Biochemische en histopathologische reacties van Biomphalaria Alexandrina op RIPEX (plantengroeiregulator)Ⅰ

Abstract

Achtergrond

Plantengroeiregulatoren worden veel gebruikt in de landbouw om de groei en rijping van planten te bevorderen, maar ze brengen het aquatische ecosysteem in gevaar. De huidige studie beoordeelde het effect van subletale blootstelling aan RIPEX 48 procent EC-concentraties (8 en 16 µL/L) op oxidatieve stressparameters, geslachtshormonen, immuunpotentiële enzymen, differentiële hemocyttellingen en de histopathologie van spijsverteringsklieren en ovotestis in Biomphalaria alexandrina slakken.

Klik om herba te gebruiken voor testosteron

Resultaten

Blootstelling aan RIPEX veroorzaakte een algehele toename van de activiteiten van Superoxide-dismutase en Glutathion-S-Transferase in B. Alexandrina. Extreme blootstelling aan RIPEX remt echter de SOD-activiteit bij slakken. Malondialdehyde-activiteit vertoonde een toename in B. Alexandrina die na alle blootstellingsperioden aan beide concentraties was blootgesteld. RIPEX veroorzaakte ook een significante toename van testosteron bij slakken die werden blootgesteld aan 16 µL/L, maar het verlaagde de hormoonspiegels bij slakken die werden blootgesteld aan 8 µL/L na 7 dagen. Wat oestradiol betreft, was er een significante toename na 3 dagen blootstelling aan 16 µl/L en 7 dagen blootstelling aan 8 µL/L. Blootstelling aan RIPEX verhoogde ook de activiteiten van de enzymen Myeloperoxidase en Adenosinedeaminase in de spijsverteringsklieren van slakken. Het verhoogde het totale aantal hemocyten van blootgestelde slakken, evenals het aantal granulocyten. Slakkenspijsverteringsklieren en ovotestis vertoonden pathologische veranderingen na 7 dagen blootstelling aan RIPEX.

Conclusies

Deze bevindingen suggereren dat RIPEX giftig is voor B. Alexandrina en dat deze slak kan worden gebruikt als bio-indicator voor milieuverontreiniging met plantengroeiregulatoren.

Trefwoorden

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, testosteron, estradiol, myeloperoxidase, adenosinedeaminase, histopathologie

1. Achtergrond

Agrochemische vervuiling van oppervlaktewateren is een groeiend wereldwijd milieuprobleem, vooral in gebieden waar de landbouw zich snel uitbreidt en intensiveert. Verschillende synthetische chemicaliën, zoals pesticiden of kunstmest, worden gebruikt om de kwantiteit en kwaliteit van gewassen aan te passen om aan de behoeften van klanten te voldoen [7, 40]. Plantengroeibevorderaars zijn in veel landen gangbare landbouwchemicaliën [18].

Wanneer deze chemicaliën direct worden ingeademd of geconsumeerd met besmette groenten, schaden ze de menselijke gezondheid [39]. Het organofosforpesticide ethefon (2-chloorethylfosfonzuur) is een ethyleenafgevende synthetische chemische stof die vaak wordt gebruikt als plantengroeiregulator (PGR) om het ontstaan ​​van bloemen, het rijpen van fruit en andere fysiologische reacties te bevorderen. Het is goedgekeurd voor gebruik op een verscheidenheid aan voedsel, diervoeders, non-food, boomkwekerijgewassen en sierplanten die buiten worden gekweekt [3, 50]. Laboratoriumbeoordeling van ethefon-toxiciteit toonde aan dat ethefon morfometrische misvormingen induceerde van de tweede antenne, sensorische borstelharen, staartruggengraat en rostrum van Daphnia magna, wat leidde tot functieverlies en overlijden [54].

Abd-El Azeem [1] registreerde een vermindering van de groeisnelheid, DNA-schade en apoptotische effecten in de spijsverteringskliercellen van de naaktslak Deroceras reticulatum na blootstelling aan ethephon. Veel auteurs keurden de toxiciteit van Ethephon op ratten en vogels goed [2, 17, 55]. Bovendien veroorzaakte blootstelling aan ethefon genotoxiciteit, oxidatieve stress en reproductietoxiciteit bij muizen [16]. Teratogeniteit en disfunctie van het gonadale systeem bij muizen zijn ook in verband gebracht met blootstelling aan ethefon [2, 16]. Van ethefon is ook aangetoond dat het immunotoxisch is, mutagene effecten heeft [26], oxidatieve stress verhoogt en de concentraties desoxyribonucleïnezuur en ribonucleïnezuur verlaagt [4].

Ethefon in waterlichamen kan de waterfauna in gevaar brengen; gegevens over de impact ervan op in het water levende organismen zijn echter schaars. Verschillende aquatische soorten zijn gebruikt om plantengroeihormonen in aquatische systemen te detecteren. Sommige van deze organismen zijn echter moeilijk te manipuleren en te onderhouden in het laboratorium, waardoor ze moeilijker te gebruiken zijn in ecotoxicologische evaluaties [54]. In het water levende weekdieren, waaronder slakken, hebben recentelijk de aandacht gekregen als testorganismen vanwege de noodzaak om ongewervelde modellen te ontwikkelen voor de milieumonitoring van aquatische verontreinigingen [21, 45]. Slakken zijn de meest voorkomende groep weekdieren in aquatische systemen. Slakken vormen een minder uitbuitend alternatief voor hogere gewervelde dieren als bio-indicatoren, omdat ze in een verscheidenheid aan experimenten kunnen worden gebruikt zonder ethische goedkeuring te vragen, en hun aanschaf en onderhoud goedkoop zijn [13].

In dit opzicht is de Biomphalaria alexandrina-slak op grote schaal gebruikt als een indicatororganisme voor zoetwaterverontreiniging met pesticiden [29, 30]. Naast zijn potentieel als bio-indicator, fungeert deze slak als tussengastheer voor de overdracht van Schistosoma mansoni [35]. Daarom kunnen agrochemische concentraties in het milieu de overdracht van schistosomiasis beïnvloeden via directe en indirecte effecten op de dichtheden van tussengastheer en parasiet [27]. Het huidige onderzoek was gericht op het onderzoeken van de impact van subletale blootstelling aan de plantengroeiregulator, RIPEX 48 procent EC (de handelsnaam van ethefon, 2-chloorethylfosfonzuur) op verschillende biochemische, immunologische en histologische aspecten van B. alexandrina slakken als bio-indicatororganisme.

2 methoden

2.1 Testorganisme

Biomphalaria alexandrina-slakken werden verzameld uit Lake Manzalah in El-Matareya, Gouvernement Dakahlia, Egypte (31 graden 11 'N 32 graden 2' E) en bewaard in goed belucht kraanwater bij een constante temperatuur van 20 graden. Ze kregen dagelijks verse slablaadjes. Na onderhoud gedurende 4 weken onder laboratoriumomstandigheden werden gezonde volwassen slakken (10-12 mm in schaaldiameter) gebruikt in de daaropvolgende experimenten.

2.2 Experimenteel materiaal en blootstellingsomstandigheden

De plantengroeiregulator, RIPEX (een oplossingsvorm die 48 procent ethefon [2- chloorethylfosfonzuur (C2H6ClO3P)] en 52 procent inerte ingrediënten bevat) werd gekocht van Chema Industries (New Nubaria city, Behira, Egypte; registratielicentie nr. 1840). Er werd een reeks concentraties bereid. Boomreplica's met elk tien slakken werden blootgelegd. Na 1-dag van blootstelling werden dode slakken geteld en verwijderd en werden LC50 en LC90 berekend door statistische software voor sociale wetenschappen (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, VS).

2.3 Experimenteel ontwerp

Er werden twee subletale concentraties gebruikt die LC10 en LC20 vertegenwoordigen (8 en 16 µL/L). 90 slakken werden verdeeld in drie groepen, elke groep met drie replicaten (tien slakken/replicaat): de controlegroep, de 8 µL/L-blootgestelde groep en de 16 µL/L-blootgestelde groep. Met tussenpozen van 1-, 3- en 7-dagen werden biomarkers voor oxidatieve stress en immuunpotentiële enzymen beoordeeld in de spijsverteringsklier. steroïde hormonen werden beoordeeld in Ovotestis. Differentiële hemocytentelling en histologie van de spijsverteringsklieren en ovotestis werden beoordeeld. Voor biochemisch onderzoek werd 0,5 g weefsel (verteringsklieren of ovotestis) van elke groep gehomogeniseerd in 0,5 ml fosfaatbuffer (pH 6,5) met behulp van een glazen homogenisator en gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 10,000×g, 4 graden . De resulterende supernatanten werden gebruikt voor daaropvolgende assays.

2.4 Bepaling van markers voor oxidatieve stress

2.4.1 Superoxidedismutase (SOD, EC 1.15.1.1)

De SOD-activiteit werd bepaald met behulp van de EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kit (Cat. No: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Het weefselhomogenaat met behulp van koude lysisbuffer (50 mM kaliumfosfaat, 0,1 mM EDTA en 0,5 procent Triton X-100) werd gecentrifugeerd bij 12,000g gedurende 5 minuten bij 4 graden en het supernatant werd verzameld voor bepaling van SOD [43]. De activiteit van SOD werd gemeten bij de optische dichtheid (OD) bij 440 nm.

2.4.2 Glutathion-S-transferase (GST, EC 2.5.1.18)

Dit enzym katalyseert de GSH-conjugatie met {{0}}chloor-2,4-dinitrobenzeen (CDNB). Het wordt spectrofotometrisch gemeten bij 340 nm. Het reactiemengsel bevat kaliumfosfaatbuffer 0,1 M, pH 6,5, GSH opgelost in de kaliumfosfaatbuffer (140 mg/100 ml) en CDNB 4 mg/ml in ethylalcohol. Eén eenheid enzymactiviteit wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die de vorming van 1 μmol S-conjugaat per minuut katalyseert [11].

2.4.3 Malondialdehyde (MDA)

Malondialdehyde in hele homogenaten werd bepaald als thiobarbituurzuurreactieve stoffen (TBARS) volgens de standaardmethode van Ohkawa et al. [37]. Het reactiemengsel omvatte 0.1 ml weefselhomogenaat, een gelijk volume natriumdodecylsulfaatoplossing, 0.75 ml azijnzuur, 0.75 ml thiobarbituurzuur, en 0,3 ml gedestilleerd water. Deze componenten werden in een vortex gemengd en gedurende 1 uur in een kokendwaterbad geïncubeerd en daarna afgekoeld tot kamertemperatuur. Tien 0,5 ml gedestilleerd water en 2,5 ml n-butanol werden aan elk buisje toegevoegd en krachtig gemengd met een vortex en vervolgens gedurende 10 minuten geroteerd in een centrifuge bij 2500 x g. Absorptie werd afgelezen bij 532 nm.

2.5 Hormonenbepaling

2.5.1 Testosteron

Testosteron werd bepaald met behulp van een testosteron Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Cat. No: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, VS). Testosteron is het belangrijkste androgeen dat zowel de primaire als de secundaire seksuele ontwikkeling beïnvloedt als geslachtsdrift. 100 µl standaardverdunningsmiddel (assaybuffer 3 of weefselkweekmedia) werd gepipetteerd in de putjes met niet-specifieke binding en de putjes met maximale binding (0 pg/ml standaard). Daarna 100 µL van standaard nr. 1 tot en met nr. 5 in de daarvoor bestemde putjes. Het monster (100 µl) werd in de juiste putjes gepipetteerd en 50 µl testbuffer 3 in de niet-specifieke bindingsputjes. Ook werd 50 µl geel antilichaam toegevoegd aan elk putje, behalve de blanco, totale activiteit en niet-specifieke bindingsputjes. De incubatie van de plaat bij kamertemperatuur op een plaatschudder gedurende 1 uur bij 500 rpm. Daarna werd 50 µl van het blauwe conjugaat aan elk putje toegevoegd, behalve voor totale activiteit en blanco putjes. Nadat de inhoud van de putjes was geleegd, werd gewassen door 3 keer 400 µl wasoplossing aan elk putje toe te voegen. Blauw conjugaat (5 µl) werd aan de putjes met totale activiteit toegevoegd en 200 µl van een oplossing van p-nitrofenylfosfaat werd aan elk putje toegevoegd en gedurende 1 uur bij 37 graden zonder schudden geïncubeerd. Het aflezen van de plaat bij 405 nm werd uitgevoerd na toevoeging van 50 µL stopoplossing aan elk putje [12, 48].

2.5.2 Estradiol

Estradiol werd bepaald met behulp van een estradiol ELIZA-kit (cat. nr.: 501890; Cayman Chemical, Michigan, VS) volgens de protocollen van de fabrikant. Het principe van deze reactie is gebaseerd op het feit dat de concentratie van oestradiolacetylcholinesterase (AChE) tracer constant is, maar de natieve oestradiolconcentratie varieert, daarom is de hoeveelheid oestradiolacetylcholinesterase (AChE) tracer die bindt aan oestradiolantiserum omgekeerd evenredig met de concentratie van natuurlijk oestradiol in de put. 100 µL ELISA-buffer werd toegevoegd aan putjes met niet-specifieke binding en maximale binding. Toevoeging van 50 µL uit buisje #8 aan beide laagste standaardputjes (Standaard 8) en 50 µL uit buisje #7 aan elk van de volgende standaardputjes (Standaard 7). Aan elk putje werd een monster (50 µl) toegevoegd. Oestradiol AChE Tracer (50 µl) werd toegevoegd aan elke totale activiteit en blanco putjes. Daarna werd estradiol-ELISA-antiserum (50 µl) aan elk putje toegevoegd, met uitzondering van totale activiteit, niet-specifieke binding en blanco putjes. Na incubatie met een orbitale schudder (2 uur bij kamertemperatuur) werd de absorptie gemeten bij 414 nm [52].

2.6 Bepaling van immuunpotentiële enzymen

2.6.1 Myeloperoxidase (MPO, EC 1.11.2.2)

Eén eenheid MPO-activiteit wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die het substraat hydrolyseert en taurinechloramine genereert om 1,0 μmol TNB per minuut bij 25 graden te verbruiken. MPO werd bepaald met behulp van een myeloperoxidase colorimetrische activiteitstestkit (Cat. Nr.: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, VS). De absorptie werd gemeten bij 412 nm.

2.6.2 Adenosinedeaminase (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA is een enzym dat de omzetting van adenosine en 2'-deoxyadenosine in inosine en 2'-deoxyinosine katalyseert. ADA werd bepaald volgens de principes van de technische bulletin adenosinedeaminase-activiteitsassaykit (cat.nr.: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland). Eén eenheid adenosinedeaminase is de hoeveelheid enzym die adenosine hydrolyseert om 1,0 μmol inosine per minuut op te leveren bij 37 graden. De reagentia zijn 1×ADA-assaybuffer (41 μL), ADA Converter (2 μL), ADA-ontwikkelaar (2 μL) en ADA-substraat (5 μL).

2.7 Differentieel aantal hemocyten

De hemolymfe werd verzameld van de slak (controle, blootgesteld) volgens Sminia [47]. Na door een Pasteur-pipet op de kop-voet te zijn aangeraakt, werd de slak gedwongen zich diep in zijn schaal terug te trekken en hemolymfe te extruderen, die werd verzameld voor een differentiële hemocytentelling. Hemolymfe werd uitgesmeerd op het microscoopglaasje voor verspreiding. Na fixatie in 99,8 procent methanol gedurende 5 minuten werd het objectglaasje onder een hoek van 45 graden gedraaid om te drogen bij kamertemperatuur en gekleurd met Giemsa-kleurstof gedurende 20 minuten. Er werd bepaald dat de differentiatie van hemocyten evenredig was met het tellen van 100.

2.8 Histologisch onderzoek

Histologische onderzoeken werden uitgevoerd na 7 dagen blootstelling aan 8 en 16 µL/L RIPEX. De spijsverteringsklieren en ovotestis werden ontleed en onmiddellijk gefixeerd in Bouin᾿s-vloeistof. Na 1 dag fixatie werden de monsters gedehydrateerd door een reeks alcoholen en geklaard in xyleen. Er werden paraffinewasblokken gemaakt [42]. Tien sekten. (5-7 μm dikte) werden gesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine (Mayer's H en E). Kleuring werd gevolgd door een goede wasbeurt met leidingwater. Histologische secties werden gefotografeerd met behulp van een foto-geautomatiseerde camera (Optika, Italië).

2.9 Statistische analyse

Gegevens werden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaarddeviatie en geanalyseerd door statistische software van sociale wetenschappen (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, VS). Tweezijdige ANOVA-variantieanalyse werd gebruikt om verschillen te identificeren tussen de controlegroep en de blootgestelde groep, tussen de verschillende concentraties en de tijdstippen van blootstelling. Het significantieniveau werd vastgesteld op p Kleiner dan of gelijk aan 0.05.

Het mechanisme van Cistanche versterkt het testosteron-effect

Van Cistanche is vastgesteld dat het de testosteronniveaus op verschillende manieren verhoogt. Ten eerste bevat het verbindingen die bekend staan ​​als echinacoside en acteoside, waarvan is aangetoond dat ze de productie van luteïniserend hormoon (LH) in de hypofyse verhogen. LH stimuleert de Leydig-cellen in de teelballen om testosteron aan te maken. Cistanche bevat ook polysacchariden en fenylethanoïde glycosiden, waarvan is aangetoond dat ze antioxiderende en ontstekingsremmende eigenschappen hebben. Dit kan helpen oxidatieve stress en ontsteking in de teelballen te verminderen, wat de productie van testosteron kan belemmeren. Bovendien is gebleken dat Cistanche de expressie verhoogt van genen die betrokken zijn bij de synthese van testosteron en de activiteit vermindert van enzymen die testosteron afbreken, zoals {{1} }alfa-reductase. Over het algemeen wordt aangenomen dat de combinatie van deze mechanismen bijdraagt ​​aan de testosteronverhogende effecten van Cistanche.

Hoda H. Abdel-Azeem1*, Azza H. Mohamed1 en Mohamed R. Habib2