Veranderingen in menselijk erytrocytenmembraan dat is blootgesteld aan waterige en ethanolische extracten van Uncaria Tomentosa

Contact:tina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Uncaria tomentosa (Willd.)DC is een houtachtige klimplantsoort afkomstig uit Zuid- en Midden-Amerika die is gebruikt bij de behandeling van astma, reuma, hypertensie en bloedzuivering. Onze vorige studie toonde aan dat U.tomentosaextractenveranderde vorm van menselijke erytrocyten, wat te wijten zou kunnen zijn aan de opname van de verbindingen in extracten in het erytrocytenmembraan. Het doel van de huidige studie was om te bepalen hoe de verbindingen in UI.tomentosa-extracten worden opgenomen in het menselijke erytrocytenmembraan. De studie heeft het effect beoordeeld van waterige en ethanolische extracten van bladeren en bast van U. tomentose op de osmotische weerstand van de menselijke erytrocyt, de viscositeit van het inwendige van de erytrocyten en de vloeibaarheid van het plasmamembraan van de erytrocyt. Menselijkerytrocytenwerden geïncubeerd met de bestudeerde extracten in de concentraties van 100,250 en 500ug/ml gedurende 2,5 en 24 uur. Alle geteste extracten veroorzaakten een afname van de vloeibaarheid van het erytrocytmembraan en een verhoogde osmotische gevoeligheid van de erytrocyten. De ethanolische extracten van de schors en bladeren verhoogden de viscositeit van de erytrocyten. De grootste veranderingen in de bestudeerde parameters werden waargenomen in de cellen die waren geïncubeerd met ethanolisch extract van schors. We zijn van mening dat de verbindingen uit U. tomentosa-extract voornamelijk inbouwen in de buitenste, hydrofiele monolaag van het erytrocytenmembraan, waardoor de erytrocyten worden beschermd tegen de nadelige effecten van oxidatieve stress.

Trefwoorden: erytrocyten; membraan vloeibaarheid; osmotische weerstand; Uncaria tomentosa; extracten

Klik voor meer informatie

1. Inleiding

Uncaria tomentosaextractenworden vaak gebruikt ter ondersteuning van de behandeling van verschillende ziekten vanwege hunantioxidant[1-4] en immuunstimulerende [5,6] activiteiten. Van extracten van U.tomentosa is ook aangetoond dat ze antikanker [7-9], antimutagene [10,11] en antiherpetische activiteiten [11] vertonen.

Etnomedicinale onderzoeken en andere onderzoeken hebben talloze toepassingen van deze plant in de traditionele geneeskunde van verschillende culturen aangetoond, bijvoorbeeld voor de behandeling van ontstekingen, artritis, astma, kanker, maagzweren, urinewegaandoeningen en bloedingen [12,13]. Dergelijke uiteenlopende eigenschappen zijn te wijten aan de complexe chemische samenstelling van U. tomentosa die voornamelijk wordt geassocieerd met een hoog gehalte aan verschillende biologisch actieve secundaire metabolieten, meestal fenolische en alkaloïden [14].

Veel artikelen hebben ook de gunstige werking (zonder enige bijwerkingen) van UI.tomentosa-extracten (gebruikt in therapeutische doseringen) in bloedcellen in zowel in vivo [15,16] als in vitro studies [17-19] aangegeven. Sheng et al. [20] hebben geen veranderingen in de bloedpresentatie waargenomen na toediening van hoge concentraties U. tomentosa-extract C-MED-100TM aan gezonde vrijwilligers. Ze namen geen statistisch significante veranderingen waar, waaronder hemoglobinegehalte, hematocrietwaarde en gemiddeld rode bloedcel (RBC) volume, wat een mogelijke voortijdige eliminatie van RBC's blootgesteld aan U. tomentosa-extracten eerder uitsloot.

Evenzo klinische onderzoeken uitgevoerd door Piscoya et al. [21] bij patiënten met artrose van de knie, met betrekking tot de evaluatie van de werkzaamheid van Uncaria gujanensis bij de behandeling van deze ziekte, toonden geen veranderingen in hematocriet, hemoglobineniveau, evenals de waarde van de erytrocytsedimentatiesnelheid (ESR), vergeleken met een groep van patiënten die placebo kregen. Desalniettemin zijn verdere studies over grotere menselijke cohorten nodig om de mogelijkheid van eliminatie van prematuren uit te sluitenerytrocytenuit de circulatie van mensen die zijn blootgesteld aan Uncaria-soorten. Onze eerdere studies hebben aangetoond dat ethanolische en waterige extracten van de bladeren en bast van U. tomentosa zelfs bij een zeer hoge concentratie van 500 ug/ml niet toxisch waren voor de erytrocyten. We hebben ook waargenomen dat de bestudeerde extracten hemoglobineoxidatie en lipideperoxidatie verminderden, evenals verminderde ROS-vorming en hemolyse veroorzaakt door een giftige stof 24-dichloorfenol (2,4-DCP)[17]. Daarnaast vonden we een beschermend effect van U. tomentosa-extracten op de activiteit van catalase in humane erytrocyten die waren geïncubeerd met 2,4-DCP en catechol [22].

De fysiologische concentratie van plantaardige polyfenolen is moeilijk te beoordelen. In de literatuur wordt meestal informatie gegeven over aanbevolen doseringen van preparaten of de concentraties van geteste verbindingen (voor mensen 210-500 mg/dag of voor dieren 350-500 mg/kg lichaamsgewicht) [23,24 ].

Sommige verbindingen worden geabsorbeerd zonder hun vorm te veranderen, terwijl andere, vooral in de vorm van glucosiden, tijdens de absorptie alle of een deel van de suikerresten worden onthouden. De darmflora neemt ook deel aan de transformatie van plantaardige polyfenolen.

Het grootste deel van de geabsorbeerde dosis wordt via urine en feces uit het lichaam uitgescheiden. Geschat wordt dat niet meer dan 10-20 procent van de ingenomen dosis quercetine en isoflavonen (genisteïne en daidzeïne) na 1-3 uur toediening in het plasma wordt gedetecteerd. Anthocyanines worden als minder efficiënt geabsorbeerd beschouwd - hun absorptie wordt geschat op 1-2 procent van de initiële dosis [25]

Oxidatieve stress treedt op wanneer het niveau van ROS in een cel het niveau van de cel overweldigtantioxidantafweersysteem. Rode bloedcellen zijn bijzonder gevoelig voor oxidatieve stress vanwege het hoge gehalte aan meervoudig onverzadigde vetzuren in hun membraan en de auto-oxidatie van hemoglobine. Het menselijke erytrocytenmembraan is samengesteld uit verzadigde vetzuren, enkelvoudig onverzadigde vetzuren, meervoudig onverzadigde vetzuren en N-3 meervoudig onverzadigde vetzuren met lange keten [26]. Oxidatiemiddelen veranderen de membraanstijfheid, veranderen de membraandipoolpotentiaal en veroorzaken de vorming van spectrine-hemoglobinecomplexen [27]. Om oxidatieve stress het hoofd te bieden, zijn de erytrocyten uitgerust met een gespecialiseerd cytoskelet dat de mechanische stabiliteit en flexibiliteit biedt die nodig zijn om de krachten die optreden tijdens de bloedsomloop te weerstaan. Erytrocytenmembraan is samengesteld uit een lipide dubbellaag, transmembraaneiwitten en een filamenteus netwerk van eiwitten (zoals spectrine, F-actine, eiwit 4.1 en actine-bindende eiwitten domein, adducine, tropomyosine en tropomoduline) die een membraanskelet vormen langs het gehele cytoplasmatische oppervlak van hun membraan [28]. ROS zijn ook in staat om eryptosis te induceren door veranderingen in de translocatie van membraanfosfatidylserine (PS) [29]. Oxidatieve stress kan ook leiden tot uitputting van cellulaire reductieve componenten en structurele en functionele veranderingen in het membraan van rode bloedcellen veroorzaken: afbraak van fosfatidylserine en siaalzuur, de belangrijkste componenten die de negatieve lading aan de buitenkant van het membraan veroorzaken [30].

Het is bewezen dat polyfenolen geïsoleerd uit U.tomentosa zeer sterke antioxidatieve eigenschappen vertonen. Verschillende rapporten hebben aangetoond dat waterige en methanolische extracten verkregen uit verschillende delen van U. tomentosa cellen beschermden tegen de productie van vrije radicalen en lipideperoxidatie in vitro, evenals door vrije radicalen geïnduceerde DNA-schade en celdood remden [2,3,31]. In onze vorige studie toonden we ook aan dat UI.tomentosa-extracten onder fysiologische omstandigheden erytrocyten beschermden tegen ROS-vorming en hemolyse. Bovendien hebben we aangetoond dat ethanolische extracten van .tomentosa de sterkste beschermende effecten vertoonden [17].

Om na te gaan of de geteste verbindingen het membraan kunnen binnendringen (en op welke diepte ze zich bevinden), werd de vloeibaarheid van het erytrocytmembraan beoordeeld. Veel fysische en chemische factoren beïnvloeden de vloeibaarheid van het membraan [32,33]. Chemische agentia omvatten xenobiotica die oxidatie van lipiden en eiwitten veroorzaken en de verbindingen die intercaleren

in het membraan [34,35]. De opname van vreemde verbindingen in de membraanstructuur kan de rangschikking van de elementen ervan verstoren, wat meestal resulteert in een verandering in de vloeibaarheid van het membraan. Veranderingen in de vloeibaarheid van het membraan kunnen leiden tot erytrocytdisfunctie en tot veranderingen in de reologische eigenschappen van de erytrocyt [36]. Aan de andere kant kunnen de stoffen met antioxiderende eigenschappen die het membraan kunnen penetreren een beschermende rol spelen naar de cel toe [37]. Daarom hebben we, om te verduidelijken of de verbindingen in U.tomentosa-extracten zich kunnen inbouwen in de binnenste en/of buitenste membraanfolder, veranderingen in membraanfluïditeit op de verschillende niveaus beoordeeld, evenals de osmotische weerstand en interne viscositeit van erytrocyten geëvalueerd. We kozen relatief hoge concentraties (maar niet toxisch zoals aangetoond in eerdere studies) van de geteste extracten om mogelijke veranderingen in de bestudeerde parameters te observeren en om de locatie van de extractcomponenten in het erytrocytenmembraan te bepalen.

2. Resultaten

2.1.Membraan Vloeistof

2.1.1. Bestelparameter S

Na 2 uur en 24 uur incubatie van de erytrocyten met waterige en ethanolische extracten van schors en bladeren, werden statistisch significante veranderingen opgemerkt in de volgordeparameter S. Figuur 1 toont de gemiddelde en standaarddeviatiewaarden voor vier (2 uur incubatie) en vijf ( 24 uur incubatie) onafhankelijke experimenten. Na 2 uur incubatie veroorzaakten alle extracten die werden bestudeerd bij 500 ug/ml een verhoging van de ordeningsparameter S in menselijke RBC's. Na 24 uur incubatie werden statistisch significante veranderingen in de bestudeerde parameter waargenomen, zowel bij 250 ug/ml als bij 500 ug /mL van alle onderzochte extracten.

2.1.2. Correlatie Tijd TB en Tijd TC

Na 2 uur incubatie werden statistisch significante veranderingen waargenomen voor de correlatietijd TB en tijd tc voor de erytrocyten die alleen waren behandeld met ethanolisch extract bij 500 ug/ml. Na 24 uur incubatie werden geen statistisch significante veranderingen in tijd tot en tijd Tc waargenomen in RBC's die waren behandeld met een getest extract (tabel 1).

2.2. Interne viscositeit van rode bloedcellen

Na 2 uur en 24 uur incubatie van RBC's met water en ethanolische extracten van de schors en de bladeren in de concentraties van 100 tot 500 ug/ml, werden geen statistisch significante veranderingen waargenomen in de relatieve viscositeit van het inwendige van de erytrocyten (Figuur 2) . De grafieken tonen de gemiddelde en standaarddeviatiewaarden voor vier (2 uur) en vijf (24 uur) onafhankelijke experimenten.

Opgemerkt moet worden dat na 2 uur, en vooral na 24 uur incubatie van de erytrocyten met ethanolische extracten van de bast, een neiging tot verhoogde viscositeit van het internum van de erytrocyten kon worden waargenomen (de resultaten waren niet statistisch significant) (Figuur 2) .

2.3. Osmotische kwetsbaarheid

Incubatie van de erytrocyten met waterige en ethanolische extracten van de bast en de bladeren in een concentratie van 100 ug/L werd uitgevoerd gedurende 2 uur, 5 uur en 24 uur. Het osmotische weerstandsdiagram (Figuur 3) geeft de gemiddelde resultaten weer voor 5 onafhankelijke experimenten voor elke incubatietijd. Voor de leesbaarheid van de grafiek zijn geen standaarddeviaties uitgezet. De IC5o-plots (Figuur 4) tonen de berekende gemiddelde en standaarddeviatiewaarden voor 5 onafhankelijke experimenten voor elke incubatietijd.

Na 2 uur incubatie van de erytrocyten met de geteste extracten, werden geen veranderingen in de osmotische gevoeligheid van deze cellen, en dus veranderingen in IC's0 parameterwaarden waargenomen (Figuur 3 en 4). Er werd ook opgemerkt dat de geteste extracten na 5 uur incubatie de osmotische gevoeligheid van menselijke erytrocyten verhoogden. Behalve het waterige bladextract, maakten de andere extracten rode bloedcellen gevoelig voor schade door osmotische stress. De erytrocyten geïncubeerd met de bestudeerde extracten ondergingen hemolyse bij hogere NaCl-concentraties in vergelijking met de controle-RBC's (Figuur 3). Een toename van de IC50-parameterwaarden was ook statistisch significant voor de erytrocyten die gedurende 5 uur waren geïncubeerd met waterige en ethanolische bastextracten en ethanolisch bladextract (Figuur 4). Na 24 uur incubatie werd een grotere gevoeligheid voor osmotische stress opgemerkt in de erytrocyten die waren behandeld met alle geteste extracten in vergelijking met de

controle RBC's (Figuur 3). Evenzo werd een statistisch significante toename van de ICs-waarden opgemerkt in de erytrocyten die waren geïncubeerd met alle bestudeerde extracten van U.tomentosa (Figuur 4).

3. Discussie

Een eerdere studie toonde aan dat extracten van U.tomentosa de morfologie van menselijke erytrocyten veranderden [19]. De vorming van schistocyten werd gevonden, wat wijst op de opname van de componenten van extracten in de buitenste monolaag van het erytrocytenmembraan [38,39]. Een andere studie toonde aan dat de verbindingen in U. tomentosa-extracten hemoglobinelekkage (hemolyse) remden, waarschijnlijk door het celmembraan af te sluiten [17]. Een van de eigenschappen van het biologische membraan, als gevolg van zijn structuur en interactie tussen zijn componenten, is de vloeibaarheid van het membraan. De vloeibaarheid van het membraan is omgekeerd evenredig met zijn viscositeit.

Met behulp van paramagnetische resonantiespectroscopie (EPR) werd de vloeibaarheid van erytrocytmembraan geïncubeerd met ethanol en waterige extracten van schors en bladeren bepaald op twee niveaus van de 5 en 16 koolstofatomen van het vetzuurresidu.

Op basis van de EPR-spectra verkregen voor de 5-doxy-stearinezuur-spin-tag (5-DSA), werd de S-ordeningsparameter berekend, die informatie gaf over de vloeibaarheidsveranderingen op het niveau van 5 koolstofatomen van het vetzuurresidu. Voor de ordeningsparameter S werd een statistisch significante toename van de waarde ervan waargenomen na incubatie van erytrocyten met ethanol en waterextracten van de schors en bladeren van U. tomentosa, waaruit bleek

een afname van de vloeibaarheid van het membraan op het niveau van 5 koolstofatomen van een vetzuurresidu. Een statistisch significante toename van de parameter S werd waargenomen na 2-u incubatie van erytrocyten met ethanolische extracten van de bast, evenals water en ethanolisch extract van bladeren bij 250 ug/ml en 500 ug/ml, terwijl waterextract van de schors alleen bij 500 ug/mL veroorzaakte veranderingen in de bespreken parameter (Figuur 1A). Verlenging van de incubatietijd tot 24 uur veroorzaakte een statistisch significante toename van de S-parameter in de erytrocyten die waren geïncubeerd met alle bestudeerde extracten vanaf hun concentratie van 250 ug/mL (Figuur 1B). De afname van de vloeibaarheid van het membraan op het niveau van 5 koolstofatomen van een vetzuurresidu kan in verband zijn gebracht met het effect van polyfenolen op de structuur van het plasmamembraan zoals beschreven door Duchnowicz et al. [40]. Onderzoek door Koren et al.[37] impliceerde een gunstig effect van polyfenolen op de totale antioxidantcapaciteit van het bloed, vooral van de erytrocyten. Ze stelden dat circulerende erytrocyten en mogelijk andere bloedcellen constant bedekt zouden kunnen zijn met polyfenolen uit gesupplementeerde voedingsstoffen, die fungeren als depots van antioxidanten en zich dus kunnen gedragen als beschermers tegen de schadelijke gevolgen van oxidatieve stress. Polyfenolische verbindingen bepaald in U. tomentosa worden geclassificeerd als secundaire metabolieten die een positief effect hebben op het menselijk lichaam. Ze vertonen antioxiderende activiteit, chelaat metaalionen (ijzer, koper) en ondersteunen antioxidatieve enzymenactiviteiten. Het beschermende effect van polyfenolen op het menselijk lichaam wordt voornamelijk geassocieerd met celbescherming tegen oxidatieve stress, wat kan worden geassocieerd met het voorkomen van de ontwikkeling van verschillende ziekten, waaronder atherosclerose of kanker [41,42]. Onderzoek uitgevoerd door Heitzman et al. [43] evenals onze studie [17] toonde de aanwezigheid van polyfenolen in extracten van U.tomentosa. De auteurs bepaalden door analyse van verschillende extracten het hoogste gehalte aan polyfenolen in het ethanolextract van de bast en het laagste in het waterige extract van de bladeren. Fenolische verbindingen aanwezig in Ul. tomentosa worden meestal vertegenwoordigd door tannines, flavonolderivaten, catechines, tannines (inclusief catechines en epicatechinen) en procyanidinen. Polyfenolen hebben vanwege hun structuur een verschillende oplosbaarheid in water, maar ze lossen allemaal goed op in organische oplosmiddelen. Daarom hebben ethanolextracten van planten meestal een meer diverse samenstelling en een hogere concentratie aan polyfenolen dan waterige extracten.

In het geval van de 16-doxylstearinezuur-spin-tag (16-DSA) werden twee correlatietijden T en tc bepaald. Na incubatie van erytrocyten gedurende 2 uur met ethanolextract uit de bast in een concentratie van 500 ug/ml, werd een toename van de correlatietijd tp en tijd Tc waargenomen. Er werden echter geen statistisch significante veranderingen in deze parameters opgemerkt na 24 uur incubatie. Andere geteste extracten veroorzaakten geen statistisch significante veranderingen in de TB-correlatietijd, zowel na 2 uur als na 24 uur incubatie. Een opwaartse trend voor deze parameter werd aangetoond in erytrocyten die waren geïncubeerd (in het bijzonder gedurende 24 uur) met alle onderzochte extracten bij 500 ug/ml (tabel 1). Een toename van de correlatietijden tB en tc duidt op een verstijving van de film op het niveau van 16 koolstofatomen van het vetzuurresidu. Geen veranderingen na 24 uur incubatie suggereren echter dat dit een tijdelijk effect is dat wordt veroorzaakt door de componenten van het extract, die aanvankelijk in het membraan zijn opgenomen, maar na een langere incubatietijd buiten de cel worden verwijderd. Dergelijke effecten van polyfenolen werden beschreven in de studie van Tarahovsky et al. [44]. Deze auteurs suggereerden dat flavonoïden de hydrofobe plaats van de lipidedubbellaag binnendringen, in het bijzonder in de compartimenten die bekend staan ​​als lipid rafts, of in hydrofobe eiwitpockets. Flavonoïden hebben na complexvorming met metalen nog steeds het antioxidatieve potentieel, terwijl hun lipofiliciteit kan toenemen, waardoor de bescherming van membraanlipiden tegen oxidatie wordt vergemakkelijkt.

We suggereren dat polyfenolen uit het bastextract van U. tomentosa niet alleen diepere niveaus van het erytrocytenmembraan doordrongen, maar ook in de cel werden overgebracht, wat werd bevestigd door de toename van de interne viscositeit van RBC. Een van de belangrijkste parameters die de vervormbaarheid van erytrocyten beïnvloeden, is hun interne viscositeit [45]. In deze studie werden veranderingen in de viscositeit van erytrocyten beoordeeld door spinmarkers. Er waren geen statistisch significante veranderingen in de relatieve viscositeit van erytrocyten behandeld met waterextracten van U.tomentosa zowel na 2-u als 24-u incubatie, terwijl ethanolische extracten veranderingen in de besprekende parameter induceerden (Figuur 2). Dit kan erop wijzen dat polyfenolen in veel

hogere concentraties in ethanolische extracten drongen intensief door het RBC-membraan en veroorzaakten veranderingen in de viscositeit van het inwendige van de erytrocyt. Erytrocyten geïncubeerd met waterextracten konden gemakkelijk compenseren voor veranderingen in hun viscositeit, die werden veroorzaakt door lagere concentraties polyfenolische stoffen (Figuur 6).

Er moet echter worden benadrukt dat de locatie van polyfenolen in de diepere lagen van het celmembraan, en bijgevolg hun penetratie in de cel met gelijktijdige verstoring van de RBC-viscositeit alleen kan optreden bij een zeer hoge concentratie van deze stoffen die niet worden gevonden in het menselijk lichaam, zelfs na therapeutische behandeling met U. tomentosa-extracten. Bij lage concentraties bevinden polyfenolen zich voornamelijk in de buitenste monolaag, zoals blijkt uit veranderingen in de waarde van de parameter S. Veranderingen in de viscositeit van het inwendige van de erytrocyten kunnen gepaard gaan met een verandering in de vorm van de erytrocyten. Dit werd aangegeven door veranderingen in de forward scatter channel (FSC) parameter verkregen uit flowcytometrische analyse en foto's verkregen uit een fasecontrast microscopisch onderzoek [19]. De vorming van schistocyten kan het gevolg zijn van de plaatsing van polyfenolen die aanwezig zijn in U.tomentosa-extracten, zowel in het hydrofiele gebied als in het hydrofobe gebied van de buitenste celmembraanmonolaag, zoals gesuggereerd door veranderingen in de ordeningsparameter S en correlatietijden tB en Tc. Veranderingen in de vorm van rode bloedcellen kunnen in verband worden gebracht met waterverlies en de toename van de viscositeit in de cellen. Bovendien kunnen ze het gevolg zijn van een afname van de osmotische weerstand van de erytrocyten. Plaatsing van veranderde erytrocyten in een isotone NaCl-oplossing kan leiden tot snellere cellysis (in vergelijking met controlecellen) vanwege de verhoogde werking van water en een beperkte kans op vervorming van het erytrocytenmembraan, en dus veranderingen van de celvorm.

De resultaten toonden aan dat, afhankelijk van de incubatietijd, de extracten van U, tomentosa een verschillende impact kunnen hebben op de vloeibaarheid van het plasmamembraan en de osmotische weerstand van erytrocyten.

Osmotische resistentie van erytrocyten is een parameter die de gevoeligheid van RBC's voor de werking van een hypotone omgeving aangeeft. Door blootstelling van de erytrocyten aan de isotone omgeving kan een kleine osmotische beweging van water in het celmembraan worden waargenomen, die het volume en de vorm van de cel niet verandert. In het geval van een hypotone omgeving komt water de cel binnen, waardoor het volume toeneemt en de vorm verandert van een twee-concave schijf in een bolvormige vorm. Cellen kunnen hun volume slechts tot op zekere hoogte vergroten. Verdere volumetoename resulteert in een verstoring van de celmembraanintegriteit en afgifte van celinhoud door osmotische Ivsis. 3 en 4), evenals veranderingen in de IC50-parameter werden waargenomen. Na 24- uur incubatie werd echter een grotere osmotische gevoeligheid van erytrocyten waargenomen en dus werd een toename van de ICso-waarde ten opzichte van de controle waargenomen (Figuur 3 en 4). Er werden sterkere effecten waargenomen na incubatie van erytrocyten met ethanolextracten in vergelijking met waterige extracten. Dit komt waarschijnlijk doordat ethanolextracten meer polyfenolverbindingen en tannines bevatten [17]. Vergelijkbare veranderingen (een toename van de IC50-waarde) na een langere incubatietijd (90 min bij 37 graden) van erytrocyten met catechinen werden waargenomen door Naparlo et al. [46]. Deze auteurs suggereerden dat catechines waarschijnlijk tijdens langdurige incubatie worden opgenomen door erytrocyten, wat kan leiden tot een toename van de osmolariteit van het inwendige van de cel, en dus gemakkelijker hemolyse in hypotone oplossingen vanwege een groter verschil in osmolariteit tussen het inwendige en uitwendige van de cel. De tweede verklaring voor dergelijke veranderingen was een suggestie dat catechinen ROS genereren tijdens langdurige incubatie, bijvoorbeeld waterstofperoxide, wat het erytrocytenmembraan kan beschadigen en de kwetsbaarheid, inclusief osmotische fragiliteit, kan vergroten.

Locatie van de verbindingen op het niveau van 5 koolstofatomen van de erytrocytenvetzuurketen resulteerde in een verhoogde osmotische gevoeligheid van deze cellen (verschuiving van osmotische weerstandscurves naar hogere NaCl-concentratiewaarden, toename van IC50-waarden). In eerdere experimenten van Bors et al. [17] onder isotone omstandigheden (0,9 procent NaCl) remden extracten van U.tomentosa de hemolyse die werd geïnduceerd door toxische stoffen, zoals 2,4-DCP en catechol. Deze onderzoekers toonden ook de beschermende rol aan van U. tomentosa-extracten tegen de oxidatieve werking van 2,4-DCP in menselijke erytrocyten, wat tot uiting komt in het verminderen van methemoglobine- en ROS-niveaus. Het uiteindelijke effect van de extracten in het lichaam is dus waarschijnlijk positief. In het in vivo systeem worden extracten van U. tomentosa (in lage concentraties) opgenomen in het membraan (zonder de structuur ervan te verstoren) en vertonen ze antioxiderende beschermende eigenschappen [12,47]. De resultaten van de onderzoeken bij ratten en bij gezonde vrijwilligers die U.tomentosa kregen, lieten geen veranderingen zien in het rode bloedcelmembraan of andere veranderingen in de erytrocyten, waardoor de mogelijkheid van voortijdige verwijdering van deze cellen uit de bloedsomloop werd uitgesloten [ 20,48].

We beweren dat de binding van polyfenolen aan het erytrocytenoppervlak verantwoordelijk kan zijn voor hun beschermende eigenschappen (waargenomen in eerdere studies). Polyfenolen, die het vaakst voorkomen in extracten van U.tomentosa, kunnen rechtstreeks interageren met biologische membranen, en ze werken ook als opruimers van vrije radicalen en remmers van lipideperoxidatie, waardoor de celweerstand tegen oxidatieve schade toeneemt. Dit werd bevestigd door het laatste onderzoek naar bioactieve membranen. Kim et al. [49] toegevoegd U. tomentosa-extract in het proces van nanogestructureerde alginaatmembraanformulering om de biologische activiteiten te verbeteren. De auteurs toonden aan dat membraanbevattende componenten van U. tomentosa een uitstekende antioxidantactiviteit bezaten, waarbij bijna 100 procent van het reductievermogen van vrije radicalen in 15 minuten werd aangetoond.

De beperking van deze studie is een gebrek aan evaluatie van het effect van geteste extracten op de vetzuursamenstelling in het erytrocytmembraan. Humaan erytrocytmembraan is samengesteld uit verzadigde vetzuren (palmitinezuur, stearinezuur), enkelvoudig onverzadigde vetzuren (palmitoleïnezuur, vacceenzuur, cis-oliezuur, trans-oliezuur), meervoudig onverzadigde vetzuren (cis-linolzuur, transinolzuur, linoleenzuur, eicosanoïde, eicosatrieenzuur, arachosatrienzuur) , en lange-keten N-3 meervoudig onverzadigde vetzuren (eicosapentaeenzuur, docosahexaeenzuur).

In deze studie werden de extracten echter toegepast op erytrocyten die waren verkregen van gezonde donoren. Er kan dus worden aangenomen dat de lipidensamenstelling van het erytrocytenmembraan typisch is voor normale cellen [26]. Omdat menselijke rijpe erytrocyten geen kern hebben, synthetiseren ze geen cellulaire componenten, waaronder vetzuren. Om deze reden mag de lipidensamenstelling niet veranderen in tegenstelling tot in vivo studies: bij plaveiselcelcarcinoom van de huid [26] of tijdens suppletie [50,51]. Het flip-flopproces, lipide-oxidatie, verandering van interacties in de lipidedomeinen en hun distributie zijn mogelijk, maar omdat lipidebiosynthese in erytrocyten niet plaatsvindt, is de kwalitatieve en kwantitatieve samenstelling van de erytrocytmembraanlipiden onder invloed van geteste extracten toegevoegd in vitro is zeer onwaarschijnlijk.

Samengevat, de extracten van U. tomentosa zijn voornamelijk tijdelijk opgenomen in het membraan, en precies in zijn buitenste monolaag. Bij zeer hoge concentraties kunnen ze echter dieper in het membraan doordringen en uiteindelijk de viscositeit van de erytrocyten veranderen. Op basis van de verkregen resultaten en literatuurgegevens zijn we van mening dat fysiologisch lage concentraties van de verbindingen in extracten van U.tomentosa zich in de buitenste monolaag van het celmembraan zullen bevinden en erytrocyten zullen beschermen tegen oxidatieve stress en schade.

4. Materialen en methoden

4.1. Chemicaliën

5-Doxylstearinezuur (5-DSA),16-doxylstearinezuur (16-DSA),4-hydroxy-2,2,6,{{ 8}}tetramethylpiperidine-1-oxyl(TEMPOL) werden gekocht bij Sigma-Aldrich, Saint Louis, MI, VS. Andere chemicaliën werden verkregen van Roth, Karlsruhe, Duitsland, en Avantor Performance Materials Poland, Gliwice, Polen.

4.2.Biologisch materiaal

4.2.1.Plant

De grondstof (schors en bladeren) van U. fomentosa afkomstig van Instituto Peruano de Investigaciones Fitoterapia Andina in Lima, Peru, werd vriendelijk geleverd door Wilcaccora

Lomianki Centrum, Polen. De algemene kenmerken van dit materiaal zijn eerder beschreven door Pilarski et al. [3].

De vouchermaterialen werden gedeponeerd bij het Laboratorium voor Fytochemie, Instituut voor Bioorganische Chemie, Poolse Academie van Wetenschappen, Poznan, Polen.

Bereiding van monsters: één gram van de grondstof (schors en bladeren) van U.tomentosa werd gedurende 8 uur geëxtraheerd met een volume van 10 ml water of 96 procent ethanol bij 37 graden. Vervolgens werden de extracten gedurende 15 minuten bij 4000 rpm gecentrifugeerd. Supernatanten werden verdampt met Speed-Vac tot droge massa en vervolgens gedroogd met P205. Onder deze omstandigheden was ongeveer 111 mg preparaat per gram bast en ongeveer 158 mg preparaat per gram bladeren in het geval van waterige extractie gedekt. Tijdens extractie met 96 procent ethanol werd 123 mg preparaat per gram bast en 158 mg preparaat per gram blad bereikt. Er werden vier extracten verkregen, dwz ethanolisch extract van de bast (Bet), waterig extract van de bast (Bag), ethanolisch extract van bladeren (Let), een waterig extract van bladeren (Lag). Bereidingen in poedervorm werden bewaard in een koelkast in goed gesloten containers, waaruit voorraadoplossingen werden bereid voor elk experiment [19].

De kwalitatieve en kwantitatieve samenstelling van oxindol-alkaloïden in U. tomentosa-extracten werd bepaald door middel van HPLC-vingerafdrukanalyse. De algemene kenmerken van de kwantitatieve alkaloïden van dit materiaal zijn eerder door ons beschreven in de publicatie van Bors et al. [18].

Uncarine F, speciophylline, mitraphylline, pteropodine / isomitraphylline en isopteropo-dine werden gedetecteerd in U.tomentosa-extracten. Mitraphylline en pteropodine/isomitraphylline zijn alkaloïden, die dominant zijn in bladextracten, terwijl pteropodine/isomitrafylline dominant zijn in bastextracten. Ethanolische extracten werden gekenmerkt door een hoger alkaloïdegehalte dan waterige extracten (Figuur 5).

De algemene kenmerken van de kwantitatieve bepaling van polyfenolen in extracten van U. tomentosa zijn eerder door ons beschreven [17]. HPLC/DAD-analyse onthulde dat ethanolische en waterige extracten van bast voornamelijk Procyanidin B2 en C1 bevatten, evenals (-)-epicatechine. Cafeïnezuurderivaten werden alleen bepaald in waterige extracten van bladeren, terwijl chlorogeenzuur, flavonolen en polymere proanthocyanidinen in alle bestudeerde extracten aanwezig waren. De hoogste totale concentraties vrije fenolen werden bepaald in de ethanolische extracten van de bast. Het hoge gehalte aan fenolische verbindingen werd ook gedetecteerd in het ethanolische extract van bladeren, terwijl een lagere fenolische concentratie werd gedetecteerd in een waterig extract van de schors en ethanolische extracten van bladeren (Figuur 6).

Tenslotte werden alle extracten opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO). De verkregen oplossing werd toegevoegd in een klein volume van 1 L tot 1 ml erytrocytensuspensie. ADMSO-concentratie had geen invloed op het celmembraan). De erytrocyten die alleen met DMSO waren aangevuld, werden als controles gebruikt.

4.2.2.Isolatie van erytrocyten

Een leukocyt-buffy coat werd verkregen uit bloed verzameld in de Bloedbank in Lodz, Polen. De leucocyt-buffy coat werd gecentrifugeerd (3000 rpm gedurende 10 min bij 4 graden) en tweemaal gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4).

Geïsoleerde erytrocyten gesuspendeerd in PBS werden 2, 5 en 24 uur geïncubeerd met vier soorten extracten (ethanolische en waterige extracten van de schors en ethanolische en waterige extracten van de bladeren） in concentraties van 100 ug/ml, 250 ug/ml en 500 ug/ml Eerdere studies hebben aangetoond dat de bestudeerde extracten bij deze concentraties geen schade aan erytrocyten veroorzaakten, terwijl ze een beschermend effect vertoonden op RBC's [17,19,22].

4.3. Membraanvloeibaarheid

De vloeibaarheid van het erytrocytmembraan werd bepaald door middel van elektronenparamagnetische resonantie (EPR) spectroscopie (Brucker 300 Spectrometer, Duitsland) met behulp van 5-doxylstearinezuur (5-DSA) en 16-doxylstearinezuur ( 16-DSA)spinlabels. Uit de EPR-spectra verkregen voor het 5-DSA-spinlabel, werd de ordeningsparameter S berekend. De correlatietijden TB en TC werden berekend uit de EPR-spectra verkregen voor het 16-DSA-spinlabel. Zowel de ordeningsparameter Sa als de correlatietijden TB en tc tonen de inverse correlatie met membraanfluïditeit. Bestelparameter S en de correlatietijden tB en tc werden berekend zoals beschreven in de studie van Koter et al. [52].

4.4.Interne viscositeit van rode bloedcellen

Het TEMPOL spin-label werd gebruikt om de interne viscositeit van de erytrocyten te bepalen [53]. TEMPOL-oplossing (20 mM) opgelost in gebufferde zoutoplossing (PBS) werd toegevoegd aan de erytrocytensuspensie met 50 procent hematocriet. Na een incubatie van 30-min. werden de erytrocyten driemaal gewassen met 80 mM K3Fe(CN6-oplossing) om het signaal van het spin-label in de intercellulaire ruimte te verminderen. Gebaseerd op het spectrum verkregen voor TEMPOL in water en in erytrocyten , werd de rotatiecorrelatietijd bepaald volgens de formule:

-(2)"-1

(1)

waarbij: k—constante voor het nitroxide-spinlabel, k=6.5×10-9s mT-l, ho—de hoogte van de middellijn, h_1—hoogte van de hoge- veldlijn, Wo - middellijnbreedte.

De relatieve viscositeit werd bepaald met de formule:

TR

_C

(2)"1 B

waarbij: TR-rotatiecorrelatietijd van de marker in erytrocyten, TB-rotatiecorrelatietijd van de marker in PBS, c-interne viscositeit van erytrocyten, 1B-PBS-viscositeit (waarde 1 werd aangenomen).

4.5. Osmotische kwetsbaarheid

Na incubatie van de erytrocyten met extracten van U. tomentosa, werden de cellen gecentrifugeerd bij 3000rpm gedurende 10 minuten bij 4 graden. De cellen werden vervolgens gewassen met 0,9 procent NaCl-oplossing. Deze stap werd twee keer herhaald. Na verwijdering van het supernatant werden RBC's gesuspendeerd in een NaCl-oplossing in het concentratiebereik van 0,2 tot 0,9 procent (15 punten werden geselecteerd). De cellen werden 30 min bij 37°C geïncubeerd en vervolgens 10 min bij 4°C bij 3000 rpm gecentrifugeerd. De optische dichtheid van het supernatant werd gemeten bij 540 nm (Adobe) met behulp van een microplaatabsorptielezer (BioTek Elx808, BIOTEK).

Hemolyse in elke buis werd uitgedrukt als een percentage, waarbij hemolyse in gedestilleerd water werd genomen als 100 procent (A100 procent):

×100 (3)

Hemolysepercentage ( procent o)= Aole

A100

4.6. Statistische analyse

De resultaten werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD bereikt van 4 tot 6 individuele experimenten (4-6 bloeddonoren), terwijl voor elk individu (donor) het experimentele punt een gemiddelde waarde was van 2-3 replicaties. Meerdere vergelijkingen tussen de gemiddelde verschillen tussen groepen werden geanalyseerd door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door een Tukey post hoc-test. De verschillen werden als statistisch significant beschouwd voor p<0.05. all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" statistica="" software(statsoft,="" inc,="" tulsa,="" va,="">

Referenties

1. de Azevedo, BC; Roxo, M.; Borges, MC; Peixoto, H.; Crevelin, EJ; Bertoni, BW; Contini, SH; Lopes, AA; França, SC; Pereira, AM; et al. Antioxiderende activiteit van een waterig bladextract van Uncaria tomentosa en zijn belangrijkste alkaloïden Mitra-phylline en isomitraphylline in Caenorhabditis elegans. Moleculen 2019, 24, 3299. [CrossRef]

2. Navarro, M.; Arnaez, E.; Moreira, ik.; Hurtado, A.; Monge, D.; Monagas, M. Polyfenolische samenstelling en antioxidantactiviteit van commerciële schorsproducten van Uncaria tomentosa. Antioxidanten 2019, 8, 339. [CrossRef]

3. Pilarski, R.; Zieli'nski, H.; Ciesiołka, D.; Gulewicz, K. Antioxiderende activiteit van ethanolische en waterige extracten van Uncaria tomentosa (Willd.) DC. J. Ethnopharmacol. 2006, 104, 18-23. [Kruisref]

4. Santo, GD; Grot, A.; Boligon, AA; Da Costa, B.; Rambo, CL; Fantini, EA; Sauer, E.; Lazzarotto, LMV; Bertoncello, KT; Junior, OT; et al. Beschermend effect van Uncaria tomentosa-extract tegen oxidatieve stress en genotoxiciteit veroorzaakt door glyfosaat Roundup met de zebravis (Danio rerio) als model. omgeving. Wetenschap. Vervuiling. Onderzoek Int. 2018, 25, 11703-11715. [Kruisref]

5. Allen-Hall, L.; Arnason, JT; Kano, P.; Lafrenie, RM Uncaria tomentosa werkt als een krachtige TNF-alfa-remmer via NF-kappaB. J. Ethnopharmacol. 2010, 127, 685-693. [Kruisref]

6. Elgawish, RA; Abdelrazek, HMA; Ismail, SAA; Loutfy, NM; Soliman, MTA Hepatoprotectieve activiteit van Uncaria tomentosa-extract tegen subchronische blootstelling aan fipronil bij mannelijke ratten. omgeving. Wetenschap. Vervuiling. Onderzoek Int. 2019, 26, 199-207. [Kruisref]

7. Ciani, F.; Tafuri, S.; Troiano, A.; Cimmino, A.; Fioretto, BS; Guarino, AM; Pollice, A.; Vivo, M.; Evidente, A.; Carotenuto, D.; et al. Anti-proliferatieve en pro-apoptotische effecten van Uncaria tomentosa waterig extract in plaveiselcarcinoomcellen. J. Ethnopharmacol. 2018, 211, 285-294. [Kruisref]

8. Zari, A.; Alfarteesh, H.; Buckner, C.; Lafreniere, RM Behandeling met Uncaria tomentosa bevordert apoptose in B16-BL6-muizenmelanoomcellen en remt de groei van B16-BL6-tumoren. Moleculen 2021, 26, 1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Kosmider, A.; Czepielewska, E.; Kura's, M.; Gulewicz, K.; Pietrzak, W.; Nowak, R.; Nowicka, G. Uncaria tomentosa Leaves Decoction moduleert anders ROS-productie in kanker en normale cellen en effecten Cisplatine-cytotoxiciteit. Moleculen 2017, 22, 620. [CrossRef] [PubMed]

10. Almeida, IV; Soares, LC; Lucio, FT; Cantagalli, LB; Hergebruik, AF; Vicentini, VEP Chemotherapeutische effecten van het kruidengeneesmiddel Uncaria tomentosa (Willd.) DC. Genet. Mol. Onderzoek 2017, 16. [CrossRef] [PubMed]

11. Caon, T.; Kaiser, S.; Feltrin, C.; de Carvalho, A.; Oprecht, TCM; Ortega, GG; Simões, GMO Antimutagene en antiherpetische activiteiten van verschillende preparaten van Uncaria tomentosa (kattenklauw). Voedsel Chem. Toxicol. 2014, 66, 30-35. [CrossRef] [PubMed]

12. Batiha, GE-S.; Magdy Beshbishy, ​​A.; Wasef, L.; Elewa, YHA; Abd El-Hack, ME; Taha, AE; Al-Sagheer, AA; Devkota, HP; Tufarelli, V. Uncaria tomentosa (Willd. ex Schult.) DC.: Een overzicht van chemische bestanddelen en biologische activiteiten. toepassing Wetenschap. 2020, 10, 2668. [CrossRef]

13. Santos Araújo, MdC; Farias, IL; Gutierres, J.; Dalmora, SL; Flores, N.; Farias, J.; de Cruz, I.; Chiesa, J.; Morsch, VM; Chitolina Schetinger, MR Uncaria tomentosa-adjuvante behandeling voor borstkanker: klinische proef. Evid. Gebaseerd complement. alternatief. Med. 2012, 2012, 676984. [CrossRef]

14. Navarro Hoyos, M.; Sánchez-Patán, F.; Murillo Masis, R.; Martín-Álvarez, PJ; Zamora Ramirez, W.; Monagas, MJ; Bartolomé, B. Phenolic Beoordeling van Uncaria tomentosa L. (Cat's Claw): bladeren, stengel, schors en houtextracten. Moleculen 2015, 20, 22703-22717. [Kruisref]

15. Farias, I.; do Carmo Araújo, M.; Zimmermann, ES; Dalmora, SL; Benedetti, AL; Alvarez-Silva, M.; Asbahr, ACC; Bertol, G.; Farias, J.; Schetinger, MRC Uncaria tomentosa stimuleert de proliferatie van myeloïde voorlopercellen. J. Ethnopharmacol. 2011, 137, 856–863. [CrossRef] [PubMed]

16. Yunis-Aguinaga, J.; Claudiano, GS; Marcusso, PF; Manrique, WG; de Moraes, JRE; de Moraes, FR; Fernandes, JBK Uncaria tomentosa verhoogt de groei en immuunactiviteit in Oreochromis niloticus die is uitgedaagd met Streptococcus agalactiae. Vis. Schelpdieren Immunol. 2015, 47, 630-638. [CrossRef] [PubMed]

17. Bors, M.; Bukowska, B.; Pilarski, R.; Gulewicz, K.; Oszmia 'nski, J.; Michałowicz, J.; Koter-Michalak, M. Beschermende activiteit van de Uncaria tomentosa-extracten op menselijke erytrocyten bij oxidatieve stress veroorzaakt door 2,4-dichloorfenol (2,4-DCP) en catechol. Voedsel Chem. Toxicol. 2011, 49, 2202-2211. [Kruisref]

18. Bors, M.; Michałowicz, J.; Pilarski, R.; Sici'nska, P.; Gulewicz, K.; Bukowska, B. Studies van biologische eigenschappen van Uncaria tomentosa-extracten op mononucleaire bloedcellen van menselijk bloed. J. Ethnopharmacol. 2012, 142, 669-678. [Kruisref]

19. Bors, M.; Sici'nska, P.; Michałowicz, J.; Wieteska, P.; Gulewicz, K.; Bukowska, B. Evaluatie van het effect van Uncaria tomentosa-extracten op de grootte en vorm van menselijke erytrocyten (in vitro). omgeving. Toxicol. Pharmacol. 2012, 33, 127-134. [CrossRef] [PubMed]