CAR-neutrofiel-gemedieerde toediening van tumor-micro-omgeving-responsieve nanomedicijnen voor glioblastoom chemo-immunotherapie

Glioblastoom (GBM) is een van de meest agressieve en dodelijke solide tumoren bij de mens. Hoewel effectieve therapieën, zoals opkomende chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen en chemotherapeutica, zijn ontwikkeld om verschillende soorten kanker te behandelen, wordt hun effectiviteit bij GBM-behandeling grotendeels belemmerd door de bloed-hersenbarrière en de bloed-hersentumorbarrières. Menselijke neutrofielen overschrijden effectief fysiologische barrières en vertonen effectorimmuniteit tegen pathogenen, maar de korte levensduur en weerstand tegen genoombewerking van primaire neutrofielen hebben hun brede toepassing in immunotherapie beperkt. Hier manipuleren we menselijke pluripotente stamcellen genetisch met CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-knock-in om verschillende anti-GBM CAR-constructen tot expressie te brengen met T-specifieke CD3ζ- of neutrofiel-specifieke signaaldomeinen. CAR-neutrofielen met de beste antitumoractiviteit worden geproduceerd om specifiek en niet-invasief op tumor-micro-omgeving reagerende nanomedicijnen af ​​te leveren en vrij te geven om zich op GBM te richten zonder de noodzaak om extra ontstekingen op de tumorplaatsen te veroorzaken. Deze combinatorische chemo-immunotherapie vertoont superieure en specifieke anti-GBM-activiteiten, vermindert de off-target medicijnafgifte en verlengt de levensduur bij vrouwelijke tumordragende muizen. Samen vormt dit biomimetische CAR-neutrofiele medicijnafgiftesysteem een ​​veilig, krachtig en veelzijdig platform voor de behandeling van GBM en mogelijk andere verwoestende ziekten.

Voordelen van cistanche tubulosa-Antitumor

Glioblastoom (GBM) wordt gekenmerkt door een hoog sterftecijfer, een korte levensduur en een slechte prognose met een grote neiging tot recidief1,2. De therapeutische werkzaamheid van zowel chirurgie als chemomedicijnen wordt voornamelijk belemmerd door de fijne hersenstructuur en de fysiologische bloed-hersenbarrière (BBB) ​​of bloed-hersentumorbarrière (BBTB)3–5. Met name de toediening van medicijnen aan het centrale zenuwstelsel (CZS) voor de behandeling van hersentumoren is een grote uitdaging:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

De aangeboren immuniteit en plasticiteit van neutrofielen tegen verschillende vormen van kanker12–16, waaronder GBM, werden minder onderzocht dan hun toepassing als celdragers bij de toediening van medicijnen8–10. Circulerende neutrofielen in het bloed vormen de thuisbasis van de hypoxische tumormicro-omgeving (TME), waar ze heterogene tumor-geassocieerde neutrofielen (TAN's) worden, een essentieel onderdeel van immunosuppressieve TME dat bijdraagt ​​aan de progressie van kanker en therapeutische resistentie12,17. Net als bij macrofagen werden antitumor N1- en pro-tumor N2-fenotypen van TAN's gevonden in de hypoxische TME . Er zijn verschillende therapeutische strategieën ontwikkeld om neutrofielen direct aan te pakken, met een focus op depletie of remming van neutrofielen12,22, wat heeft geleid tot verschillende klinische onderzoeken (bijv. CCR5-remmer Maraviroc in NCT03274804). De directe toepassing van onbehandelde neutrofielen als nanodrager kan dus een extra risico vormen voor kankerpatiënten waarbij drugshandelende neutrofielen binnen TME kunnen worden geherprogrammeerd naar het immunosuppressieve pro-tumor N2-fenotype na hun terugkeer naar tumorlocaties13,23. Bovendien moeten de intrinsieke antitumoractiviteiten van naïeve neutrofielen worden onderzocht en versterkt om een ​​geoptimaliseerde therapeutische werkzaamheid te bereiken bij gebruik als medicijndrager in combinatie met chemotherapeutica.

Voordelen van cistanche tubulosa-versterk het immuunsysteem

Chimere antigeenreceptor (CAR)-modificatie heeft de antitumoractiviteiten van immuun-T- of natural killer-cellen (NK) aanzienlijk verbeterd . Hun werkzaamheid bij solide tumoren is echter nog steeds beperkt, deels vanwege hun relatief lage transport- en tumorpenetratievermogen. De aanwezigheid van fysiologische BBB en BBTB belemmert verder de werkzaamheid van deze opkomende therapieën tegen GBM in de hersenen. We speculeerden dat de combinatie van CAR-techniek en zeer beweeglijke neutrofielen hun anti-tumor N1-fenotype zou kunnen behouden en een uitstekende therapeutische werkzaamheid zou kunnen opleveren bij de behandeling van GBM. Primaire neutrofielen zijn van korte duur en resistent tegen genoombewerking28, waardoor hun toepassing in CAR-gerichte immunotherapie wordt beperkt. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's), die beter toegankelijk zijn voor genbewerking en in staat zijn om massaal te differentiëren in neutrofielen, zouden een onbeperkte bron van hoogwaardige CAR-neutrofielen kunnen bieden voor gerichte immunotherapie onder chemisch gedefinieerde, xeno-vrije omstandigheden29. Neutrofielen fagocyteren ook bij voorkeur microbiële pathogenen met ruwe of lange oppervlakken, zoals S. aureus en E. coli , waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerp van nanodeeltjes bij door neutrofielen gemedieerde medicijnafgifte. Safari et al. rapporteerde onlangs de geprefereerde fagocytose van intraveneus toegediende langwerpige deeltjes, zonder gecompliceerde oppervlaktemodificatie, door circulerende neutrofielen . Een dergelijk eenvoudig en bio-geïnspireerd ontwerp van met medicijnen geladen nanodeeltjes kan de medicijnlading in neutrofielen maximaliseren en therapeutische niveaus van medicijnafgifte op gerichte plaatsen mogelijk maken.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% van de toegediende nanogeneesmiddelen wordt door CAR-neutrofielen aan hersentumoren afgegeven, vergeleken met 1% door vrije nanogeneesmiddelen. Samenvattend is ons biomimetische CAR-neutrofiele medicijnafgiftesysteem een ​​veilig, krachtig en veelzijdig platform voor de behandeling van GBM en andere verwoestende ziekten.

Voordelen van cistanche tubulosa-Antitumor

Resultaten

Screening van neutrofiel-specifieke CAR-structuren op verbeterde antitumoractiviteiten

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, en de meerderheid van de beoogde klonen is heterozygoot (aanvullende figuren 1a – d). CAR-expressie op gemanipuleerde hPSC's werd verder bevestigd door RT-PCR en flowcytometrieanalyse van CLTX-IgG4 (aanvullende figuur 1e – g). Zoals verwacht behielden CAR tot expressie brengende hPSC's hoge expressieniveaus van pluripotente markers, waaronder OCT4, SSEA4 en SOX2 (aanvullende figuur 1f).

Om de novo CAR-neutrofielen te produceren, werden CAR tot expressie brengende hPSC's eerst gedifferentieerd in multipotente hematopoietische en vervolgens myeloïde voorlopercellen met stadiumspecifieke cytokinebehandeling (Fig. 2c). Daaropvolgend gebruik van G-CSF en retinoïnezuuragonist AM580 bevorderde de robuuste productie van neutrofielen36. Vergelijkbaar met hun tegenhangers in perifeer bloed (PB), vertoonden hPSC-afgeleide CLTX-CAR-neutrofielen typische neutrofielmorfologie en oppervlaktemarkers CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b en CD18 (aanvullende figuur 2). Vervolgens bepaalden we de effecten van CAR-expressie op de anti-tumorcytotoxiciteit van hPSC-afgeleide neutrofielen door ze in vitro te kweken met glioblastoma (GBM) U87MG-cellen. Zoals verwacht vertoonden van hPSC afgeleide CLTX-CAR-neutrofielen een verbeterd tumordodend vermogen in vergelijking met PB-neutrofielen (Fig. 2d), consistent met eerdere waarnemingen in CLTX CAR-T-cellen . Van deze verschillende CAR's bemiddelde CAR #1 superieure tumordodende activiteiten in hPSC-neutrofielen. Met name is op ketens gebaseerde CAR #4 het minst effectief bij het teweegbrengen van door neutrofielen gemedieerde tumordoding, wat te wijten kan zijn aan de lagere kopie van ITAM in dan ζ-subeenheid en lagere expressie van -dragende CAR's op het celoppervlak . Neutrofielen geven cytotoxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) en tumornecrosefactor (TNF-) vrij om doelcellen te doden. De productie van ROS en TNF- (Fig. 2e, f) uit verschillende neutrofielen viel goed samen met hun verhoogde cytolyse. Zoals verwacht bleef de productie van ROS en TNF- uit verschillende neutrofielen na co-kweek met normale SVG p12-gliacellen zo laag als die van de negatieve controlegroep (aanvullende figuur 3a, b). Bovendien werd verhoogde antitumorcytotoxiciteit van CAR-neutrofielen alleen waargenomen bij co-incubatie met GBM-cellen, waaronder U87MG, primaire volwassen GBM43 en pediatrische SJ-GBM2-cellen (aanvullende figuur 3c), wat de hoge specificiteit van onze CLTX aantoont. -AUTO. Met name vertoonden CAR-neutrofielen een hoge biocompatibiliteit met normale SVG p12-gliacellen, hPSC's en van hPSC afgeleide cellen (aanvullende figuur 3d), consistent met een eerdere observatie dat geïnactiveerde primaire neutrofielen geen gezonde cellen doden . Gezamenlijk vertoonden van hPSC afgeleide CAR-neutrofielen, met name CD3ζ-dragende CAR-neutrofielen, een verbeterde anti-tumor cytotoxiciteit en produceerden ze in vitro meer ROS en TNF-, wat hun potentieel in gerichte immunotherapie benadrukt.

Afb. 1|Schematische voorstelling van verbeterde werkzaamheid tegen glioblastoom met behulp van combinatorische immunotherapie van CAR-neutrofielen en nanomedicijnen die reageren op de micro-omgeving van de tumor. Menselijke pluripotente stamcellen werden ontwikkeld met CAR's en gedifferentieerd in CAR-neutrofielen die geladen zijn met ruwe silica nanodeeltjes (SiO2 NP's) die op hypoxie gerichte tirapazamine (TPZ) of andere medicijnen bevatten, als een dubbele immunochemotherapie. b Systemisch toegediende CAR-neutrofiel@R-SiO2- TPZ-NP's vallen eerst externe normoxische tumorcellen aan door immunologische synapsen te vormen en tumorcellen te doden via fagocytose. Na apoptose kunnen CAR-neutrofielen vervolgens R-SiO2-TPZ NP's vrijgeven, die worden ingehaald door tumorcellen. Daarna reageren nano-prodrugs op de hypoxische micro-omgeving van de tumor en doden ze effectief tumorcellen. TEOS tetraethylorthosilicaat, BTES bis[3-(triethoxysilyl)propyl]tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.

CAR-neutrofielen onderhielden superieure antitumoractiviteiten onder immunosuppressieve tumormicro-omgevingen

Net als bij macrofagen werden anti-tumor N1- en pro-tumor N2-fenotypen van tumor-geassocieerde neutrofielen gevonden in de micro-omgeving van de immunosuppressieve tumor. Pro-tumor N2-neutrofielen spelen een cruciale rol bij tumorangiogenese, metastase en immunosuppressie, maar het therapeutisch targeten van dit celtype was een uitdaging.

In plaats van een systemische uitputtingsstrategie , evalueerden we hier het potentieel van CAR-engineering bij het in stand houden van het antitumorfenotype van neutrofielen. Van CAR hPSC afkomstige en PB-neutrofielen werden behandeld met hypoxie (3% O2) en TGF, die bijdragen aan de immunosuppressie van de micro-omgeving van de tumor, om hun aanhoudende tumordodende activiteit te beoordelen. Terwijl PB-neutrofielen een significant verminderde cytolyse tegen GBM-cellen vertoonden onder immunosuppressieve omstandigheden, onderhielden CAR-neutrofielen hoge tumordodende activiteiten (aanvullende figuur 4a). Soortgelijke waarnemingen werden ook gedaan bij de TNF-afgifte en ROS-generatie (aanvullende figuur 4b, c) uit PB- of CAR-neutrofielen onder immunosuppressieve en normale omstandigheden. Om het neutrofielenfenotype onder hypoxische en TGF-omstandigheden verder te bevestigen, hebben we de expressie van N1-specifieke iNOS en N2- N2-specifieke arginase op de geïsoleerde neutrofielen gemeten met behulp van flowcytometrie (aanvullende figuur 2). 4d–f). Vergeleken met normoxie verlaagden immunosuppressieve hypoxie en TGF de expressieniveaus van iNOS significant en verhoogde de niveaus van arginase in PB-neutrofielen, terwijl CAR-neutrofielen hoge expressieniveaus van iNOS behielden. Eerdere studies geven aan dat activering van de Syk-Erk-signaleringsroute leidt tot ROS-productie . Daarom hebben we Syk-Erk-activering in ongemodificeerde neutrofielen en CAR-neutrofielen gedetecteerd en vergeleken, en onze resultaten suggereerden een significant hogere activering van de Syk-Erk-route in CAR-neutrofielen onder hypoxie (aanvullende figuur 5a – d), die mogelijk aanhoudt de onveranderde ROS-productie van CAR-neutrofielen onder hypoxie. Alles bij elkaar hielden CAR-neutrofielen een antitumorfenotype in stand en behielden ze hoge antitumoractiviteiten onder omstandigheden in vitro die de micro-omgeving van de tumor nabootsten, wat hun potentieel in gerichte immunotherapie benadrukt.

Afb. 2|Screening van neutrofiel-specifieke chimere antigeenreceptor (CAR)-structuren met verbeterde neutrofiel-gemedieerde antitumoractiviteiten. een schema van verschillende CAR-structuren. b Schematische voorstelling van CAR #1-constructie en gerichte knock-in-strategie op de AAVS1 veilige havenlocus van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's). De verticale pijl geeft de AAVS1 aan die zich op sgRNA richt. Rode en blauwe horizontale pijlen geven primers aan voor het testen van respectievelijk de targetingefficiëntie en homozygotie. HDR: homologe recombinatiereparatie. c Schematische weergave van geoptimaliseerde differentiatie van neutrofielen uit hPSC's onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. d Cytotoxiciteitstesten tegen U87MG-glioblastoomcellen werden uitgevoerd bij verschillende verhoudingen van neutrofielen tot tumordoelwit met behulp van aangegeven neutrofielen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van vijf onafhankelijke biologische replicaten, tweezijdige Student's t-test. Het genereren van reactieve zuurstofspecies (ROS) (e) en ELISA-analyse van TNF-afgifte (f) uit verschillende neutrofielen na co-kweek met U87MG-cellen werden bepaald. n=5 biologisch onafhankelijke monsters. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, tweezijdige Student's t-test. Brongegevens worden geleverd als een brongegevensbestand.

Bereiding en karakterisering van hPSC CAR-neutrofielen geladen met tirapazamine (TPZ)-bevattende SiO2-nanodeeltjes

PB-neutrofielen zijn gebruikt als cellulaire dragers om beeldvormende en therapeutische medicijnen in hersentumoren af ​​te leveren8-10, hoewel gerichte infiltratie van neutrofielen een operatie of door licht geïnduceerde ontsteking vereist en de afgifte van geneesmiddelen buiten het doel een probleem kan zijn11. Om de antitumoractiviteiten van CAR-neutrofielen verder te verbeteren, hebben we silica-nanodeeltjes (SiO2-NP) met een ruw of glad oppervlak bereid om chemotherapeutische of bestralingsmedicijnen in neutrofielen te laden. Transmissie-elektronenmicroscoopbeelden (TEM) toonden aan dat beide SiO2-nanodeeltjes goed verspreid waren en een sferische morfologie vertoonden met een uniforme grootte (figuur 3a, aanvullende figuur 6a). Analyse van de samenstellingsverdeling via scanning TEM (STEM) met energie-gedispergeerde röntgenspectroscopie (EDS) toonde aan dat het zwavel (S) -element gelijkmatig verdeeld was binnen de gehele ruwe SiO2-nanodeeltjes (R-SiO2) (Fig. 3b). Met behulp van stikstof (N2) adsorptie-desorptie-isothermen en overeenkomstige analyse van de poriegrootteverdeling werden de poriegroottes van R- en SSiO2 NP's gemeten als respectievelijk 25 nm en 35 nm (figuur 3c, aanvullende figuur 6b). Gegeven het grote oppervlak en de grote poriegrootte zouden therapeutische geneesmiddelen effectief kunnen worden geladen in zowel R- als S-SiO2 NP's, zoals geïllustreerd door de hypoxie-responsieve pro-drug tirapazamine (TPZ) (figuur 3d, aanvullende figuur 6c) . Na het laden van TPZ werden geen significante veranderingen waargenomen in de spreiding, morfologie en grootte van R-SiO2-TPZ met behulp van TEM en dynamische lichtverstrooiingsanalyse (aanvullende figuur 6d, e). De tetra-sulfidebindingen die in de R-SiO2 NP's zijn opgenomen, zijn gevoelig voor reductieve omgevingen en kunnen snel worden afgebroken door de grote hoeveelheid glutathion (GSH) die in de tumorcellen aanwezig is43. Vervolgens bepaalden we de GSH-responsieve afbreekbaarheid van R-SiO2-TPZ NP's in de aanwezigheid van 10 mM, 1 mM en 10 μM GSH, die hetzelfde waren als de intracellulaire omstandigheden van respectievelijk kankercellen, normale cellen en extracellulaire omgevingen . Na behandeling met 10 mM GSH werd de initiële bolvormige structuur van R-SiO2-TPZ NP's na 24 uur ernstig vernietigd (aanvullende figuur 6f, g). De nanodeeltjes werden na 48 uur volledig gedesintegreerd in klein puin, resulterend in de TPZ-afgifte op een GSH-responsieve manier (Fig. 3e). Het puin van R-SiO2 NP's veroorzaakte in vitro geen significante cytotoxiciteit voor de geteste cellen (aanvullende figuur 6h), hetgeen de relatieve veiligheid van R-SiO2 NP's aangeeft.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Klik hier om de producten van Cistanche Enhance Immunity te bekijken

【Vraag om meer】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats-app: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Vervolgens evalueerden we de haalbaarheid van het gebruik van SiO2-TPZ NP's om therapeutische medicijnen in CAR-neutrofielen te laden als een combinatorische chemo-immunotherapie om een ​​verhoogde therapeutische werkzaamheid te bereiken. Na centrifugatie hebben we de cellulaire opname van SiO2 – TPZ NP's door neutrofielen gemeten met behulp van een fluorescentiemicroscoop en flowcytometrieanalyse (Fig. 3f, g), en een significantere cellulaire opname van R-SiO2 – TPZ NP's gedetecteerd dan S-SiO2– TPZ NP's door neutrofielen. Het cellulaire Si-gehalte in neutrofielen werd gemeten als respectievelijk 11,3 en 19,1 ng Si/ug-eiwit voor gladde en ruwe SiO2 NPs@TPZ (Fig. 3h), door inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS). Gezien hun hoge laadvermogen in neutrofielen werden R-SiO2-TPZ NP's gebruikt voor daaropvolgende experimenten. Vervolgens probeerden we de fysiologische functies van CAR-neutrofielen te testen na het laden van R-SiO2-TPZ NP's. Er werden geen veranderingen waargenomen in de levensvatbaarheid van de cellen (Fig. 3i, Aanvullende Fig. 6i), transwell-migratievermogen (Fig. 3j), chemotaxis en overeenkomstige snelheid (Fig. 3k, l) van CAR-neutrofielen voor of na het laden van R-SiO2 –TPZ NP's, wat hun hoge biocompatibiliteit aantoont. Er werd ook een tijdsafhankelijke ladingsanalyse van nanogeneesmiddelen uitgevoerd en de maximale ladingsinhoud werd 1 uur na cel-NP-incubatie bereikt (aanvullende figuur 7a). Meer dan 95% CAR-neutrofielen werden met succes geladen met R-SiO2-TPZ NP's (aanvullende figuur 7b). Het expressieniveau van CD11b, een neutrofiel oppervlakte-eiwit dat de adhesie- en migratiefunctie bemiddelt bij stimulatie van ontstekingsmoleculen, werd niet veranderd op CAR-neutrofielen met of zonder R-SiO2-TPZ-belasting (aanvullende figuur 7c, d). Superoxide- of reactieve zuurstofsoorten (ROS) komen vrij uit actieve neutrofielen om microben en tumorcellen te doden44. Zoals verwacht was de ROS-productie door CAR-neutrofielen significant toegenomen na behandeling met N-Formylmethionine-leucyl-fenylalanine (fMLP), en er werden geen significante verschillen waargenomen in de ROS-productie door CAR-neutrofielen voor en na het laden van R-SiO2- TPZ (afb. 3m). Alles bij elkaar hebben onze gegevens aangetoond dat met R-SiO2-TPZ geladen CAR-neutrofielen de fysiologische activiteiten van wildtype neutrofielen in stand hielden en actief konden migreren naar ontstekingsstimuli, wat hun potentieel in gerichte chemo-immunotherapie bij kanker benadrukte.

CAR-neutrofielen geladen met R-SiO2-TPZ-nanodeeltjes doden effectief glioblastoomcellen

Vervolgens evalueerden we het effect van R-SiO2-TPZ op het tumordodende vermogen van CAR-neutrofielen. Intieme effector-doelwitinteractie was een voorwaarde voor door neutrofielen gemedieerde cytolyse. Zoals verwacht vormden CAR-neutrofielen@R-SiO2-TPZ binnen 2 uur immuunsynapsen met tumorcellen en vertoonden vergelijkbare effector-doelinteractieaantallen als medicijnvrije CAR-neutrofielen (Fig. 4a, Aanvullende Fig. 8) . Er werden met name geen waarneembare interacties gevonden tussen CAR-neutrofielen@RSiO2-TPZ en niet-kankerachtige somatische cellen (aanvullende figuur 8), wat de specificiteit van CLTX-CAR tegen hersentumoren benadrukt. Bovendien werden R-SiO2-TPZ NP's 12 uur na co-kweek uit neutrofielen in het kweekmedium vrijgegeven (aanvullende figuur 9a, b) en kwamen ze in de resterende tumorcellen terecht (figuur 4a). Vierentwintig uur na co-incubatie van met SiO2 – TPZ NP geladen CAR-neutrofielen met tumorcellen, bevatte tot 95% van de tumorcellen R-SiO2 – TPZ NP's (Fig. 4a, Aanvullende Fig. 9c), wat wijst op een succesvolle transportcascade waarbij dragerneutrofielen betrokken zijn die hun effectorcelfunctie uitoefenen en apoptose ondergaan, waardoor passief R-SiO2-TPZ NP's worden vrijgegeven aan de doeltumorcellen . We hebben ook de hypoxische responsieve functie en cytotoxiciteit van pro-drug TPZ in tumorcellen gevalideerd door elektronenparamagnetische resonantie (EPR) spectroscopie-analyse van radicalengeneratie uit TPZ (aanvullende figuur 9d) en flowcytometrie-analyse van TOPRO-3 op tumor cellen (aanvullende figuur 9e) onder hypoxie en normoxie. Om de cytolyse van met R-SiO2-TPZ NP-geladen CAR-neutrofielen te bepalen, hebben we een in vitro normoxia-hypoxie-tumorheruitdagingsmodel geïmplementeerd (Fig. 4b). Vierentwintig uur na normoxische cocultuur vertoonden CAR-neutrofielen geladen met R-SiO2-TPZ NP's of niet vergelijkbare anti-tumor cytotoxiciteit (Fig. 4c), en beide waren hoger dan die van PB-neutrofielen geladen met R -SiO2-TPZ NP's of niet en R-SiO2- TPZ NP's alleen. De verhoogde cytotoxiciteit is voornamelijk te wijten aan het verhoogde tumorgerichte vermogen van neutrofielen na CAR-engineering. Na nog eens 12 en 24- uur hypoxische cocultuur met tumorcellen vertoonden R-SiO2-TPZ NP-geladen CAR-neutrofielen een superieur antitumorvermogen vergeleken met andere groepen (Fig. 4d, e). Bovendien vertoonden CAR-neutrofielen geladen met R-SiO2-TPZ NP's uitstekende cytolyse tegen opnieuw gezaaide verse tumorcellen (Fig. 4f), hetgeen het antitumorvermogen van vrijgekomen R-SiO2-TPZ aangeeft nanodeeltjes na apoptose van neutrofielen.

Vervolgens voerden we RNA-sequencing (RNA-seq)-analyse uit op tumorcellen om het potentiële moleculaire mechanisme op te helderen dat ten grondslag ligt aan verbeterde antitumorcytolyse van neutrofielen door CAR-expressie en R-SiO2-TPZ NP's. Analyse van genexpressie toonde aan dat CAR-neutrofielen geladen met of zonder R-SiO2-TPZ NP's, vergeleken met controle- en R-SiO2-TPZ NP's, de expressie van cytoplasma- en membraangenen in tumorcellen aanzienlijk verminderden ( Aanvullende figuur 10a, figuur 4g), wat hun fagocytose van tumorcellen na cocultuur verder ondersteunt. Terwijl alle experimentele groepen de cellulaire oxidatieve stress in tumorcellen verhoogden, presteerden R-SiO2-TPZ-geladen CAR-neutrofielen beter dan andere groepen bij het teweegbrengen van oxidatieve stresssignalering. Bovendien bevorderden R-SiO2-TPZ-geladen CAR-neutrofielen de apoptose aanzienlijk en verminderden ze de proliferatie in tumorcellen. Om de verbeterde antitumoractiviteiten van met R-SiO2-TPZ-geladen CAR-neutrofielen verder te begrijpen, hebben we een fagocytoseremmer cytochalasine D en een reactieve zuurstofspecies (ROS) wegvanger N-acetyl-cysteïne (NAC) toegepast en een ROS-remmer GSK2795039 voor de tumor-neutrofiel-cocultuur. Cytolyse van tumorcellen door CAR-neutrofielen werd significant verminderd met 5 μM cytochalasine D, 5 mM NAC en 100 nM GSK2795039 (aanvullende figuur 10b, c), wat de prominente rol van fagocytose en ROS in CAR-neutrofiel-gemedieerde tumorcellen aangeeft. doden. De resterende 40%-50% tumorcellyse in de aanwezigheid van neutrofielen en NAC of GSK2795039 duidt op de betrokkenheid van een ROS-onafhankelijk mechanisme bij door neutrofielen gemedieerde tumordoding die verder onderzoek waard is.

Afb. 3|Bereiding en karakterisering van hPSC CAR-neutrofielen geladen met tirapazamine (TPZ)-bevattende SiO2-nanodeeltjes. a – e Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) (a) en energiedispersieve spectroscopie (EDS) elementaire mappingbeelden (b) van ruwe SiO2-nanodeeltjes worden getoond. c Stikstofadsorptie-desorptie-isotherm van ruwe SiO2-nanodeeltjes samen met de Barrett-JoynerHalenda (BJH) poriegrootteverdelingsgrafiek wordt getoond. Biologische triplo's werden onafhankelijk uitgevoerd. Het TPZ-laadgehalte in SiO2-nanodeeltjes (d) en de op glutathion (GSH)--responsieve TPZ-afgifte (e) werden op het aangegeven tijdstip gemeten. n=3 biologisch onafhankelijke monsters. Eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) voor (e). Fluorescentiebeelden (f) en flowcytometrieanalyse (g) van neutrofielen geladen met gladde en ruwe SiO2-TPZ. Biologische triplo's werden onafhankelijk uitgevoerd. h Het cellulaire SiO2-gehalte in van hPSC afgeleide CAR-neutrofielen werd gemeten. n=5 biologisch onafhankelijke monsters, tweezijdige Student's t-test. Cellulaire levensvatbaarheid (i), n=3 biologisch onafhankelijke monsters, transmigratie (j), n=5 biologisch onafhankelijke monsters, chemoattractievermogen (k, l), n=20 biologisch onafhankelijke monsters, en Het vermogen om ROS te genereren (m) van van hPSC afkomstige CAR-neutrofielen geladen met of zonder ruw SiO2-TPZ werd getoond, n=5 biologisch onafhankelijke monsters, tweezijdige Student's t-test. PMA: forbolmyristaatacetaat. Alle gegevens in deze figuur worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Brongegevens worden geleverd als een brongegevensbestand.

Functionele evaluatie van CAR-neutrofielen geladen met nanomedicijnen met behulp van biomimetische glioblastoommodellen in vitro

Om de activiteiten van R-SiO2-TPZ NP-geladen CAR-neutrofielen verder te beoordelen, hebben we een op transwell gebaseerd bloed-hersenbarrière (BBB)-tumormodel geïmplementeerd met behulp van menselijke cerebrale microvasculaire endotheelcellen (Fig. 5a, Aanvullende Fig. .11a). Zoals verwacht vertoonden R-SiO2-TPZ NP-geladen CAR-neutrofielen een uitstekend transmigratievermogen in het in vitro BBB-model (Fig. 5b), waarbij gerichte tumorcellen effectief werden gedood na transmigratie onder zowel normoxische als hypoxische omstandigheden (Fig. 5c). d), en het vrijgeven van meer inflammatoire cytokinen (Fig. 5e) die andere effectorcellen kunnen aantrekken om de tumorcellen te doden. Bovendien hadden CAR-neutrofielen geen significante invloed op de levensvatbaarheid van endotheelcellen na transmigratie (aanvullende figuur 11b). R-SiO2-TPZ NP-geladen CAR-neutrofielen behielden een uitstekend transmigratievermogen tijdens het tweede transmigratie-experiment (Fig. 5f) en een superieur antitumorvermogen vergeleken met andere groepen (Fig. 5g). Een driedimensionaal (3D) tumor-sferoïdemodel werd vervolgens gebruikt om het tumorpenetratievermogen van R-SiO2-TPZ NP-geladen CAR-neutrofielen te evalueren (Fig. 5h). CAR-neutrofielen migreerden geleidelijk naar het midden van de tumor-sferoïde en werden na 8 uur incubatie uniform verdeeld in de sferoïde (Fig. 5i). Er werd een hoge mate van co-lokalisatie tussen CAR-neutrofielen en R-SiO2-TPZ NP's waargenomen (aanvullende figuren 12a – c), wat aantoont dat R-SiO2-TPZ NP's stabiel waren ingekapseld in de CAR -neutrofielen tijdens tumorinfiltratie vóór hun cytolyse. Zonder door neutrofielen gemedieerde afgifte werden R-SiO2-TPZ NP's alleen gevonden op de buitenste laag van tumorsferoïden. Vergeleken met R-SiO2-TPZ NP's en CAR-neutrofielen vertoonden R-SiO2-TPZ NP-geladen CAR-neutrofielen superieure antitumorcytolyse in het 3D-tumormodel (Fig. 5j). CAR-neutrofielen@R-SiO2 NP's kunnen ook worden gebruikt om andere geneesmiddelen, waaronder klinische temozolomide (TMZ) en JNJ- 64619187, af te leveren in 3D-tumormodellen en GBM-cellen efficiënt te doden (aanvullende figuren 12d – f). Alles bij elkaar vertoonden de combinatorische CAR-neutrofielen en nanogeneesmiddelen uitstekende antitumoractiviteiten in de micro-omgeving van biomimetische tumoren die de omstandigheden in vitro nabootsen, wat het therapeutische potentieel van combinatorische op neutrofielen gebaseerde chemo-immunotherapie benadrukt.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

In vivo distributie van door CAR-neutrofielen afgegeven R-SiO2-TPZ-nanodeeltjes

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% van de toegediende nanogeneesmiddelen werd door CAR-neutrofielen aan hersentumoren afgegeven, vergeleken met 1% door vrije nanogeneesmiddelen, wat consistent is met eerdere rapporten6. Gerichte levering van R-SiO2-TPZ NP's aan de hersenen van de gastheer over BBB door CAR-neutrofielen werd ook bevestigd door histologische analyse (Fig. 6d). Integendeel, R-SiO2-TPZ NP's alleen accumuleerden voornamelijk in de lever en de milt. Gezamenlijk hebben onze gegevens een verbeterde gerichte afgifte van R-SiO2-TPZ NP's door CAR-neutrofielen aangetoond zonder de noodzaak om extra ontsteking op de tumorplaats te induceren, wat de haalbaarheid en veiligheid van op neutrofielen gebaseerde chemo-immunotherapie bij de behandeling van kanker benadrukt.

De combinatorische chemo-immunotherapie van CAR-neutrofielen en R-SiO2-TPZ-nanodeeltjes vertoonde in vivo uitstekende anti-glioblastoomactiviteiten

Om de therapeutische werkzaamheid van met R-SiO2-TPZ NP-geladen CAR-neutrofielen te bepalen, werd een in situ xenotransplantaatmodel van glioblastoom vastgesteld in de NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) muizen met behulp van luciferase tot expressie brengende U87MG-cellen. Tumordragende muizen kregen wekelijks 5 x 106 neutrofielen intraveneus toegediend (Fig. 7a), en de tumorlast bij de gastheren werd gemeten en gekwantificeerd (Fig. 7b, c). Vergeleken met met PBS of PB-neutrofielen behandelde muizen vertraagde behandeling met CAR-neutrofielen en CAR-neutrofielen effectief de tumorgroei. CAR-neutrofielen@R-SiO2-TPZ NP's vertoonden een veel hogere antitumorcytotoxiciteit dan welke andere experimentele groep dan ook. Integendeel, PB-neutrofielen bevorderden de tumorgroei in de hersenen aanzienlijk, resulterend in de dood van tumordragende muizen al op dag 23 (Fig. 7d), wat suggereert dat niet-gemanipuleerde neutrofielen extra risico's kunnen opleveren. Vervolgens maten we de afgifte van menselijke cytokine in het plasma van verschillende experimentele muizengroepen (Fig. 7e). Alle niet-PBS experimentele groepen produceerden detecteerbaar TNF en IL-6 in het plasma van dag 5 tot dag 26, wat de activering van menselijke neutrofielen na tumorstimulatie suggereert. In overeenstemming met de waargenomen hogere tumorgroeisnelheid gaven ongemodificeerde neutrofielen geleidelijk meer IL-6 en TNF vrij, wat kan leiden tot het cytokine-release-syndroom bij patiënten en meer diepgaande veiligheidsstudies met IL-6-blokkers vereist46,47 . Met name vertoonden CAR-neutrofielen@RSiO2-TPZ NP's op latere tijdstippen (dag 19 en dag 26) een verminderd cytokineproductievermogen, wat duidt op een potentieel laag risico op cytokine-release-syndroom bij patiënten die werden behandeld met op CAR-neutrofielen gebaseerde chemo-immunotherapie. De biocompatibiliteit van combinatorische CAR-neutrofielen en R-SiO2-TPZ NP's werd geëvalueerd door wekelijkse meting van het lichaamsgewicht en monitoring van pathologische veranderingen in belangrijke organen van muizen. Er werd geen verschil waargenomen in lichaamsgewichten tussen met CAR-neutrofielen behandelde muizen en andere experimentele groepen (Fig. 7f), hetgeen wijst op minimale systemische toxiciteit en uitstekende biocompatibiliteit van CAR-neutrofielen met R-SiO2-TPZ NP's binnen 28 dagen behandeling. Histologische analyse van belangrijke organen gesneden uit muizen op dag 30 toonde aan dat met CAR-neutrofielen @ R-SiO2 – TPZ NP behandelde muizen geen merkbare afwijking of orgaanschade veroorzaakten in het hart, de lever, de milt, de longen en de nieren (aanvullende figuur 1). 13), wat de veiligheid van combinatorische CAR-neutrofielen en R-SiO2-TPZ NP's verder bevestigt.

Afb. 4|CAR-neutrofielen geladen met R-SiO2-TPZ-nanodeeltjes doden glioblastoomcellen effectief. Representatieve beelden van immunologische synapsen aangegeven door gepolariseerde F-actine-accumulatie op het grensvlak tussen CAR-neutrofielen en tumorcellen na 6, 12 en 24 uur werden getoond. R-SiO2-TPZ-nanodeeltjes die vrijkomen uit CAR-neutrofielen na fagocytose van tumorcellen, werden opgenomen door tumorcellen. Triplo's werden onafhankelijk uitgevoerd. b Schematische weergave van door neutrofielen gemedieerde antitumorcytotoxiciteitstest. Cytotoxiciteit tegen U87MG-glioblastoomcellen werd uitgevoerd bij verschillende verhoudingen van neutrofiel-tot-tumordoelwit met behulp van aangegeven neutrofielen na 24 uur (c), 36 uur (d), 48 uur (e) en 72 uur (f). n=3 biologisch onafhankelijke monsters. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, eenwegsvariantieanalyse (ANOVA). g Bulk-RNA-sequencing-analyse werd onder verschillende omstandigheden uitgevoerd op U87MG-cellen. Heatmap toont expressieniveaus van geselecteerde cytoplasma-, membraan-, oxidatieve stress-, apoptose- en proliferatiegerelateerde genen in de aangegeven glioblastoomcellen. n=2 biologisch onafhankelijke monsters. Brongegevens worden geleverd als een brongegevensbestand.

Afb. 5|Functionele evaluatie van CAR-neutrofielen geladen met R-SiO2-TPZ-nanodeeltjes met behulp van biomimetische glioblastoom (GBM)-modellen in vitro. een schematische weergave van ons in vitro tumormodel van GBM met bloed-hersenbarrière (BBB), dat is samengesteld uit endotheelcellen op het celinzetmembraan en tumorcellen op de bodem van dezelfde transwell. b Transwell-migratieanalyse van neutrofielen na 12 uur wordt getoond. Anti-GBM-cytotoxiciteit van aangegeven neutrofielen na 24 uur (c) en 36 uur (d) werd gemeten en gekwantificeerd. Er werd een ELISA-analyse van IL-6 en TNF uitgevoerd die vrijkwam uit de aangegeven neutrofielen na 36 uur. f De tweede migratie van verschillende neutrofielen na 48 uur wordt getoond. g Anti-GBM-cytotoxiciteit van aangegeven neutrofielen na 60 uur werd gemeten en gekwantificeerd. h – j Schematische voorstelling van het door neutrofielen geïnfiltreerde driedimensionale (3D) tumormodel in vitro werd getoond in (h). Representatieve fluorescerende beelden van geïnfiltreerde neutrofielen in de 3D-tumormodellen werden getoond. DAPI werd gebruikt om de celkern te kleuren en CD45 werd gebruikt om neutrofielen te kleuren. Schaalstaven, 200 μm. Biologische triplo's werden onafhankelijk uitgevoerd. j Het overeenkomstige tumordodende vermogen van de aangegeven neutrofielen werd gemeten en gekwantificeerd met behulp van een cytotoxiciteitskit. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van vijf onafhankelijke biologische replicaten, eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA). Brongegevens worden geleverd als een brongegevensbestand.

Terwijl CAR-neutrofielen@R-SiO2–TPZ NP's de tumorgroei bij xenotransplantaatmuizen aanzienlijk vertraagden, is het verschil in overleving van dieren in experimentele groepen van CAR-neutrofielen, SiO2–TPZ NP's en CAR-neutrofielen@R-SiO2–TPZ NP's onbeduidend. (p > 0.05), wat mogelijk te wijten is aan de dood van kortlevende neutrofielen tijdens celpreparatie en injectie. We concentreerden ons vervolgens op deze drie groepen en bepaalden of een kortere celvoorbereidingstijd en verhoogde doseringen CAR-neutrofielen en nanomedicijnen enig verschil zouden maken in de overleving van dieren (Fig. 7g). Bij systemische toediening van 6 keer presteerden CAR-neutrofielen R-SiO2-TPZ NP's beter dan de andere twee groepen wat betreft het verlengen van de levensduur van tumordragende muizen (Fig. 7h), terwijl het verschil in overleving van dieren in groepen CAR-neutrofielen en SiO2- TPZ-NP's bleven onbeduidend. Hoewel een vergelijkbare overlevingscurve van de R-SiO2- TPZ-groep werd waargenomen tussen deze twee onafhankelijke dierstudies, verminderde de tijd voor celisolatie en voorbereiding voor injectie van in totaal ~4 uur naar 1 uur tijdens de eerste vier neutrofielen. doses leidden tot een verbeterde overleving van dieren in CAR-neutrofielgroepen vóór dag 32. Gezamenlijk toonden onze gegevens het belang aan van de bereiding van neutrofielen en dosisoptimalisatie in toekomstige klinische toepassingen van neutrofiele therapieën.

Discussie

Er is aangetoond dat muisneutrofielen een krachtige drager zijn om op efficiënte wijze nanomedicijnen af ​​te leveren aan ontstoken postoperatieve hersentumoren8,9. Toch blijven de haalbaarheid en veiligheid van het gebruik van menselijke neutrofielen bij de toediening van medicijnen ongrijpbaar. De grote hoeveelheid muisneutrofielen (10 keer hoger dan het totale aantal circulerende neutrofielen bij muizen11) die in deze onderzoeken wordt gebruikt om therapeutisch voordeel te bereiken, kan hun klinische vertaling verder belemmeren, aangezien de extractie van grote aantallen neutrofielen uit kankerpatiënten kan leiden tot neutropenie en het ontstaan ​​van kanker. andere risico's. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we de kracht van zelfvernieuwende hPSC's benut bij het verkrijgen van onbeperkte de novo menselijke neutrofielen . We ontwikkelden een krachtig bio-geïnspireerd, door neutrofielen gemedieerd medicijnafgiftesysteem met CAR-engineering en gebruikten gemanipuleerde menselijke CAR-neutrofielen als nanodrager met opvallende antitumoractiviteiten. Ruwe SiO2 NP's werken beter dan gladde SiO2 NP's in CAR-neutrofielendragers, consistent met eerdere waarnemingen dat neutrofielen bij voorkeur ruwe microbiële pathogenen fagocyteren30. Er werd gerapporteerd dat neutrofielen de proliferatie en progressie van glioomcellen bevorderen48. We hebben een soortgelijk pro-tumoreffect van ongemodificeerde neutrofielen waargenomen in onze dierstudie, wat de noodzaak benadrukt van CCAR-techniek of andere modificaties in neutrofielen om hun veiligheid bij medicijnafgifte en andere therapeutische toepassingen te garanderen. Met name hangt onze door CAR-neutrofielen gemedieerde medicijnafgifte uitsluitend af van het natuurlijke chemo-aantrekkende vermogen van GBM, maar niet van de versterkte postoperatieve ontstekingssignalen, wat de hoge specificiteit en het therapeutische potentieel van ons medicijnafgiftesysteem suggereert bij het uitroeien van diep geïnfiltreerde gliomen. die niet operatief verwijderd kunnen worden. Aangezien chirurgische resectie en adjuvante chemotherapie/radiotherapie de primaire klinische interventies voor GBM12 zijn, kan een combinatiebehandeling met CAR-neutrofiele nanodragers en chirurgie/radiotherapie een optimale therapeutische werkzaamheid bereiken en is verder onderzoek de moeite waard. T- en NK-celspecifieke CAR-constructen zijn op grote schaal gebruikt om de antitumoractiviteiten van T- en NK-cellen te verbeteren, maar neutrofielspecifieke CAR's die de antitumorfuncties van neutrofielen verbeteren zijn niet beschreven. Van CD4ζ- en CD4-chimere immuunreceptoren werd eerder gerapporteerd dat ze de cytolyse van neutrofielen tegen met HIVenv getransfecteerde cellen in vitro versterken. Toch was de lyse-efficiëntie slechts ~10% bij een effector-tot-doel (E:T) verhouding van 10:128. Fc RIIA (CD32a) is een transmembraanreceptor met lage affiniteit en enkele keten voor monomeer IgG die in hoge mate tot expressie komt in neutrofielen (30,000 tot 60,000 moleculen/cel31), en de ligatie ervan induceert Fc - afhankelijke functies in neutrofielen, zoals het vrijkomen van korrelinhoud, Ca2+-mobilisatie, antitumorcytotoxiciteit en fagocytose49. Gezien de prominente rol van CD32a bij de activering en functie van neutrofielen, hebben we op CD32a gebaseerde CAR-constructen ontworpen en getest. Onze resultaten toonden echter aan dat CD3ζ significant betere cytolyse medieert dan CD32a wanneer het tot expressie wordt gebracht in hPSC-afgeleide neutrofielen, wat gedeeltelijk te wijten kan zijn aan de hogere kopieën van ITAMs in CD3ζ dan CD32a: respectievelijk drie en één kopieën, en hogere expressieniveaus van ζ dan op het celoppervlak van neutrofielen28. Net als CD32a is Fc RIII (CD16b) een andere receptor met lage affiniteit voor monomeer IgG en wordt op een veel hoger niveau tot expressie gebracht dan CD32a op neutrofielen31. Hoewel verknoping van CD16b alleen Ca2+-mobilisatie en degranulatie induceert, maar geen fagocytose en cytolyse in neutrofielen28,50, zal het in toekomstige studies nog steeds van belang zijn om een ​​systematische vergelijking uit te voeren over de capaciteiten van CD3ζ- en CD16b. -CAR's bij het activeren en verbeteren van antitumorfuncties van neutrofielen.

Afb. 6|In vivo distributie van door CAR-neutrofielen afgegeven R-SiO2-TPZ-nanodeeltjes (NP's). een schema van intraveneus toegediende Cy5-gelabelde CAR-neutrofielen@R-SiO2 NP's en R-SiO2 NP's voor in vivo onderzoek naar het volgen van cellen. 5 x 105 luciferase (Luci) tot expressie brengende U87MG-cellen werden stereotactisch geïmplanteerd in de rechter voorhersenen van NRG-muizen. Na 4 dagen werden muizen intraveneus behandeld met PBS, 5 x 106 Cy5-gelabelde CAR-neutrofielen@R-SiO2 NP's en R-SiO2 NP's. b De tijdsafhankelijke biodistributie van Cy5+-neutrofielen in het hele lichaam, de hersenen en andere organen werd bepaald en gekwantificeerd door middel van fluorescentiebeeldvorming op de aangegeven uren. c De biodistributie van CAR-neutrofielen@R-SiO2 NP's en R-SiO2 NP's bij muizen 24 uur na injectie werd geanalyseerd door inductief gekoppelde plasma-optische emissiespectrometrie (ICP-OES) op basis van het Si-element, en de gegevens werden uitgedrukt als het percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel (%ID/g). n=5 biologisch onafhankelijke monsters. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Brongegevens worden geleverd als een brongegevensbestand. d Representatieve fluorescentiebeelden van CD45 en SiO2 in de aangegeven glioblastoma-xenotransplantaten geïsoleerd uit tumordragende muizen werden getoond. Schaalstaven, 100 μm. Biologische triplo's werden onafhankelijk uitgevoerd.

Afb. 7|In vivo antitumoractiviteiten van combinatorische CAR-neutrofielen en R-SiO2-TPZ-nanodeeltjes (NP's) werden beoordeeld via intraveneuze injectie. een schema van intraveneus toegediende PBS, PB-neutrofielen, CAR-neutrofielen en CAR-neutrofielen@R-SiO2-TPZ NP's voor in vivo tumordodend onderzoek. 5 x 105 luciferase (Luci) tot expressie brengende U87MG-cellen werden stereotactisch geïmplanteerd in de rechter voorhersenen van NRG-muizen. Na 4 dagen werden muizen gedurende een maand wekelijks intraveneus behandeld met aangegeven neutrofielen. De tijdsafhankelijke tumorlast werd op de aangegeven dagen bepaald (b) en gekwantificeerd (c) door middel van bioluminescente beeldvorming (BLI). Gegevens zijn gemiddelde ± SD voor muizen in (b) (n=5), eenwegsvariantieanalyse (ANOVA). d Kaplan-Meier-curve die de overleving van aangegeven experimentele groepen aantoonde (n=5) werd getoond. Vrijgegeven menselijke tumornecrosefactor (TNF) en IL-6 in het perifere bloed (e) en lichaamsgewicht (f) van verschillende muizengroepen werden op de aangegeven dagen gemeten. Gegevens zijn gemiddelde ± SD, n=5 biologisch onafhankelijke monsters. g, h De antitumoractiviteit van verhoogde doseringsfrequenties van CAR-neutrofielen en RSiO2-TPZ NP's werd beoordeeld. g Schematische weergave van intraveneus toegediende CAR-neutrofielen, R-SiO2-TPZ NP's en CAR-neutrofiel@R-SiO2-TPZ NP's voor in vivo onderzoek naar het doden van tumoren. h Kaplan-Meier-curve die de overleving van aangegeven experimentele groepen aantoonde, werd getoond (n=5). Kaplan-Meier-curven werden geanalyseerd met de log-rank-test. Brongegevens worden geleverd als een brongegevensbestand.

We presenteerden hier ook een modulair en veelzijdig hPSC-platform voor de toediening van geneesmiddelen voor neutrofielen dat in de toekomst opnieuw kan worden ontworpen en afgestemd om andere op neutrofielen gebaseerde inspanningen om andere menselijke ziekten te behandelen te ondersteunen. Ten eerste is CAR-engineering toegankelijker in hPSCs dan in primaire immuun-T-cellen en neutrofielen. Er is slechts eenmalige genoombewerking nodig om een ​​stabiele en homogene expressie van verschillende CAR's te bereiken29. Naast de CLTX CAR's hebben we ook stabiele hPSC-lijnen geconstrueerd die een universele anti-fluoresceïne (FITC) of anti-PD-L1 CAR52 tot expressie brengen, die beide kunnen worden benut om universele, op vaste tumoren gerichte nanocarrier CAR-neutrofielen te verkrijgen. Andere genetische modificaties, zoals fibrose gericht op anti-FAP CARs53, kunnen ook worden uitgevoerd om neutrofiele nanodragers aan te sturen voor de behandeling van fatale degeneratieve ziekten, waaronder hersentrauma en hartfibrose. Bovendien kunnen hPSC's die CAR tot expressie brengen ook gemakkelijk worden aangepast om CAR-T- of CAR-NK-cellen te produceren, en combinaties van deze immuuntherapieën met CAR-neutrofiele nanodragers kunnen optimale therapeutische antitumorvoordelen bereiken. Ten slotte is ons bio-geïnspireerde tumor-glutathion (GSH)-responsieve nanodrugsysteem een ​​modulair en veelzijdig platform om veelbelovende chemotherapeutische of radioactieve medicijnen in CAR-neutrofielen te laden voor gerichte medicijnafgifte, zoals geïllustreerd door klinische TMZ, JNJ64619187 en pro-drug TPZ. Toekomstige studies naar het testen van andere nanodeeltjes kunnen een geoptimaliseerde medicijnbelading in neutrofielen opleveren en een maximale in vivo therapeutische werkzaamheid bereiken.

Hoewel we het therapeutische concept van het gebruik van CAR-neutrofielen hebben gedemonstreerd om chemomedicijnen specifiek en efficiënt af te leveren aan hersentumoren over de gehele BBB, zijn er enkele beperkingen in deze studie. Ten eerste is 4-daginenting met tumorcellen misschien niet voldoende om tumoren vast te stellen die het klinische scenario voor therapeutisch onderzoek nabootsen, en toekomstig werk met verschillende tumorinentingsperioden is nodig om de verschillende stadia van de ontwikkeling van glioblastomen en de therapeutische respons in verschillende omstandigheden te recapituleren. patiënten54,55. Ten tweede missen de immunodeficiënte muizen die we hier hebben gebruikt adaptieve immuniteit, en zijn andere preklinische modellen met een intact immuunsysteem, zoals honden met spontaan glioom, nodig om de veiligheid en werkzaamheid van in vitro geproduceerde CAR-neutrofielen beter te kunnen beoordelen. In het bijzonder is het nodig om off-target toxiciteitsprofilering van CAR-neutrofielen met of zonder het laden van nanogeneesmiddelen in geïnfuseerde dieren, waaronder het cytokine-afgiftesyndroom, neurotoxiciteit en on-target off-tumor toxiciteiten waargenomen in CAR-T-cellen57, nodig te hebben, ondanks de korte levensduur van neutrofielen. Hoewel haalbare benaderingen, zoals het ontwikkelen van hypoimmunogene universele donor-hPSCs en het bankieren van humaan leukocytenantigeen (HLA)-homozygote hPSC-bibliotheken62, direct beschikbaar zijn om het potentiële risico van graft-versus-hostziekte (GvHD) te vermijden, zijn preklinische diermodellen met een Een intact immuunsysteem is nog steeds nodig om het translationele potentieel van onze neutrofiele therapieën te beoordelen. Ten slotte werden beperkte antitumorcytotoxiciteit en verlenging van de levensduur van dieren met CAR-neutrofiele nanogeneesmiddelen waargenomen. Daarom is toekomstig onderzoek naar effectievere chemotherapiemedicijnen of radiosensitizers, en combinatietherapieën met klassieke CAR-T en chirurgische resectie essentieel om maximale antitumoreffectiviteit van CAR-neutrofiele therapieën te bereiken. Een recent onderzoek naar op mechanismen gebaseerd ontwerp heeft bijvoorbeeld geleid tot een effectiever medicijn KL-50 dat de verworven resistentie overwint, zoals waargenomen bij het klinische TMZ-medicijn63 en dus kan worden opgenomen in ons modulaire CAR-neutrofiele nanodrugsplatform voor een potentieel betere therapeutische werkzaamheid. Het verlengen van de houdbaarheid van neutrofielen tot 5 dagen via CLON-G-behandeling (caspases-lysosomale membraanpermeabilisatie-oxidant-necroptose-remming plus granulocytkoloniestimulerende factor64) en/of het gebruik van een langduriger gecontroleerd medicijnafgiftesysteem in CAR-neutrofielen kan ook een aanhoudende in vivo antitumorale werkzaamheid bereiken na apoptose van neutrofielen. Gezamenlijk hebben onze bevindingen duidelijk aangetoond dat met R-SiO2-TPZ geladen CAR-neutrofielen het anti-tumor N1-fenotype in stand konden houden en tumorcellen efficiënt konden doden onder verschillende tumor-niche-achtige omstandigheden in vitro. Functionele CAR-neutrofielen zouden ook in grote hoeveelheden kunnen worden geproduceerd uit speciaal ontworpen hPSC's om op tumormicro-omgeving reagerende nanomedicijnen nauwkeurig af te leveren om GBM in vivo te targeten, wat leidt tot een combinatorische chemo-immunotherapie met robuuste en specifieke anti-GBM-activiteiten en minimale off-target medicijnafgifte die verlengde levensduur bij tumordragende muizen.

Referenties

1. Yang F. et al. Synergetische immunotherapie van glioblastoom door dubbele targeting van IL-6 en CD40. Nat. Gemeenschappelijk. 12, 3424 https://doi.org/10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Huidige staat van immunotherapie voor glioblastoom. Nat. Ds. Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Intratumorale toediening van IL-12 maakt CAR-T-celimmunotherapie mogelijk in een preklinisch model van glioblastoom. Nat. Gemeenschappelijk. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrofielen als opkomende therapeutische doelen. Nat. Rev. Drug Ontdek. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrofielen als een opkomend therapeutisch doelwit en hulpmiddel voor kankertherapie. Leven Wetenschap. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Meta-analyse van de afgifte van nanodeeltjes aan tumoren met behulp van een fysiologisch gebaseerde farmacokinetische modellering en simulatiebenadering. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Analyse van de afgifte van nanodeeltjes aan tumoren. Nat. Ds. Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Door neutrofielen gemedieerde toediening van antikankermedicijnen voor de onderdrukking van postoperatief kwaadaardig glioomrecidief. Nat. Nanotechnologie. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. MR-beeldregistratie van door ontstekingen activeerbare gemanipuleerde neutrofielen voor gerichte therapie van chirurgisch behandeld glioom. Nat. Gemeenschappelijk. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Fotosensibilisatie-priming van micro-omgevingen van tumoren verbetert de afgifte van nanotherapeutica via infiltratie van neutrofielen. Gev. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Kankertherapie: verkeer van neutrofielen in nanomedicijnen tegen kanker. Nat. Nanotechnologie. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Rollen van neutrofielen bij glioom en hersenmetastasen. Voorkant. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Polarisatie van tumor-geassocieerd neutrofielenfenotype door TGF-bèta: "N1" versus "N2" TAN. Kankercel (2009).

14. Blaisdell, A. et al. Neutrofielen verzetten zich tegen baarmoederepitheelcarcinogenese via het debridement van hypoxische tumorcellen. Kankercel 28, 785-799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. Verlichting van tumorhypoxie ontketent het tumordodende potentieel van neutrofielen. J. Clin. Investeer 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. Menselijke polymorfonucleaire neutrofielen herkennen en doden specifiek kankercellen. Onco-immunologie 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Neutrofielendiversiteit en plasticiteit bij tumorprogressie en therapie. Nat. Rev. Kanker 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Onderzoeksvoortgang naar glioomstamcellen in de immuunmicro-omgeving van glioom. Voorkant. Farmacol. https://doi.org/10. 3389/ffar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Immuunmicro-omgeving van gliomen. Laboratorium. Onderzoek. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. Plasticiteit, heterogeniteit en resistentie van tumorcellen in cruciale micro-omgevingsniches bij glioom. Nat. Gemeenschappelijk. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Opkomende immuuntherapieën voor kwaadaardig glioom: van immunogenomica tot celtherapie. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. Door neutrofielen geïnduceerde ferroptose bevordert tumornecrose bij de progressie van glioblastomen. Nat. Gemeenschappelijk. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Fenotypische diversiteit en plasticiteit in circulerende neutrofielensubpopulaties bij kanker. Celvertegenwoordiger 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Van menselijke iPSC afkomstige natuurlijke killercellen, ontwikkeld met chimere antigeenreceptoren, versterken de antitumoractiviteit. Celstamcel 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Mutante interleukine-13-gerichte CAR T-cellen met hoge affiniteit verbeteren de levering van klikbare, biologisch afbreekbare fluorescerende nanodeeltjes aan glioblastoom. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Een nieuw ligandafgiftesysteem om de IL13R 2-tumorbeperkte biomarker op niet-invasieve wijze te visualiseren en therapeutisch te exploiteren. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Op chloortoxine gerichte CAR T-cellen voor specifieke en effectieve targeting van glioblastoom. Wetenschap Vert. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Antigeen-specifieke cytolyse door neutrofielen en NK-cellen die chimere immuunreceptoren tot expressie brengen die zeta- of gamma-signaleringsdomeinen dragen. J. Immunol. 161, 375-384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Engineering van chimere antigeenreceptorneutrofielen uit menselijke pluripotente stamcellen voor gerichte kankerimmunotherapie. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. Neutrofielen fagocyteren bij voorkeur langwerpige deeltjes die de mogelijkheid bieden voor selectieve targeting bij acute ontstekingsziekten. Wetenschap Gev. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Expressie, rol en regulatie van neutrofiele Fc-receptoren. Voorkant. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Belang van ITAM-tyrosines met fc-receptorketen bij de activering van neutrofielen en in vivo auto-immuunartritis. Voorkant. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Rol van neutrofiele Fc RIIa (CD32) en Fc RIIIb (CD16) polymorfe vormen bij fagocytose van menselijke IgG1- en IgG3-geopsoniseerde bacteriën en erytrocyten. Transfusie. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Menselijke neutrofiele Fc-receptoren initiëren en spelen gespecialiseerde niet-redundante rollen bij door antilichamen gemedieerde ontstekingsziekten. Immuniteit. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. Chemisch gedefinieerde generatie van menselijk hemogeen endotheel en definitieve hematopoietische voorlopercellen. Biomaterialen 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Effectieve en snelle generatie van functionele neutrofielen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van ETV2-gemodificeerd mRNA. Stamcel Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. De rol van hypoxie in de micro-omgeving van tumoren en de ontwikkeling van kankerstamcellen: een nieuwe benadering voor het ontwikkelen van een behandeling. Kankercel Int. https://doi.org/10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. Impact van hypoxische tumormicro-omgeving en tumorcelplasticiteit op de expressie van immuuncontrolepunten. Kanker Let. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Rol van proteïne-tyrosinekinase Syk bij oxidatieve stresssignalering in B-cellen. Antioxidanten Redoxsignaal. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. ROS en ROS-gemedieerde cellulaire signalering. Oxidaat. Med. Cel. Levensduur. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. Een Ras-activeringsroute die afhankelijk is van Syk-fosforylering van proteïnekinase C. Proc. Nat. Acad. Wetenschap VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ De SYK-tyrosinekinase: een cruciale speler in diverse biologische functies. Nat. Ds. Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Een tumor-micro-omgeving-responsief nanocomposiet voor waterstofsulfidegas en trimodale verbeterde enzymdynamische therapie. Gev. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrofielen voor de ROScue: mechanismen van NADPH-oxidase-activering en bacteriële resistentie. Voorkant. Cel. Infecteren. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. Neutrofielen maken lokale en niet-invasieve toediening van liposomen aan ontstoken skeletspieren en ischemische hart mogelijk. Gev. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. Samenvatting van de FDA-goedkeuring: tocilizumab voor de behandeling van door chimere antigeenreceptor T-cellen geïnduceerd ernstig of levensbedreigend cytokine-release-syndroom. Oncoloog 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Cytokine-release-syndroom en geassocieerde neurotoxiciteit bij immunotherapie tegen kanker. Nat. Ds. Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. Neutrofielen bevorderen het kwaadaardige glioomfenotype via S100A4. Klin. Kankeronderzoek. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Celspecifieke, activeringsafhankelijke regulatie van neutrofiele CD32A-ligandbindende functie. Bloed https://doi.org/10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Cytotoxiciteit gemedieerd door menselijke Fc-receptoren voor IgG. Immunol. Vandaag. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. Regulatie van CAR T-cel-gemedieerde cytokine-afgiftesyndroom-achtige toxiciteit met behulp van adapters met een laag molecuulgewicht. Nat. Gemeenschappelijk. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Een nieuwe chimere antigeenreceptor die een JAK-STAT-signaleringsdomein bevat, bemiddelt superieure antitumoreffecten. Nat. Med. 24, 352-359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Gericht op hartfibrose met gemanipuleerde T-cellen. Natuur. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-specifieke NK-cellen voor gerichte therapie van glioblastoom. J. Natl. Kanker Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. CAR T-cellen voor hersentumoren: geleerde lessen en de weg die voor ons ligt. Immunol. Herz. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Veiligheids- en tussentijdse overlevingsgegevens na intracraniale toediening van M032, een genetisch gemanipuleerde oncolytische HSV-1 die IL-12 tot expressie brengt, bij honden met sporadische gliomen. Neurochirurg. Focus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Recente ontwikkelingen en ontdekkingen in de mechanismen en functies van CAR T-cellen. Nat. Rev. Kreeft 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Generatie van hypoimmunogene T-cellen uit genetisch gemanipuleerde allogene, door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. Nat. Biomedisch. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Hypoimmunogene derivaten van geïnduceerde pluripotente stamcellen omzeilen immuunafstoting bij volledig immunocompetente allogene ontvangers. Nat. Biotechnologie. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Generatie van hypoimmunogene menselijke pluripotente stamcellen. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. HLA DR Genome editing met TALENs in menselijke iPSCs produceerde immuuntolerante dendritische cellen. Stamcellen Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. MHC-matching verbetert de enting van van iPSC afkomstige neuronen bij niet-menselijke primaten. Nat. Gemeenschappelijk. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. Op mechanismen gebaseerd ontwerp van middelen die zich selectief richten op medicijnresistent glioom. Wetenschap (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. Het richten op meerdere celdoodroutes verlengt de houdbaarheid en behoudt de functie van menselijke en muizenneutrofielen voor transfusie. Wetenschap Vert. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Fluorescerende indicatoren voor continue en lijnspecifieke rapportage van celcyclusfasen in menselijke pluripotente stamcellen. Biotechnologie. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Chemisch gedefinieerde generatie van menselijke definitieve hematopoietische stam- en voorlopercellen. STAR-protocol. 4, 101953 (2023).