Biochemische en histopathologische reacties van Biomphalaria Alexandrina op RIPEX (plantengroeiregulator)Ⅱ

3. Resultaten

3.1 RIPEX-toxiciteit

De toxiciteitsresultaten van RIPEX voor Biomphalaria alexandrina na 1 dag gaven aan dat de waarden van LC50 en LC90 respectievelijk 39,9 5 en 73,6 µL/L waren. De subletale concentraties van LC10 en LC20 waren respectievelijk 8 en 16 µL/L (tabel 1 en figuur 1).

3.2 Effect van RIPEX op de markers voor oxidatieve stress

De blootstelling aan RIPEX beïnvloedde de activiteiten van SOD en GST en de niveaus van MDA in de spijsverteringsklier van B. Alexandrina (Tabel 2). Slakken blootgesteld aan RIPEX bij 8 µL/L vertoonden een onbeduidende toename (p=0.6) in de activiteit van SOD in vergelijking met de controleslakken. B. alexandrina-slakken die gedurende 7 dagen werden blootgesteld aan 16 µL/L vertoonden echter een significante vermindering van de SOD-activiteit (p=0.05). De GST-activiteit nam significant toe (p kleiner dan of gelijk aan 0,001) na blootstelling aan beide concentraties. De hoogste toename werd waargenomen bij slakken die gedurende 1 dag werden blootgesteld aan 16 µL/L (39,7 ± 3,2 E/mg) en de hoogste waarde bij een concentratie van 8 µL/L was (33,7 ± 1,7 E/mg) na 7 dagen, vergeleken met de controles op 17,1±3,6 E/mg (na 1 dag) en 22,6±1,3 E/mg (na 7 dagen).

Klik om voordelen voor testosteron te zien

Afhankelijk van tijdsintervallen veroorzaakte blootstelling gedurende 7 dagen een significante toename (p=0.0{{20}}3). De blootstelling aan verschillende concentraties van RIPEX veroorzaakte een significante toename (p kleiner dan of gelijk aan 0,04) in de niveaus van MDA. De concentratie van 8 µL/L verhoogde het MDA-niveau (45,06 ± 4,1) in vergelijking met de controle (16,4 ± 2,1). Afhankelijk van het tijdstip van blootstelling waren de MDA-niveaus 45,06 ± 4,1 en 56,1 ± 0,7 nmol/g bij de concentraties, respectievelijk 8 en 16 µL/L, vergeleken met 13,5 ± 0,7 nmol/g voor de controle (Tabel 2).

3.3 Effect van RIPEX op de activiteit van steroïde hormonen

Blootstelling aan 16 µL/L veroorzaakte een significante toename van de testosteronconcentratie (52,6 ± 2,5 nmol/L) (p=0.002) in vergelijking met controle (34,6 ± 2,3 nmol/L). Terwijl de concentratie van 8 µL/L RIPEX een significante toename (p=0.005) in testosteron veroorzaakte na 3 dagen blootstelling in vergelijking met 16 µL/L. Afhankelijk van de tijdsintervallen is er geen betekenis behalve de significante afname van de testosteronconcentratie die optrad na 7 dagen (19,6 ± 2 nmol/L) blootstelling (p=0 0,003) vergeleken met 3 dagen (47,3 ± 6 nmol/L). Wat betreft oestradiol was er een significante toename (p=0.003) in de hormoonconcentratie na 3 dagen blootstelling aan 16 µl/L (73,6±3,5 pg/ml vergeleken met de controle (43,3 pg/ml) en 7 dagen blootstelling aan 8 µL/L (56,3 ± 1,5 pg/ml vergeleken met de controle (50,3 ± 5,6 pg/ml) (Fig. 2, b).

3.4 Effect van RIPEX op immuunpotentiële enzymen

De blootstelling van B. Alexandrina aan twee concentraties RIPEX veroorzaakte een significante toename van de activiteit van het MPO-enzym (Fig. 3a), afhankelijk van het tijdstip van blootstelling na 3 dagen (p=0.0{ {35}}4) en 7 dagen (p=0.01). Blootstelling aan 8 µL/L RIPEX verhoogde de activiteit van MPO aanzienlijk (55,3 ± 4,8 mU/mg eiwit (p=0.004) vergeleken met 15,4 ± 1,2 mU/mg voor de controle. Terwijl 16 µL/L werd blootgesteld slakken was de activiteit (53,03 ± 2,3 mU/mg eiwit en 73,9 ± 2,8 mU/mg eiwit, p kleiner dan of gelijk aan 0,05). Ook veroorzaakte de concentratie van 16 µL/L een significante toename (p=0 0,05) in de activiteit in vergelijking met 8 µl Beide concentraties (8 en 16 µl/l) verhoogden significant (p kleiner dan of gelijk aan 0,009) de activiteit van ADA in vergelijking met de controle (fig. 3b) te allen tijde punten. De toename van de activiteit bij een concentratie van 16 µL/L. Afhankelijk van de tijdsintervallen registreerde de blootstelling gedurende 7 dagen een significante toename in vergelijking met 1 dag en 3 dagen (p Kleiner dan of gelijk aan 0,05). De waarden van activiteit na 7 dagen waren 27,03 ± 14 en 74,3 ± 1,9 U / mg eiwit

3.5 Differentieel aantal hemocyten

Onderzoek van hemolymfemonsters van B. alexandrina-slakken wees op drie morfologisch verschillende soorten hemocyten; hyalinocyten, ronde kleine en zich verspreidende hemocyten. Hyalinocyten worden gekenmerkt door hun ronde vorm, heldere, dichte celmembraan en grote kern-tot-cytoplasmaverhouding. Het wordt weergegeven door een hoog aantal controles (56,3 ± 0 0,5, 1 dag). Kleine ronde cellen zijn intermediaire cellen met weinig cytoplasmatische korrels en geen pseudopodia. Verspreidende hemocyten hebben verschillende afmetingen, met een kleine kern en grote cytoplasmatische korrels. Het zijn fagocytische cellen omdat ze weinig en zich kort verspreidende pseudopodia kunnen vormen. De blootstelling aan de twee concentraties RIPEX verhoogde het aantal hemocyten en er werd een significante toename waargenomen in de granulocyten van slakken die werden blootgesteld aan 8 µL/L (p=0.02) en 16 µL/L (p{{12 }}.006) gedurende 1, 3 en 7 dagen in vergelijking met de controle. (Tafel 3). De behandeling veroorzaakte enkele morfologische afwijkingen in hemocyten, zoals hyalinocyten met filopodiale verlenging, vervormde granulocyten met vacuolen en uitdijende filopodia (fig. 4).

3.6 Effect van RIPEX op de histopathologie van de spijsverteringsklieren en ovotestis

De spijsverteringsklieren van B. Alexandrina zijn samengesteld uit tubuli en elke tubulus bestaat uit één laag cilindrische epitheelcellen die zijn gedifferentieerd in spijsverterings- en secretoire cellen, die zijn gerangschikt rond een centraal lumen (fig. 5a). De tubuli zijn met elkaar verbonden door bindweefsel. Blootstelling aan RIPEX veroorzaakte enkele veranderingen, zoals degeneratie van het bindweefsel. Slakken blootgesteld aan 8 µL/L vertoonden de aanwezigheid van cellulaire blaasjes, wat wijst op de dood van cellen en verstopping van het lumen. Er werd onverteerd voedsel waargenomen (Fig. 5b-d). Slakken blootgesteld aan 16 µL/L vertoonden degeneratie van de beklede cellen met enkele pathologische tekenen zoals vacuolatie en dilatatie van het lumen. De tubulus raakte beschadigd, vervormd en necrotisch (fig. 5e, f).

Ovotestis van controle B. alexandrina slakken bestaan ​​uit verschillende acini verbonden door bindweefsel. Elke acinus is bekleed met kiemepitheel dat bestaat uit verschillende stadia van spermatogonia en oogonia. Ze differentiëren in primaire, secundaire en een of twee rijpe oöcyten (oogonia). Gerijpte zaadcellen worden gevonden in groepen in de acinus (fig. 6a). De histologische structuur van de ovotestis van blootgestelde slakken veranderde na 7 dagen blootstelling aan RIPEX. Bij slakken die werden blootgesteld aan 8 µL/L, werden een toenemend aantal zaadcellen, necrotische zaadcellen en atrofie waargenomen. Vervorming van mannelijke of vrouwelijke gametocyten en degeneratie van acini waren ook overvloedig. Ook zorgde de blootstelling aan 16 μL / L ervoor dat de acini meer degenereerde en nam de necrose toe (Fig. 6b-e).

4. Discussie

Er wordt veel gebruik gemaakt van PGR's in landbouwpraktijken. Deze stoffen hebben tal van schadelijke effecten op levende organismen. De huidige studie was gericht op het beoordelen van de toxicologische effecten van RIPEX (een organofosforpesticide dat ethefon bevat met 48 procent ethefon als het actieve ingrediënt plus 52 procent inerte ingrediënten). Toxiciteitstesten van RIPEX met B. Alexandrina gaven aan dat de 1-dag LC50- en -LC90-waarden respectievelijk 39,95 en 73,6 µl/L waren.

Deze resultaten werden ondersteund door [54] die de EC50-waarde voor ethefon tegen Daphnia magna-embryo's aantoonde (125 mg/L na 48 uur blootstelling). Dit pesticide lijkt giftiger voor Biomphalaria dan andere formuleringen van organofosforverbindingen zoals chloorpyrifos (LC50 9.6 mg/L; [30] en profenofos (LC50 1.10 mg/L; [10]) .

Er bestaat een homeostase tussen het genereren van vrije zuurstofradicalen en de productie van antioxidantmoleculen onder normale fysiologische omstandigheden [23]. Een onbalans tussen de antioxidant- en oxidantsystemen staat bekend als oxidatieve stress [32]. In zowel eukaryoten als prokaryoten zijn superoxide dismutase (SOD) en glutathione S-transferasen cruciale antioxidante enzymen die mogelijk te veel zuurstof uit vrije radicalen verwijderen en het organisme beschermen tegen oxidatieve schade [34, 38].

Ze nemen ook deel aan de ontgifting van verschillende xenobiotica [8, 15]. De huidige studie onthulde dat blootstelling van B. alexandrina-slakken aan subletale concentraties van RIPEX 48 procent EC de antioxidantactiviteit van de blootgestelde slakken verstoorde. Acute blootstelling (24 uur) heeft de neiging om de algehele SOD- en GST-activiteiten bij slakken te verminderen, gevolgd door een toename na 3 dagen blootstelling en een scherpe remming na 7 dagen blootstelling.

MDA-niveaus waren significant hoger bij blootgestelde slakken in vergelijking met controles na alle blootstellingsperioden. Deze resultaten suggereren een toestand van oxidatieve stress bij slakken veroorzaakt door blootstelling aan RIPEX. De slakken ervoeren een plotselinge afname van enzymactiviteiten na 1 dag blootstelling en probeerden dit te compenseren door overproductie van enzymen na 3 dagen blootstelling. Op de 7e dag van blootstelling waren slakken echter niet in staat om de overmatige productie van reactieve zuurstofsoorten te overwinnen, zoals blijkt uit de toename van MDA-niveaus (lipideperoxidatie), wat leidde tot een remming van de productie van antioxidant-enzymen. MDA is een van de belangrijkste effecten van lipideperoxidatie en heeft de kracht om de ionenuitwisseling in het celmembraan te verstoren, de ionenpermeabiliteit te wijzigen en de enzymfunctie te beïnvloeden [9].

Het mechanisme van RIPEX 48 procent EC-geïnduceerde oxidatieve stress in Biomphalaria kan verschillen van andere organofosforpesticiden. Het veroorzaakte enzymremming pas na 7 dagen blootstelling. Chloorpyrifos veroorzaakte bijvoorbeeld kort na 1 dag blootstelling een toename van de SOD-activiteit en een afname van de GST-activiteit bij B. Alexandrina [30]. Testosteron en oestradiol spelen een cruciale rol bij de voortplanting van B. alexandrina-slakken [20, 45]. Veranderingen in deze hormonen kunnen worden gebruikt als eindpunt van chemische toxiciteit [14]. RIPEX 48 procent EC veroorzaakte een hormonale verstoring bij B. alexandrina-slakken.

Slakken blootgesteld aan 16 µL/L vertoonden een significante toename van testosteron na 3 dagen blootstelling. RIPEX verlaagde echter de hormoonspiegels bij slakken die werden blootgesteld aan 8 µL/L na 1 en 3 dagen blootstelling. Over oestradiol, het hormoon neigt te stijgen in blootgestelde slakken. De meest opvallende toename werd echter waargenomen bij slakken die werden blootgesteld aan 16 µL/L na 3 dagen blootstelling. RIPEX kan daarom een ​​hormoonontregelende werking hebben op B. alexandrina-slakken. Soortgelijke bevindingen werden ook gerapporteerd door Ibrahim en Hussein [30], die een significante toename van de niveaus van zowel testosteron als oestradiol rapporteerden na blootstelling van B. Alexandrina aan subletale concentraties van chloorpyrifos 48 procent EC. Andere landbouwchemicaliën, zoals het herbicide oxyfluorfen (24 procent EC), verlaagden echter de testosteron- en 17-oestradiolspiegels in B. Alexandrina na twee weken blootstelling [31]. Myeloperoxidase (MPO), dat H2O2 omzet in hypochloorzuur (HOCl), een krachtig antibioticum, wordt vaak beschouwd als de hoeksteen van ROS-gemedieerde cytotoxiciteit, en er is sterk bewijs dat weekdierhemocyten een MPO-activiteit hebben die vergelijkbaar is met die van fagocyten van zoogdieren [22 , 44, 49]. Adenosinedeaminase (ADA) speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem van gewervelde en ongewervelde dieren, waaronder Biomphalaria-slakken [51].

Het tekort is gekoppeld aan gecombineerde immunodeficiëntieziekte [25]. Blootstelling van B. Alexandrina aan 8 en 16 µL/L RIPEX veroorzaakte een significante toename van de activiteiten van MPO- en ADA-enzymen in de spijsverteringsklieren van slakken na 3 en 7 dagen blootstelling. De toename van de enzymactiviteit lijkt afhankelijk van tijd en overleg. De spijsverteringsklieren zijn de primaire plaats voor het metabolisme van chemische verontreinigingen in buikpotigen [46]. De toename van deze enzymen suggereert een immunologische reactie van B. Alexandrina op RIPEX-toxiciteit, aangezien MPO bijvoorbeeld verontreinigende stoffen kan omzetten in vrije radicalen via enkelvoudige elektronenonttrekkingen [41], wat kan resulteren in redoxcyclische gebeurtenissen die oxyradicalen produceren en mogelijk leiden tot lipideperoxidatie [36].

Slakken vertrouwen voornamelijk op celgemedieerde cytotoxiciteit om zich te ontdoen van binnendringende objecten [5, 53]. De best bestudeerde verdedigingscellen in slakken zijn hemocyten. Hemocyten evolueren van kleine, afgeronde, agranulaire cellen naar grote, granulaire, zich verspreidende cellen via tussenliggende fasen [6, 53]. Granulaire hemocyten fagocyteren meestal vreemde stoffen [28]. De blootstelling aan twee concentraties van RIPEX 48 procent EC verhoogde het aantal hemocyten. De hyalinocyten verschenen met vacuolen in monsters die waren verzameld van blootgestelde slakken. Er werd een significante toename waargenomen in granulocyten, wat wijst op een toename van de cellulaire immuunrespons van de slak om de RIPEX-toxiciteit aan te vechten. Ibrahim en Hussein [30] toonden aan dat blootstelling van B. Alexandrina aan chloorpyrifos een negatieve invloed had op de morfologie en het totale aantal hemocyten van blootgestelde slakken.

Bovendien onthulde lichtmicroscopie dat sommige hyalinocyten gekrompen kernen, onvolledige celdeling en vorming van pseudopodia hadden. Deze effecten op het aantal hemocyten en de morfologie van B. Alexandrina hebben een negatieve invloed op de immuniteit van de slakken, aangezien deze organismen grotendeels afhankelijk zijn van hemocyten voor hun bescherming tegen vreemde ontmoetingen. Histopathologisch onderzoek van de spijsverteringsklieren van B. Alexandrina toonde aan dat RIPEX-blootstelling gedurende 7 dagen enkele pathologische veranderingen veroorzaakte, zoals de degeneratie van bindweefsel, cellulaire bulten en de degeneratie van beklede cellen in het lumen. De spijsverteringstubuli raakten beschadigd, vervormd en necrotisch. Histopathologie is een belangrijk eindpunt bij het beoordelen van de pathologische veranderingen bij waterdieren die zijn blootgesteld aan verontreinigingen [33].

De hoge gevoeligheid van de spijsverteringsklieren wordt direct toegeschreven aan zijn rol in homeostase, opname van verontreinigingen, spijsvertering, metabolisme en het ontgiftingsproces [24]. De waargenomen effecten kunnen het gevolg zijn van directe accumulatie van de RIPEX in de spijsverteringskliercellen of indirect via oxidatieve schade veroorzaakt door de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS). Extreme oxidatieve stress is inderdaad in verband gebracht met weefselbeschadiging waarbij een verscheidenheid aan fysiologische processen en omgevingsvariabelen betrokken zijn, waaronder necrotische en apoptotische celdood [19]. Bovendien veranderde blootstelling aan twee verschillende concentraties RIPEX gedurende 7 dagen de histologische structuur van ovotestis met een toename van het aantal necrotische spermacellen, atrofie, vervorming van mannelijke of vrouwelijke gametocyten en degeneratie van de acini. Deze veranderingen zullen waarschijnlijk het voortplantingsvermogen van slakken verminderen en daarmee hun conditie in het watersysteem.

5. Conclusie

Subletale concentraties van RIPEX 48 procent EC hadden een veelzijdig effect op Biomphalaria alexandrina-slakken. Bij slakken verminderde chronische blootstelling aan RIPEX de productie van de antioxidant-enzymen SOD en GST, terwijl de MDA-productie toenam, wat duidt op een toestand van oxidatieve stress. Bovendien had het een hormoonontregelend effect op slakken, zoals blijkt uit een algehele toename van steroïde hormoonspiegels. Het immuunsysteem van de slak lijkt kwetsbaar te zijn voor blootstelling aan RIPEX. Het veroorzaakte een significante toename van de activiteit van MPO- en ADA-enzymen in de spijsverteringsklieren van slakken na 3 en 7 dagen blootstelling, evenals een significante toename van granulocyten in blootgestelde slakkengroepen. Pathologische afwijkingen in de spijsverteringsklieren en ovotestis van blootgestelde slakken waren ook tekenen van histopathologische veranderingen veroorzaakt door blootstelling aan RIPEX. Deze bevindingen tonen aan dat RIPEX de waterfauna schaadt, waaronder B. Alexandrina. Tus, kunnen Biomphalaria-slakken worden gebruikt als bio-indicatoren voor milieuverontreiniging met plantengroeiregulatoren.

Het mechanisme van Cistanche versterkt het testosteron-effect

Van Cistanche is vastgesteld dat het de testosteronniveaus op verschillende manieren verhoogt. Ten eerste bevat het verbindingen die bekend staan ​​als echinacoside en acteoside, waarvan is aangetoond dat ze de productie van luteïniserend hormoon (LH) in de hypofyse verhogen. LH stimuleert de Leydig-cellen in de teelballen om testosteron aan te maken. Cistanche bevat ook polysacchariden en fenylethanoïde glycosiden, waarvan is aangetoond dat ze antioxiderende en ontstekingsremmende eigenschappen hebben. Dit kan helpen oxidatieve stress en ontsteking in de teelballen te verminderen, wat de productie van testosteron kan belemmeren. Bovendien is gebleken dat Cistanche de expressie verhoogt van genen die betrokken zijn bij de synthese van testosteron en de activiteit vermindert van enzymen die testosteron afbreken, zoals {{1} }alfa-reductase. Over het algemeen wordt aangenomen dat de combinatie van deze mechanismen bijdraagt ​​aan de testosteronverhogende effecten van Cistanche.