedeeltelijk="" omgekeerd="" (p="">< 0="" 001)="" ​​maar="" niet="" beïnvloed="" door="">

3.6. Effecten van Cistanche DeserticolaP op de serumspiegels van MDA, SOD en GSH.

Er was geen statistisch significant verschil in de eigenschappen van serum SOD en GSH tussen de SHAM- en OVX-modelgroepen; zoals figuur 7 beschrijft, kan een toenemende trend in GSH worden waargenomen tussen de bovengenoemde twee groepen. Bovendien was het niveau van serum MDA sterk verhoogd met bijna 50 procent in de ratten van de OVX-modelgroep in vergelijking met de SHAM-ratten. De activiteit van SOD werd niet beïnvloed door CDP-behandeling, terwijl de eigenschap van GSH significant werd verbeterd door CDP-interventie, en CDP verminderde met name het MDA-niveau met 33,9 procent en 42,4 procent bij de doses van respectievelijk 60 en 240 mg/kg ( p < 0="">

3.7. Effecten van Cistanche deserticola P op eiwitexpressieniveaus.

Onze gegevens, weergegeven in Figuur 8, suggereerden dat CDP-behandeling de eiwitniveaus van TRAF6, RANK en RANKL significant verlaagde in vergelijking met de controle. De stroomafwaartse signaalroutes, waaronder NF-KB, werden onderdrukt en PI3K / AKT werd gestimuleerd door CDP-interventie, wat blijkt uit de expressie van NF-KB-p65-downregulatie, terwijl PI3K-p85 en AKT1 werden opgereguleerd. Dientengevolge was de expressie van NFAT2 significant verlaagd en nam c-Fos toe na behandeling met CDP in een concentratie van 0.001-0,1 mg/ml. Een gesuggereerd mechanisme wordt beschreven in figuur 9, waar CDP de niveaus van RANKL en RANK neerwaarts reguleerde, wat leidde tot de vermindering van de bindingshoeveelheden van dit ligand met zijn receptor, en de verbinding van RANKL met RANK verder werd verminderd door de neerwaartse regulatie van TRAF6, gevolgd door de onderdrukking van de stroomafwaartse routes, waaronder de NF-KB-route, terwijl de PI3K/AKT-signaalroute werd gestimuleerd, wat uiteindelijk leidde tot de afname van NFAT2-expressie en verhoging van het c-Fos-niveau.

4. Discussie

Fenylethaanglycosiden zijn van nature voorkomende in water oplosbare componenten die veel voorkomen in het medicinale plantenrijk [11]. Tot dusver hadden de verbindingen van fenylethanoïde glycosiden steeds meer onderzoekers aangetrokken vanwege hun duidelijke rol bij het behandelen van verschillende menselijke kwalen en afwijkingen [13]. Aantallen antiosteoporotische bioactieve fracties en verbindingen, waaronder polyfenol en fenylethanoïde glycosiden, werden geïdentificeerd en geïsoleerd uit tientallen natuurlijke geneeskrachtige kruiden [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola staat bekend als "ginseng van de woestijn", wat het veiligheidsprofiel van deze eetbare TCM impliceerde [18, 19]. Als algemeen tonisch kruid en natuurlijk gezondheidsvoedsel dat al lang in Aziatische landen wordt gebruikt, vertoonde C. deserticola een gunstige functie voor de verbetering van de niersterkte. Er werd gevonden dat TCM, traditioneel gebruikt om nieressentie te stimuleren en te behouden, gewoonlijk werd gebruikt om osteoporose te behandelen, zowel in vitro als in vivo gepubliceerde gegevens hadden de antiosteoporotische activiteit van C. deserticola [20-23] en fenylethanoïde glycosidebestanddelen, waaronder echinacoside en acteoside zijn de belangrijkste bioactieve componenten die in deze eetbare medicinale plant voorkomen; dit alles suggereerde dat niet alleen echinacoside en acteoside zelf, maar ook andere fenylethanoïde glycosidecomponenten in C. deserticola werden beschouwd als verantwoordelijk voor de antiosteoporotische eigenschap van dit kruid. In onze huidige studie werd een gunstige macroporeuze veiligheidshars gebruikt om de fenylethanoïde glycosidefractie van C. deserticola te isoleren en te verrijken, en door gebruik te maken van de HPLC-methode, acht belangrijke fenylethanoïde glycosidecomponenten, namelijk acteoside F, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, acteoside C, 2′-acetylacteoside en 6′-acetylacteoside werden gevonden in de geïsoleerde fenylethanoïde glycosidefractie en de inhoud was 3,6 procent, 8,8 procent, 5,0 procent, 13,3 procent, 3,3 procent, 3,6 procent, 9,9 procent, en 3,2 procent, respectievelijk. Van echinacoside, een van de belangrijkste activiteitsverbindingen die zijn geregistreerd in C. deserticola [14], is bewezen dat het antiosteoporotische activiteit bezit; de dosering van 270 mg/kg was echter zo hoog dat de verdere klinische toepassing ervan werd beperkt [24]. In de huidige experimenten werd de totale fenylethanoïde glycosidefractie met een lagere dosering van 60-240 mg/kg lichaamsgewicht/- dag gebruikt op OVX-ratten, en de inhoud van geïdentificeerde bestanddelen was in deze fractie bijna 50 procent zuiver door gebruik te maken van de HPLC-methode.

Het was algemeen bekend dat OVX osteoporose kan veroorzaken, en men geloofde dat een OVX-rat een klassiek en geschikt model was om postmenopauzale osteoporose bij de mens te simuleren. Tegelijkertijd werd een significante afname van de botmineraaldichtheid, de trabeculaire botmicroarchitectuur, het natte gewicht van de baarmoeder en de vagina en het oestrogeengehalte waargenomen, evenals de duidelijke verbetering van de botresorptie en het lichaamsgewicht na ovariëctomiechirurgie, waarvan in deels door oestrogeenverlies [25]. Onze gegevens hebben tot nu toe duidelijk aangetoond dat OVX inderdaad postmenopauzale osteoporose induceerde en altijd gepaard gaat met de scherpe daling van de botkwaliteit, de microarchitectuur van het bot en het natte gewicht van de baarmoeder en de vagina. Aangezien EV een algemeen hormoonvervangend middel is dat in de klinische praktijk is gebruikt, werd het gebruikt als een positieve controle in ons in vivo-experiment, en het toegenomen lichaamsgewicht en de atrofie-uterusgewichten, evenals de verslechterde botmineraaldichtheid en trabeculaire botmicroarchitectuur , werden naar verwachting teruggedraaid door EV-suppletie. In tegenstelling tot de positieve controle werden de verminderde vagina- en baarmoedergewichten, evenals het gewonnen hele lichaamsgewicht van ratten in de OVX-modelgroep, niet beïnvloed door CDP-behandeling, wat impliceerde dat CDP de botvorming zou kunnen verbeteren zonder de bijwerkingen te veroorzaken op het lichaam en de organische weefsels van de baarmoeder. Hoewel de ERR-niveaus aanzienlijk werden opgereguleerd door CDP-behandeling, was het net als een fyto-oestrogeeneffect dat er geen bijwerkingen op de organische weefsels van de baarmoeder en de vagina werden waargenomen. Bovendien versterkte de behandeling van CDP de kwaliteit van het bot significant bij OVX-ratten die waren verslechterd door ovariëctomiechirurgie.

Bovendien werden de niveaus van P en Ca in urine en serum van OVX-ratten ook gebruikt om het antiosteoporotische effect weer te geven, en de concentraties van Ca en anorganisch P waren meestal afhankelijk van de niveaus van calcitonine en PTH [26]. In de huidige studie werden, hoewel er geen significante dalende of stijgende trends in de urinaire excretieniveaus van Ca, serum P, serum Ca en PTH bij ratten van de OVX-modelgroep verkregen, de significante urinaire niveaus van P en calcitonine (p < {="" {1}})="" werden="" waargenomen.="" in="" overeenstemming="" met="" de="" gepubliceerde="" gegevens="" dat="" oestrogeendeficiëntie="" veroorzaakt="" door="" ovariëctomie-chirurgie="" altijd="" leidde="" tot="" een="" verlaagd="" calcitoninegehalte="" in="" het="" bloed,="" leidde="" dit="" verlaagde="" serumcalcitonine="" uiteindelijk="" tot="" een="" verhoogd="" pth-gehalte,="" waarbij="" werd="" aangenomen="" dat="" ca="" de="" belangrijkste="" regulator="" van="" pth-secretie="" was.="" omdat="" de="" concentratie="" van="" pth="" geen="" significant="" verschil="" vertoonde="" tussen="" de="" ovx-="" en="" sham-groepen="" in="" de="" huidige="" studie,="" vertoonde="" het="" niveau="" van="" ca="" in="" zowel="" serum="" als="" urine="" ook="" geen="" duidelijke="" veranderingen="" tussen="" de="" bovengenoemde="" twee="" groepen.="" er="" werd="" echter="" een="" significant="" afgenomen="" tendens="" op="" het="" niveau="" van="" calcitonine="" tussen="" de="" ovx-="" en="" sham-groepen="" verkregen,="" en="" bijgevolg="" was="" het="" p-gehalte="" in="" de="" urine="" van="" ovx="" sterk="" verlaagd.="" we="" geloofden="" dat="" de="" bovenstaande="" gegevens="" het="" tegenstrijdige="" fenomeen="" zouden="" kunnen="" verklaren="" waarom="" de="" uitscheiding="" van="" ca2="" in="" de="" urine="" bij="" ovx-ratten="" geen="" duidelijke="" verandering="" vertoonde="" in="" vergelijking="" met="" sham-ratten,="" en="" dit="" fenomeen="" kan="" ook="" verband="" houden="" met="" de="" verhoogde="" snelheid="" van="" botomzetting="" [27]="" .="" na="" behandeling="" met="" cdp="" waren="" de="" niveaus="" van="" p="" en="" ca="" in="" serum="" opmerkelijk="" opgereguleerd,="" en="" het="" gehalte="" aan="" p="" in="" urine="" werd="" neerwaarts="" gereguleerd="" bij="" ovx-ratten,="" wat="" erop="" wees="" dat="" cdp="" niet="" alleen="" de="" uitscheiding="" van="" botmineraalelementen="" kon="" voorkomen,="" maar="" ook="" het="" serumgehalte="" van="" die="" ratten="" kon="" verhogen.="" elementen,="" waardoor="" botverlies="" indirect="" wordt="">

Bovendien werden de botvormings- en resorptiemarkers, evenals de antioxidante enzymen waaronder SOD en GSH, ook gebruikt om de onderliggende antiosteoporotische mechanismen van CDP te verklaren. Net als bij de gepubliceerde gegevens, vertoonde het ALP-gehalte bij ratten van de OVX-modelgroep een niet-statistisch significante stijgende trend die wijst op een versnelde snelheid van botturnover bij postmenopauzale osteoporose [10]. Na behandeling met het CDP (60, 120 en 240 mg/kg/dag) was de eigenschap van ALP echter aanzienlijk verbeterd. Het was algemeen bekend dat OVX een scherpe daling van de oestrogeenspiegels veroorzaakte, wat gewoonlijk leidde tot een overschrijding van de botresorptie en oxidatieve stress [28], wat blijkt uit de spiegels van TRAP, cathepsine K en DPD, evenals MDA die met name verhoogd waren bij ratten van de OVX-modelgroep. Die verslechteringen werden echter gedeeltelijk verbeterd door CDP-interventie. Bovendien toonde OVX-ratbehandeling met CDP (60 en 240 mg/kg) een significante toename van de activiteit van GSH (p < 0="" 05).="" de="" bovenstaande="" resultaten="" impliceerden="" dat="" cdp="" een="" therapeutisch="" effect="" vertoonde="" op="" door="" ovx="" geïnduceerde="" osteoporose="" en="" deze="" effecten="" waren="" zowel="" door="" het="" versterken="" van="" botvorming="" en="" het="" onderdrukken="" van="" botresorptie="" als="" door="" het="" verbeteren="" van="" het="">

Activering van RANK door zijn ligand RANKL stimuleerde de expressie van NFAT2 en c-Fos via PI3K/AKT- en NF-KB-signalering [29]. NF-KB bleek essentieel voor osteoclastogenese, aangezien de verstoring van NF-KB zou kunnen leiden tot een verminderde osteoclastdifferentiatie met een osteoporotisch fenotype, en NF-KB verhoogde c-Fos- en neerwaartse NFAT2-expressies tijdens RANKL/RANK/TRAF-geïnduceerde osteoclastogenese. Om de gunstige invloed van CDP op NFAT2 en c-Fos-gemedieerde osteoclastogenese te schatten, werden de expressieniveaus van RANKL en RANK geanalyseerd. Naar verwachting remde CDP NFAT2 significant en stimuleerde het c-Fos-niveaus door de expressies van RANKL en RANK neerwaarts te reguleren. Ondertussen had RANK zelf geen intrinsieke kinase-eigenschap, tenzij TRAF6 erbij kwam om de stroomafwaartse signalering te activeren [3]. CDP reguleerde ook de expressie van TRAF6, wat ertoe leidde dat de bindingshoeveelheden van RANKL en RANK aanzienlijk werden verminderd. Een verondersteld antiosteoporotisch mechanisme van CDP op OVX-ratten dekte de bovenstaande signaalroutes en regulatoren werden beschreven in Figuur 9. Kort gezegd, CDP verlaagde de TRAF6-, RANKL- en RANK-niveaus, waardoor de stroomafwaartse signaalroutes, waaronder PI3K/AKT en NF-KB, werden onderdrukt. worden getriggerd door RANKL/RANK, en verminderden uiteindelijk de expressies en activiteiten van de belangrijkste osteoclastogene eiwitten NFAT2 en c-Fos. Daarom impliceerden meerdere aanwijzingen van gegevens het gunstige effect van CDP op het botmetabolisme van OVX-ratten, voornamelijk via RANKL/RANK/TRAF6-gemedieerde PI3K/AKT- en NF-KB-routes.

5. Conclusie

Samenvattend, de totale fenylethanoïde glycosiden, geïsoleerd uit C. deserticola, vertoonden significante gunstige effecten op postmenopauzale osteoporose van OVX-ratten, en het therapeutische potentieel bij het onderdrukken van botverlies was voornamelijk door het stimuleren van botvorming en het remmen van botresorptie en het verbeteren van de bot-antioxidant systeem; de mechanismen kunnen verband houden met RANKL/RANK/TRAF6-geïnduceerde NF-KB-activering en PI3K/AKT-inactivatie, evenals c-Fos-stimulatie en NFAT2-suppressie, en ten slotte werd de differentiatie van osteoclast geremd.

Afkortingen

AKT: Eiwitkinase B

ALP: Alkalische fosfatase

BGP: Bot GLA-eiwit

BMC: botmineraalgehalte

CDP: Fenylethanoïde glycoside fractie van C. deserticola

CK: Cathepsine K

CT: calcitonine

DPD: Deoxypyridinoline

ERR: Oestrogeen-gerelateerde receptor alfa

EV: Estradiolvaleraat

GSH: Glutathion l-PTH: intact parathormoon

MCSF: macrofaag koloniestimulerende factor

MDA: Malondialdehyde

NFAT2: Nucleaire factor van geactiveerde T-cellen c2

NF-KB: Nucleaire factor-kappa B

OPG: osteoprotegerine

OVX: Ovariëctomie

PhG's: fenylethanoïde glycosiden

PI3K: Fosfoinositide 3-kinase

RANG: Receptoractivator van nucleaire factor-kappa B

RANKL: Receptoractivator van nucleaire factor-kappa

B-ligand ROI: interessegebied

SOD: Superoxide dismutase

tb. N: Trabeculair getal

Tb.Sp: Trabeculaire scheiding

Tb.Th: Trabeculaire dikte

TCM: Traditionele Chinese geneeskunde

TMC: Weefselmineraalgehalte

TMD: Weefselmineraaldichtheid

TNF: Tumornecrosefactor

TRAF6: Tumornecrosefactor-receptor-geassocieerde factor 6

TRAP: Tartraat-resistente zure fosfatase.

Beschikbaarheid van data

De gegevens die worden gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn op verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

Belangenverstrengeling

De auteurs hadden geen belangenconflict.

Bijdragen van auteurs

XM ontwierp en begeleidde de experimenten; SD en LY voerden de meeste experimenten uit en stelden het manuscript op; BZ en JL voerden de Western-blot-analyse uit en namen deel aan dierproeven; YD analyseerde de gegevens; QT en PY hebben het manuscript herzien. Alle auteurs hebben het manuscript beoordeeld. Lingling Yang en Shuqin Ding droegen in gelijke mate bij aan het manuscript.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), de National Natural Science Foundation of China (nr. 81560684), het Key Research and Development Program van Ningxia (2018BHF2001), de Ningxia Key Research en Invention Program of Science and Technology Cooperation of the East and the West (nrs. 2017BY084 en 2017BY079), en de West Light Foundation of the Chinese Academy of Sciences-Young Scientists of West 2017.

Referenties

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane en BL Riggs, "Perspectief. Hoeveel vrouwen hebben osteoporose?" Journal of Bone and Mineral Research, vol. 7, nee. 9, blz. 1005-1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham en SL Kates, "De 1-jaarssterfte van patiënten behandeld in een heupfractuurprogramma voor ouderen," Geriatric Orthopaedic Surgery & Rehabilitation, vol. 1, nr. 1, blz. 6-14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew en EL Yong, "TRAF6 bemiddelt onderdrukking van osteoclastogenese en preventie van door ovariëctomie geïnduceerd botverlies door een nieuwe prenylflavonoïde," Journal of Bone and Mineral Research, vol. 32, nee. 4, blz. 846–860, 2017.

[4] JH Kim en N. Kim, "Regulering van NFATc1 bij differentiatie van osteoclasten," Journal of Bone Metabolism, vol. 21, nee. 4, blz. 233-241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu et al., "Antiosteoporotische activiteit en bestanddelen van Podocarpium podocarpus," Phytomedicine, vol. 22, nee. 1, blz. 94-102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, et al., "Protocatechuïnezuur vermindert trabeculair botverlies bij muizen die ovariëctomie hebben ondergaan," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikel-ID 7280342, 11 pagina's, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, et al., "Rutine geïsoleerd uit Chrozophora tinctoria verbetert botcelproliferatie en ossificatiemarkers," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikel-ID 5106469, 10 pagina's, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon en T. Tong-un, "Morindacitrifolia L.-bladextract beschermt tegen cerebrale ischemie en osteoporose in een in vivo experimenteel model van de menopauze," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, artikel-ID 1039364, 13 pagina's, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura en W. Thukham-mee, "Antiosteoporotisch effect van een gecombineerd extract van Morus alba en Polygonum odoratum," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2014, Artikel ID 579305, 9 pagina's, 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao en X. Ma, "Syringin voorkomt botverlies bij muizen waarbij de eierstokken zijn verwijderd via TRAF6-gemedieerde remming van NF-KB en stimulatie van PI3K/AKT ," Phytomedicine, vol. 42, blz. 43-50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin en SJ Wang, "Echinacoside, een actief bestanddeel van Herba Cistanche, onderdrukt epileptiforme activiteit in hippocampale CA3-piramidale neuronen", The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, vol. 22, nee. 3, blz. 249-255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao en X. Ma, "Therapeutisch effect van cistanoside A op het botmetabolisme van ovariëctomie muizen," Molecules, vol. 22, nee. 2, blz. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan en MI Georgiev, "Verbascoside-een overzicht van het voorkomen, (bio) synthese en farmacologische betekenis," Biotechnology Advances, vol. 32, nee. 6, blz. 1065-1076, 2014.

[14] Redactiecomité van Chinese Farmacopee, Farmacopee van de Volksrepubliek China, China Medical Science and Technology Press, Beijing, China, 10e editie, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li et al., "Effecten van een traditioneel Chinees kruidenpreparaat op osteoblasten en osteoclasten," Maturitas, vol. 61, nee. 4, blz. 334-339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong en Q. Zhao, "Cynomorium songaricum voorkomt botresorptie bij ratten waarvan de eierstokken zijn verwijderd door middel van RANKL/RANK/TRAF6-gemedieerde onderdrukking van PI3K/AKT en NF-KB-routes," Life Sciences, vol. 209, blz. 140-148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang, et al., "Kaempferitrin voorkomt botverlies bij ratten waarvan de eierstokken zijn verwijderd", Phytomedicine, vol. 22, nee. 13, blz. 1159-1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang en YW Cheng, "Veiligheidsbeoordeling van het Cistanche tubulosa gezondheidsvoedingsproduct Memoregain®: genotoxiciteit en 28-dag toxiciteitstest bij herhaalde toediening," Voedsel- en chemische toxicologie , vol. 118, blz. 581- 588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng en F. Chen, "Een systematisch onderzoek naar de antioxidantactiviteit van 30 Chinese geneeskrachtige planten met behulp van de ijzer-reducerende antioxidantkrachttest," Food Chemistry, vol. 97, nee. 4, blz. 705-711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu, et al., "Cistanche deserticola polysaccharide verzwakt osteoclastogenese en botresorptie door remming van RANKL-signalering en productie van reactieve zuurstofsoorten," Journal of Cellular Physiology, vol. 233, nee. 12, blz. 9674-9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang en W. Liang, "Cistanches Herba waterig extract dat serum BGP en TRAP en beenmerg Smad1-mRNA, Smad5-mRNA, TGF- 1-mRNA en TIEG1 beïnvloedt mRNA-expressieniveaus bij osteoporoseziekte," Molecular Biology Reports, vol. 40, nee. 2, blz. 757-763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su et al., "Cistanche deserticola-extract verhoogt de botvorming in osteoblasten", Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol. 64, nee. 6, blz. 897-907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong en Z. Huang, "Effect van waterig extract van Cistanches Herba op botverlies bij ovariëctomie bij ratten", International Journal of Molecular Sciences, vol. 12, nee. 8, blz. 5060-5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang, et al., "Antiosteoporotische activiteit van echinacoside bij ratten waarvan de eierstokken zijn verwijderd", Phytomedicine, vol. 20, nee. 6, blz. 549-557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian en LL Xu, "Antiosteoporotische activiteit van icariin bij ratten waarvan de eierstokken zijn verwijderd", Phytomedicine, vol. 16, nee. 4, blz. 320-326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed en M. Marzouk, "Mogelijk antiosteoporotisch mechanisme van Cicer arietinum-extract bij ratten waarbij de eierstokken zijn verwijderd", International Journal of Clinical and Experimental Pathology, vol. 8, nee. 4, blz. 3477-3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, "Biochemische markers van botomzetting", Clinica Chimica Acta, vol. 313, nee. 1-2, blz. 95-105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy, et al., "Ovariëctomie induceert oxidatieve stress en schaadt het bot-antioxidantsysteem bij volwassen ratten," Clinica Chimica Acta, vol. 360, nee. 1-2, blz. 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet en DL Lacey, "Osteoclast differentiatie en activering," Nature, vol. 423, nee. 6937, blz. 337-342, 2003.