Abstract

Invoering: Propolis is een harsachtige natuurlijke substantie die door honingbijen wordt verzameld uit knoppen en exsudaten van verschillende bomen en planten; het is algemeen aanvaard dat de samenstelling van propolis afhangt van de fytogeografische kenmerken van de verzamelplaats.

Glycoside van cistanche kan ook de activiteit van SOD in hart- en leverweefsels verhogen en het gehalte aan lipofuscine en MDA in elk weefsel aanzienlijk verminderen, waardoor verschillende reactieve zuurstofradicalen (OH-, H₂O₂, enz.) door OH-radicalen. Cistanche-fenylethanoïdeglycosiden hebben een sterk wegvangend vermogen van vrije radicalen, een hoger reducerend vermogen dan vitamine C, verbeteren de activiteit van SOD in spermasuspensie, verminderen het gehalte aan MDA en hebben een zeker beschermend effect op de functie van het spermamembraan. Cistanche-polysacchariden kunnen de activiteit van SOD en GSH-Px in erytrocyten en longweefsels van experimenteel senescente muizen veroorzaakt door D-galactose verbeteren, evenals het gehalte aan MDA en collageen in long en plasma verminderen en het gehalte aan elastine verhogen, hebben een goed wegvangend effect op DPPH, verlengt de tijd van hypoxie bij senescente muizen, verbetert de activiteit van SOD in serum en vertraagt ​​​​de fysiologische degeneratie van de longen bij experimenteel senescente muizen Met cellulaire morfologische degeneratie hebben experimenten aangetoond dat Cistanche het goede antioxiderende vermogen heeft en heeft het potentieel om een ​​medicijn te zijn om huidverouderingsziekten te voorkomen en te behandelen. Tegelijkertijd heeft echinacoside in Cistanche een aanzienlijk vermogen om DPPH-vrije radicalen op te vangen en reactieve zuurstofsoorten op te vangen, door vrije radicalen veroorzaakte collageenafbraak te voorkomen en heeft het ook een goed herstellend effect op anionschade door vrije radicalen van thymine.

Klik op Cistanche Tubulosa-supplement

【Voor meer info: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Doelstellingen: Deze studie was gericht op het bepalen van de fytochemische samenstelling van ethanolische extracten van acht propolis-batches verzameld in verschillende regio's van Benin (noord, midden en zuid) en Congo, Afrika.

Materiaal en methoden:Karakterisering van propolismonsters werd uitgevoerd met behulp van verschillende gekoppelde chromatografische methoden in combinatie met koolstof-13 kernmagnetische resonantie (13C NMR) dereplicatie met MixONat-software. Hun antioxiderende of anti-geavanceerde glycatie-eindproduct (anti-AGE) activiteit werd vervolgens geëvalueerd met behulp van respectievelijk difenylpicrylhydrazyl- en runderserumalbumine-assays.

Resultaten: Chromatografische analyses gecombineerd met 13C NMR-dereplicatie toonden aan dat twee monsters uit het centrum van Benin, naast een enorme hoeveelheid pentacyclische triterpenen, gemethoxyleerde stilbenoïden of fenanthrenen vertoonden, verantwoordelijk voor de antioxiderende werking van het extract voor de eerste. Onder hen kan combretastatine cytotoxisch zijn. Voor de tweede waren de geprenyleerde flavanonen die bekend zijn in propolis van het Macaranga-type verantwoordelijk voor hun significante anti-AGE-activiteit. Het monster uit Congo was samengesteld uit vele triterpeenderivaten die behoren tot de soort Mangifera indica.

Conclusie: Daarom lijkt propolis uit het centrum van Benin bijzonder interessant vanwege zijn antioxiderende en anti-AGE-eigenschappen. Desalniettemin, aangezien de standaardisatie van propolis moeilijk is in tropische zones vanwege de grote diversiteit aan chemotherapie, is een systematische fytochemische analyse vereist voordat het gebruik van propolis in voedsel en gezondheidsproducten in Afrika wordt bevorderd.

SLEUTELWOORDEN

13C NMR-dereplicatie, gemethoxyleerde stilbenoïden of fenanthrenen, pentacyclische triterpenen, geprenyleerde flavanonen, propolis

1. INLEIDING

Propolis is een natuurlijke harsachtige substantie die door bijen wordt verzameld uit de knoppen en exsudaten van verschillende bomen en planten, vermengd met bijenwas en speekselenzymen.1 Het wordt door bijen gebruikt om de ingang te beschermen tegen indringers, pluggaten, gladde binnenmuren, mummificatie van dode dieren (kleine insecten) in de korf, en brengen extreme vochtigheid of droogte in evenwicht.2,3 Propolis wordt al sinds de oudheid veel gebruikt in de volksgeneeskunde vanwege het brede scala aan therapeutische eigenschappen.4 Propolis bestaat over het algemeen uit hars (50 procent) , was (30 procent), oliën (10 procent), pollen (5 procent) en extra fenolische verbindingen zoals flavonoïden.5,6 De chemische samenstelling van propolis staat bekend als complex en varieert afhankelijk van de plantensoort die rond de korf groeit , waaruit bijen exsudaten verzamelen.7 Er wordt aangenomen dat verschillende factoren, zoals de floristische samenstelling van het gebied, de plaats en het tijdstip van verzamelen, het seizoen, het type collector, de beschikbaarheid en hoogte, en de voedselactiviteit zich ontwikkelden tijdens de exploitatie van de propolis heeft invloed op de chemische samenstelling van de propolis.8,9 Er zijn verschillende soorten propolis, afhankelijk van het geografische productiegebied, de botanische bron en de chemische samenstelling. De meest voorkomende soorten propolis zijn gematigde, berken, tropische, mediterrane en Stille Oceaan.10 Propolis uit gematigde klimaatzones, zoals Europa, Noord-Amerika of niet-tropische regio's van Azië, is voornamelijk afkomstig van exsudaten van knoppen van Populus-soorten ( Salicaceae) en is daarom rijk aan flavonoïden en fenolzuren en hun esters; tropische propolis, afkomstig uit regio's waar noch populier noch berk groeit, is echter rijk aan geprenyleerde derivaten van p-coumarinezuren, benzofenonen of terpenoïden.11 Pacifische propolis, doorgaans rijk aan geprenyleerde flavanonen, is een ander belangrijk type propolis dat in Taiwan wordt aangetroffen. , Japan en de Salomonseilanden, en berkenpropolis komt specifiek voor in Rusland.12 De studie van propolis uit tropisch Azië heeft geleid tot de ontdekking van Macaranga denarius L. en Mangifera indica L. als plantaardige bronnen van Indonesische propolis.13 aan de andere kant zijn naaldhoutsoorten van de Cupressaceae-familie de belangrijkste botanische bron van propolis in mediterrane regio's.14 Chemische analyses onthulden dat propolis meer dan 300 verschillende natuurlijke producten (NP's) bevat, waaronder fenolzuurderivaten, coumarines, flavonoïden, sesquiterpenen, diterpenen, triterpenen, steroïden, lignanen of geprenyleerde benzofenonen.15 De biologische effecten van propolis zijn voornamelijk beschreven over niet alleen hun antioxidant,16-18 anti-AGE (dwz remming van de vorming van geavanceerde glycatie-eindproducten [AGE]),19 - ontstekingsremmende,20 en antitumorale effecten,21-23 maar ook hun antibacteriële,24-26 antischimmel-,15 antivirale,27 en antiparasitaire28 activiteiten. Propolis staat er ook om bekend de aanmaak van antilichamen te stimuleren, wat suggereert dat het potentieel gebruikt kan worden als adjuvans in vaccins.29 Het toenemende gebruik van deze natuurlijke stof met een gediversifieerde samenstelling en daardoor variërende biologische activiteiten in de farmaceutische, cosmetische en voedingsindustrie wekt bijzondere belangstelling in wetenschappelijk onderzoek, vooral als het gaat om het bepalen van de chemische samenstelling. De meeste onderzoeken zijn uitgevoerd op monsters uit Europa19,30–33 en Latijns-Amerika, meer specifiek Brazilië20,23,34–36, terwijl er weinig studies zijn uitgevoerd in Afrika.37–41 Informatie over Beninese en Congolese42 propolis blijft schaars.

Deze studie was dus gericht op het karakteriseren van belangrijke verbindingen uit propolismonsters verzameld in verschillende fytogeografische zones van Benin en Congo (Afrika) met behulp van 13C nucleaire magnetische resonantie (NMR) dereplicatie met MixONat-software.43,44 Een voorstudie met behulp van een database (DB) met Eerder gerapporteerde NP's van propolis samen met hun 13C voorspelde chemische verschuivingen (δC) leverden geen bruikbare gegevens op in vergelijking met de bevredigende resultaten die gewoonlijk worden verkregen met plantenextracten.43-45 Dit kan worden verklaard door de chemische samenstelling van propolis, die sterk afhankelijk is op de lokale flora, waardoor het onmogelijk is om een ​​chemotaxonomische DB te construeren. Om de belangrijkste verbindingen uit Beninese en Congolese propolis te ontcijferen, hebben we in het huidige werk dus krachtige vloeistofchromatografie uitgevoerd in combinatie met ultraviolette en verdampingslichtverstrooiingsdetectiemassaspectrometrie (HPLC-UV-ELSD-MS) en gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie ( GC-MS)-analyses op ruwe propolis-extracten om hun belangrijkste structurele kenmerken te identificeren en overeenkomstige DB's van NP's te bouwen die geschikt zijn voor MixONat-software.46 Vervolgens, na een grove fractionering van de propolis-monsters geselecteerd op basis van hun chemisch profiel, werd op 13C NMR gebaseerde dereplicatie toegestaan de identificatie van belangrijke NP's zonder verdere zuivering. Antioxidant- en anti-AGE-assays werden ook uitgevoerd.

2. EXPERIMENTELE PROCEDURES

2.1 Chemicaliën

1,1-Difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Folin-Ciocalteu-reagens, mierenzuur en galluszuur, allemaal van analytische kwaliteit, werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Frankrijk). 6-Hydroxy-2,- 5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonzuur (Trolox®) en 50 - caffeoylquinic acid (chlorogeenzuur) waren verkregen van Acros Organics (Geel, België).

2.2 Propolis-monsters

Acht Beninese propolismonsters werden verzameld door schrapen uit bijenkorven in drie fytogeografische zones (Tabel 1 en Figuur SI-1). Een monster van Congolese propolis werd verzameld in het kunstmatige bos van acaciabomen op het Bateke-plateau in het centrum van de Republiek Congo (tabel 1).

2.3 Propolis-extractie

Ethanolische extracten van propolis (EEP's) werden aanvankelijk bereid met behulp van het volgende extractieprotocol.19 Ruwe propolis werd eerst homogeen verpulverd in aanwezigheid van vloeibare stikstof. Voor alle monsters werd 1 g propolispoeder gemacereerd in 20 ml 95 procent EtOH. Na 2 uur roeren bij kamertemperatuur werd het mengsel gefilterd met behulp van een gesinterde glazen schijftrechterfilter (16-40 μm poriegrootte). Het residu werd tweemaal opnieuw geëxtraheerd met dezelfde stappen. Vervolgens werden de drie verzamelde filtraten een nacht op 18°C ​​gehouden, gefiltreerd om wassen te verwijderen en onder verlaagde druk (40°C, 10 bar) ingedampt om de EEP's op te leveren.

Hoeveelheden van 8,0 g propolispoeder van BC1 (1) en BC2 (2) of 10,3 g CG (3) werden opnieuw geëxtraheerd met EtOH 95 procent (UAE, 4 - 80 ml, 15 min) voor verdere flitschromatografie.

2.4 Bepaling van het totale fenolgehalte

Het totale fenolgehalte werd bepaald via de Folin-Ciocalteu colorimetrische methode zoals eerder beschreven,19 en onlangs aangepast voor direct gebruik in microplaten. In het kort: 10 µl van elk propolis-extract in MeOH (3,5 mg/ml voor BC1, 5 mg/ml voor BN2, BC2 en CG, 7,5 mg/ml voor BN1, BS1a, BS1b en BS2, en 10 mg/ml voor BS3) werd gemengd met 20 µl gedestilleerd water en 10 µl Folin-Ciocalteu-reagens in een 96-well microplaat. Na 3 minuten werden 120 µl gedestilleerd water en 40 µl 20% waterig natriumcarbonaat toegevoegd. De absorptie werd gemeten op een TECAN® microplaat spectrofotometer (V6.5) bij 760 nm na 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Op dezelfde manier werd een blanco gemaakt door MeOH te gebruiken in plaats van de extractoplossing en galluszuur werd gebruikt om de kalibratiecurve te berekenen (0,04–0,328 mg/ml; y=2.7241x 0,0039; r2=0 .9982). Elk monster werd in drievoud geanalyseerd. Het totale fenolgehalte werd uitgedrukt in galluszuurequivalenten (mg) per gram extract (mg GAE/g).

2.5 Voorafgaande chromatografische analyses

2.5.1 Analytische TLC

Analytische dunnelaagchromatografie (TLC) werd uitgevoerd op een TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland), met een mengsel van cyclohexaan:AcOEt als elutiemiddel. Vlekken in het chromatogram werden eerst zichtbaar gemaakt onder UV-licht (254 nm) en vervolgens door te besproeien met vanilline-zwavelzuurreagens (2 ml geconcentreerd zwavelzuur in 98 ml van een 1:99 w/v vanilline:95 procent ethanoloplossing) en verwarming van de chromatogrammen tot 110 graden C gedurende 5 minuten.

2.5.2 GC-MS-procedure

GC-MS-analyse werd uitgevoerd op niet-gederivatiseerde monsters met behulp van een Shimadzu-gaschromatograaf GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Frankrijk) met een ionisatiespanning van 70 eV (Electronic Invloed). Monsters werden bereid in dichloormethaan (DCM) bij 2 mg/ml voor extracten en 1 mg/ml voor fracties. Scheidingen werden uitgevoerd met behulp van een Phenomenex ZB5-kolom (30 m * 0,250 mm inwendige diameter met 0,25 mm filmdikte; Phenomenex, Le Pecq, Frankrijk). De temperatuur was als volgt geprogrammeerd: 180 graden C (3 min), 180-280 graden C met een snelheid van 10 C/min en 280 graden C (27 min). Als draaggas werd helium gebruikt met een stroomsnelheid van 2,0 ml/min. Injector- en detectortemperaturen werden ingesteld op respectievelijk 250 °C en 280 °C. Metabolieten werden geïdentificeerd door hun retentietijden (Rt), nominale massa en/of fragmentatiepatronen te vergelijken met die van authentieke monsters en/of die in de fragmentatiepatroonbibliotheken van de apparatuur (NIST11, NIST11s en FFNSC2).

2.5.3 HPLC-DAD-ELSD-procedure

Chromatografische analyses werden uitgevoerd met behulp van een Shimadzu 2030C 3D-vloeistofchromatograaf (Noisiel, Frankrijk) uitgerust met een diode-arraydetector (DAD) en een ELSD (Sedere®) met een Lichrospher® kolom 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Duitsland ) beschermd met een Lichrocart® 4–4 beschermpatroon (4 mm*4 mm id), met een stroomsnelheid van 1 ml/min. De mobiele fase bestond uit 0,1 procent mierenzuur in water (oplosmiddel A) en methanol (oplosmiddel B) en de scheiding werd uitgevoerd met de volgende lineaire gradiënt: 25-100 procent B (0-40 min), 100 procent (40-45 minuten). UV-vis-spectra werden geregistreerd in het bereik van 190-600 nm en chromatogrammen werden verkregen bij 254 en 280 nm. ELSD werd verwarmd op 30rangC, en een versterking van 4 werd toegepast op het signaal. Monsters werden bereid met een concentratie van 10 mg/ml in MeOH en gecentrifugeerd bij 13,{3} g gedurende 10 min vóór injectie (10 µl) om sporen van gesuspendeerde materialen te verwijderen.

2.5.4 HPLC-UV-MS-procedure

HPLC-UV-MS-analyses werden uitgevoerd met behulp van een 2795 Waters-scheidingsmodule (Guyancourt, Frankrijk) uitgerust met een Dual A 2487 Waters-detector. Kolom, mobiele fasen en gradiënt waren hetzelfde als hierboven beschreven voor HPLC-DAD-ELSD. Chromatogrammen werden verkregen bij 254 en 280 nm. De massaanalyses werden uitgevoerd op een Bruker (Bremen, Duitsland) elektrospray-ionisatie/chemische ionisatie onder atmosferische druk (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plus in zowel positieve als negatieve modi als volgt: botsingsgas, He; botsingsenergieamplitude, 1,3 V; vernevelaar en drooggas, N2, 7 L/min; de druk van het vernevelgas, 30 psi; droge temperatuur, 340 C; stroomsnelheid, 1,0 ml/min; oplosmiddelsplitsingsverhouding, 1:9; scanbereik, m/z 100–1,000. Monsters werden bereid met een concentratie van 10 mg/ml in MeOH, gecentrifugeerd bij 13.000 g gedurende 10 minuten en gefilterd door een 0,{27}}μm polytetrafluorethyleen (PTFE) membraanspuitfilter vóór injectie (20 µl) om sporen te verwijderen van zwevende stoffen.

2.6 EEP-fractionering door flitschromatografie

Eerst werd 3,8 g BC1 (1), 3,5 g BC2 (2) of 4,0 g CG (3) EEP's opgelost in een minimaal volume DCM en aceton en gemengd met silicagel (silica verhouding gel:extract, 2:1). Bij alle liet men het oplosmiddel verdampen totdat een fijn droog poeder was verkregen. Voor elke EEP werd vervolgens fractionering uitgevoerd met behulp van een CombiFlash Teledyne ISCO-apparaat (Lincoln, NE, VS) met een silicagelkolom (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Frankrijk) bij een stroomsnelheid van 25 ml/min met cyclohexaan (oplosmiddel A) en ethylacetaat (EtOAc) (oplosmiddel B) met behulp van de volgende gradiëntelutie: (1) voor BC1 EEP, 5 procent B (0–10 min), 5–20 procent B (10–30 min), 20–30 procent B (30–60 min), 30–50 procent B (60–85 min) en 50–100 procent B (85–110 minuten); 160 buisjes van 20 ml werden verzameld en gecombineerd tot 14 fracties (BC1_F1 tot BC1_F14) op basis van hun TLC-chromatografische profielen (cyclohexaan:EtOAc-verhouding, 90:10 tot 50:50 ); (2) voor BC2 EEP, 5 procent B (0-10 min), 5-10 procent B (10-20 min), 10-30 procent B (20-40 min), 30-40 procent B (40-55 min) en 40-100 procent B (55-70 min); 100 buisjes van 20 ml werden verzameld en samengevoegd tot 8 fracties (BC2_F1 tot BC2_F8) op basis van hun TLC-chromatografische profielen (cyclohexaan:EtOAc-verhouding, 90:10 tot 60:40 ); (3) voor CG EEP, 5 procent B (0-10 min), 5-10 procent B (10-30 min), 10-20 procent B (30-50 min), 20-40 procent B (50-70 min), 40-60 procent B (70-80 min) en 60-100 procent B (80-90 min); Er werden 135 buisjes van 20 ml verzameld en gecombineerd tot 23 fracties (CG_F1 tot CG_F23) op basis van hun TLC-chromatografische profielen (cyclohexaan:EtOAc-verhouding, 80:20 tot 60:40 ).

Er werd een extra fractioneringsstap uitgevoerd op de BC{0}}F7-fractie: 200 mg werd opgelost in een minimaal volume MeOH en gemengd met C18-silicagel (C18-silicagel verhouding gel:extract, 2:1). Scheiding werd gerealiseerd op een C18-kolom (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Frankrijk) met een stroomsnelheid van 15 ml/min met water (oplosmiddel A) en MeOH (oplosmiddel B) met behulp van de volgende gradiëntelutie: 50– 70 procent B (0-30 min) en 70-100 procent B (30-40 min); Er werden 80 buisjes van 8 ml verzameld en gecombineerd tot 5 fracties (BC2_F7-1 tot BC2_F7-5) op basis van hun HPLC-UV (280 nm) profielen .

2.7 1 H- en 13C-NMR-analyses

NMR-spectra (1D en 2D) van propolisfracties (7-58 mg) of soms NP's werden geregistreerd in gedeutereerde chloroform (CDC13) of gedeutereerde methanol (CD3OD) (500 ul) op een JEOL NMR-spectrometer bij 400 MHz gedurende 1 uur en 100 minuten. MHz voor 13C. NMR-experimenten (1H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 en 2D NMR) op fracties en zuivere NP's werden uitgevoerd bij 298 K op een JEOL 400 MHz H spectrometer (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, Frankrijk) uitgerust met een omgekeerde 5-mm-sonde (ROYAL RO5). Chemische verschuivingen (δH en δC) worden uitgedrukt in ppm en J-waarden in Hz.

Voor 13C NMR (100 MHz) spectra werd een WALTZ-16 ontkoppelingssequentie gebruikt met een acquisitietijd van 1,04 s (32.768 complexe datapunten) en een relaxatievertraging van 2 s. Er zijn tussen de 1500 en 11000 scans verzameld om een ​​bevredigende S/N-verhouding te verkrijgen. Een 1 Hz exponentieel lijnverbredingsfilter werd toegepast op elk vrij inductieverval (FID) vóór de Fourier-transformatie. Spectra werden handmatig gefaseerd en basislijn gecorrigeerd met behulp van MestReNova-software (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Spanje) en verwezen naar de centrale resonantie van het gedeutereerde oplosmiddel bij δC 77,16 ppm (CDC13) en δC 49,00 ppm (CD3OD). Voor vervormingsvrije verbetering door polarisatieoverdracht (DEPT) experimenten waren tussen de 512 en 5.500 scans nodig en werden uitlijningen met de 13C-spectra gemaakt met behulp van een gegeven δC. Vervolgens werd een minimale intensiteitsdrempel gebruikt om handmatig positieve 13C NMR- en DEPT-90-signalen en positieve en negatieve DEPT-135-signalen te verzamelen terwijl mogelijke ruisartefacten werden vermeden.

Propolis DB1 werd voor het eerst gebouwd door te zoeken naar verbindingen beschreven in propolis op SciFindern, 47 resulterend in een DB van 1.471 NP's; δC-waarden werden voorspeld met behulp van Advanced Chemistry Development (ACD) NMR-voorspellers (C, H). Van dergelijke DB's die NP's bevatten samen met hun δC-SDF-waarden, creëerde de CTypeGen-routine in MixONat een geschikte DB: het las het ruimtelijke gegevensbestand (SDF) en sorteerde chemische verschuivingen op koolstoftype. Vervolgens werd het vereiste c-type SDF gemaakt, namelijk c-type Propolis DB1.43,44

Stilbenoïden_Phenanthrenoïden DB2 is gemaakt. Een zoekopdracht naar stoffen met de trefwoorden stilbenoïden en fenanthrenen in de LOTUS DB met 276.518 NP's48 (LOTUS, 2022) maakte het mogelijk om een ​​Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 van 2.681 NP's als SDF te verkrijgen. Vervolgens werd Flavanones DB3 gemaakt: een zoekopdracht op SciFindern47 met behulp van de 2-fenylchroman-4-één substructuur mocht selecteren uit 56.679 moleculen. Ze werden verder teruggebracht tot 2.893 verwijzend naar "Voorkomen van natuurlijke producten" met behulp van een analyse van de stoffen met het filter "Referentierol", voorgesteld door SciFindern. Na aanvullende verfijning door een filterstap op basis van het verwachte molecuulgewicht (MW) (dwz 340 tot 424 Da), werden alle relevante flavanonen vervolgens geëxporteerd als een SDF om de NP's van Flavanones DB3 (684 NP's) te verkrijgen. Voor elke NP's van DB2 en DB3 werden δC-SDF-waarden voorspeld met behulp van ACD NMR-voorspellers (C, H) -software en de eerder door Nuzillard beschreven methodologie om de c-type SDF direct klaar voor gebruik door MixONat te verkrijgen. De laatste bevat voor elke verbinding van de DB de voorspelde δC-waarden, georganiseerd als methyl-, methyleen-, methine- of quaternaire koolstofatomen.

Triterpenen DB4 is gebouwd op basis van de PNMRNP3 DB49,50 geïmporteerd als een SDF in ACD NMR-voorspellers (C, H) software door te zoeken naar triterpenen met een MW tussen 100 en 500 Da (dwz zoekgegevens: triterpenen; zoek MW: 100 tot 500) om direct een DB van 6.623 triterpenen te verkrijgen in het vereiste c-type bestandsformaat.

Alk(en)ylresorcinol- en fenolderivaten DB5 werden opgebouwd uit de PNMRNP3 DB49,50 geïmporteerd als een SDF in ACD NMR-voorspellers (C, H)-software door NP's te doorzoeken met een m-alk(en)ylfenolsteiger en geclassificeerd als fenolen (dwz 3-(hexadec-8-en-1-yl)fenol Substructure search; Search Classyfire class: phenol) om direct een DB van 44 NP's te verkrijgen in het vereiste c-type bestandsformaat.

2.8 13C NMR-gebaseerde dereplicatie met behulp van MixONat-software

De pieklijst en intensiteitsgegevens verkregen van elk experimenteel spectrum (13C NMR, DEPT-135 en DEPT-90) werden geëxporteerd als een . csv-bestand met Microsoft Excel-software (Microsoft 16.45) en gebruikt als invoerbestand in MixONat-software. Dergelijke bestanden bestaan ​​uit een lijst met δC-waarden, geordend in aflopende volgorde, gekoppeld aan hun intensiteiten op dezelfde regel, gescheiden door een komma.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Daarna werden experimentele gegevens van NP's met de beste scores vergeleken met de literatuur.

2.9 Zuivering

2.9.1 Preparatieve HPLC

Zuivering van fracties BC{{0}}F6 en BC1_F8 (40 mg in 2 ml MeOH) werd uitgevoerd met behulp van een Shimadzu LC-20AP preparatief vloeistofchromatograaf uitgerust met een UV-vis detector SPD-40 (Noisiel, Frankrijk), een injectielus van 2 ml en een fractiecollector FRC-10A, gebruikmakend van een preparatieve kolom C18 (25{{39 }} mm 21,2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Frankrijk) bij een stroomsnelheid van 21,24 ml/min. De mobiele fase bestond uit 0,1 procent mierenzuur in water (oplosmiddel A) en methanol (oplosmiddel B) en de scheiding werd uitgevoerd met de volgende gradiënt: (1) voor BC1_F6, 40 procent B (0–5 min), 40-70 procent B (5-20 min) en 70-90 procent (20-30 min); (2) voor BC1_F8, 40-70 procent B (0-15 min) en 70-90 procent (15-25 min). Chromatogrammen werden verkregen bij 254 en 280 nm.

2.9.2 Vastefase-extractie (SPE)

Om de meest polaire fractie BC2-EPP te verkrijgen (200 mg in 5 ml MeOH gemengd met 350 mg C18-silicagel na verdamping), werd de zuivering uitgevoerd met behulp van een C18-vastefase-extractiekolom (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Frankrijk) met water: MeOH 7:3 (10 ml) en water: MeOH 6:4 (10 ml). Buizen 4-10 werden gecombineerd om de polaire fractie van BC2 (BC2_SPE) te vormen op basis van hun HPLC-UV (330 nm) profielen.

2.10 Antioxidant- en anti-AGE-assays

2.10.1 Opruiming van DPPH-radicalen

De DPPH-evaluatie van het wegvangen van radicalen van Beninese EEP's werd uitgevoerd zoals eerder beschreven.51 In het kort werden de geteste monsters verdund in absolute EtOH bij 0.02 mg/ml uit voorraadoplossingen bij 1 mg/ml in dimethylsulfoxide (DMSO). Porties (100 µl) van deze verdunde oplossingen werden in drievoud in 96-well-platen geplaatst. Ongeveer 25 µl vers bereide DPPH-oplossing (1 mM) werd toegevoegd aan 75 µl absolute EtOH met behulp van de injector van de microplaatlezer (Infinite® 200, Tecan, Frankrijk) om een ​​uiteindelijk volume van 200 µl per putje te verkrijgen. Na 30 minuten in het donker bij omgevingstemperatuur werd de absorptie bepaald bij 517 nm. EtOH werd als blanco gebruikt, terwijl 10, 25, 50 en 75 μM oplossingen van Trolox (een hydrofiel-tocoferol analoog) werden gebruikt voor de kalibratiecurve. Een monster van een oplossing van chlorogeenzuur in ethanol (0,02 mg/ml) werd gebruikt als kwaliteitscontrolestandaard. Resultaten werden uitgedrukt als Trolox-equivalenten (micromol TE per g extract).

2.10.2 Anti-AGE-assay

De effecten van propolis-extracten en de vijf belangrijkste geïsoleerde naringenine-derivaten op AGE-vorming werden bepaald zoals eerder beschreven.51 In het kort werd runderserumalbumine (BSA) (10 mg/ml) geïncubeerd met D-ribose ({{ 13}}.5 M) samen met de geteste verbinding (3 μM tot 3 mM) of extract (1 ug tot 1 mg) in 50 mM fosfaatbuffer bij pH 7,4 (NaN3, 0,02 procent). Oplossingen werden geïncubeerd in microtiterplaten met 96-putjes bij 37 °C gedurende 24 uur in een gesloten systeem vóór AGE-fluorescentiemeting. Fluorescentie van het geïncubeerde monster onder identieke omstandigheden zonder D-ribose werd voor elke meting afgetrokken. Pentosidine-achtige (excitatie bij 335 nm, emissie bij 385 nm) AGE-fluorescentie werd gemeten met fluorometrie.52 IC50-waarden werden gedefinieerd als de hoeveelheid extract (ug/ml) of positieve controle (μM) die nodig is om AGE-vorming met 50 procent te verminderen ten opzichte van de negatieve controle. Volgens de statistische validatietest53 is een enkele analyse voldoende voor een nauwkeurige IC50-bepaling.

3. RESULTATEN EN DISCUSSIE

3.1 Chromatografische profilering

Algemene LC-profilering van de acht Beninese en de Congolese EPP met behulp van de quasi-universele ELSD-detector toonde aan dat alle monsters niet-polaire verbindingen bevatten, geëlueerd aan het einde van de chromatogrammen (figuur 1). BC1 vertoonde ook een grote hoeveelheid meer polaire verbindingen, en BC2 vertoonde enkele medium polaire verbindingen in kleinere hoeveelheden. Niet-polaire verbindingen in CG EEP bleken heel anders te zijn dan Beninese.

ELSD-profilering leidde dus tot drie verschillende en originele monsters waarvan de samenstelling verder werd onderzocht: BC1, BC2 en CG.

Ten eerste werden GC-MS-analyses uitgevoerd, waarbij de MS-fragmentatie werd vergeleken met de NIST DB, om de chemische klassen te karakteriseren en, indien mogelijk, de bestanddelen te identificeren. Vermoedelijke identificatie (gebaseerd op het percentage van de overeenkomst met de NIST DB) en chemische klassen van verbindingen worden weergegeven in tabel 2 (GC-total ionic current [TIC]-profileringsgegevens worden weergegeven in afbeelding SI-2).

Alle Beninese EEP's vertoonden dezelfde profielen van niet-polaire verbindingen, gelabeld als letter A tot F, maar hun hoeveelheden konden variëren. Ze werden vermoedelijk geïdentificeerd als - of -amrinon (A), -amyrine (B), lupenon (C), -amyrine (D), - of -amyrineacetaat (E) en lupeolacetaat (F) (zie figuur SI -3), al beschreven als belangrijke NP's in Mexicaanse propolis.54 Zhang et al. (2014) en Tamfu et al. (2020) beschreven ook triterpenoïden als amyrin/lupeol en amyrin/lupeolacetaten in verschillende Afrikaanse propolismonsters.41,55 Alleen BC1 presenteerde aanvullende NP's geëlueerd tussen Rt 10 en 15 min voorgesteld als gemethoxyleerde stilbenoïden of fenanthrenen volgens hun fragmentatiepatronen. De Congolese EEP vertoonde een ander profiel dan de Beninese, met C16- en C18-zure ethylesters als meer vluchtige verbindingen geassocieerd met een goede matchingscore van 94 procent, een fenolderivaat bij Rt 13,1 min, drie resorcinol-derivaten in het bereik van 14– 17 min, en verschillende soorten triterpeenderivaten na Rt 21 min.

Bovendien werden EPP's geanalyseerd door HPLC-DAD-MS om niet-vluchtige NP's te visualiseren (zie figuur SI-4). De verschillende profilering toonde aan dat BC1 EEP een grote hoeveelheid medium polaire verbindingen vertoonde met chromoforen die absorberen bij 280 nm, evenals BC2 in kleinere hoeveelheden, en CG bezat een zeer slecht UV-profiel bij 280 nm.

3.2 Chemische samenstelling van BC1 en BC2

Om hun belangrijkste NP's te identificeren met behulp van 13C NMR-dereplicatie op basis van MixONat en geschikte DB's, werd vervolgens een grove fractionering van BC1 en BC2 EEP bereikt door flitschromatografie. Voor BC1 onthulde GC-MS-analyse inderdaad de aanwezigheid van gemethoxyleerde stilbenoïden of fenanthrenen, wat ons leidde tot het bouwen van de specifieke stilbenoïden_fenanthrenoïden DB2. Voor BC2, behalve de meer polaire verbindingen bij Rt 3,8 min, vertoonden alle verbindingen UV-spectra van flavanonen-dihydroflavonolen, wat suggereerde dat de Flavanonen DB3 werden gevormd.

Zoals weergegeven in tabel 3, werden dihydrofenantreenen 1 en 3-5, fenanthrenen 2 en 6 en het dihydrostilbeen 7 (figuur 2) voorgesteld in BC1 EEP door MixONat en gevalideerd door vergelijking met literatuurgegevens (zie ondersteunende informatie). Waar nodig werd een MW-filter gebruikt op basis van HPLC-MS-gegevens.

Nauwkeuriger gezegd, van de 9,10-dihydrofenantreenderivaten van de 2.681 NP's in DB2, stelde MixONat 6-methoxycoelonine (2,7-dihydroxy-3,5-dimethoxy{ {10}},10-dihydrofenantreen; 3, rang 1, score 0.75, cijfers SI-13 en SI-14) in BC{{ 18}}F5 en zijn aanwezigheid werd bevestigd door vergelijking met gepubliceerde NMR-gegevens. Het is nog geïdentificeerd uit Combretaceae soorten56 en in de orchidee Bulbophyllum vaginatum; 57 en 2,7-dihydroxy-3,4,6-trimethoxy- 9,10-dihydrofenantreen (4, rang 1, score 0,88, cijfers SI{{33 }} en SI-16) werd verondersteld in BC1_F2. Verbinding 4 is al beschreven in Senegalese propolis58 en de aanwezigheid ervan werd gevalideerd op basis van gerapporteerde gegevens door Pettit et al. van de Afrikaanse boom Combretum caffrum59 en door Lu et al. van Dioscorea nipponica Makino.60

Het op 13C NMR gebaseerde dereplicatieproces voorspelde ook 2,6-dihydroxy-3,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrofenantreen (5, rang 8, score 0.76, figuren SI-15 en SI-16) in BC1_F2 en 2,6,7-trihydroxy{{20 }},4-dimethoxy-9,10-dihydrofenantreen (1, rang 2, score 0.5, figuren SI-5 en SI-6 ) in BC{{30}}F6-1 wanneer een moleculair filter met MW 288 Da werd gebruikt. Voor 1 was de score vrij laag (0.5); daarom werden aanvullende 2D NMR-experimenten (heteronucleaire meervoudige kwantumcorrelaties [HMQC], heteronucleaire meervoudige bindingsconnectiviteit [HMBC], nucleaire Overhauser-effectspectroscopie [NOESY], cf. figuren SI-7–SI-10) uitgevoerd uitgevoerd om de structuur te bevestigen; voor 5 was de score 0,76, dus hoger dan 0,70. Deze twee NP's (1 en 5) werden voor het eerst genoemd door Letcher et al. in Combretum-soorten61,62 en 1 is al gevonden in Senegalese propolis.58

Van de fenanthreenderivaten veronderstelde MixONat 2,6,7-trihydroxy-3,4-dimethoxyfenantreen (2, rang 1, score 0.88, cijfers SI-11 en SI{{10}}) in BC1_F8-1, wat werd bevestigd door vergelijking met de spectrale gegevens beschreven door Letcher et al. bij Combretum apiculatum. 61 2,7-Dihydroxy-3,4,6-trimethoxyfenantreen (6, rang 5, score 0,94, cijfers SI-17 en SI-18) eerder geïsoleerd uit Photolida Chinensis63 werd gesuggereerd in BC1_F4.

Combretastatine B{{0}} (7), een dihydrostilbeen, werd door MixONat voorgesteld als eerste rang (score 1,0, figuren SI-17 en SI-19) in BC1 EPP bij gebruik een MW-filter (MW 304 Da) en gevalideerd door vergelijking met NMR-gegevens beschreven door Pettit et al. in Combretum caffrum. 59

Verbindingen 2, 6 en 7 zijn al geïdentificeerd in Senegalese propolis.58

1H- en 13C-NMR-gegevens van 1–7 zijn beschikbaar in de ondersteunende informatie.

Voor BC2 werden zeven verbindingen geïdentificeerd die behoren tot twee structurele klassen van polyfenolen, chromon-C-glucoside en prenylflavanonderivaten (8-14), waarvan sommige voor het eerst in propolis werden beschreven (Figuur 3).

Het op 13C NMR gebaseerde proces met behulp van MixONat en DB1 tot DB5 leverde geen relevante resultaten op die originele NP's suggereerden. Twee belangrijke producten (8-9) werden volledig gekarakteriseerd als een mengsel met behulp van massaspectra en 1D- en 2D-NMR-gegevens (1H, 13C, HMQC, HMBC, zie figuur SI-20–SI-23) en geïdentificeerd als florin (8) en isobiflorin (9), twee chromanon-Cglucosiden die nieuw zijn beschreven in propolis, eerder beschreven in respectievelijk Pancratium biflorum64 en kruidnagel van Eugenia caryophyllata.65

Wat betreft flavanonderivaten stelde MixONat van de 688 NP's in DB3 6-prenylnaringenine (10, rang 1, score 0.95, figuren SI- 24 en SI{{8 voor }}) al beschreven in Nigeriaanse rode propolis66 in BC{{10}}F7-1. 6,8-Diprenylaromadendrin (12, rang 1, score 1.0, figuren SI-28 en SI-29) en 6,8-diprenylnaringenin (lonchocarpol A ) (13, rang 10, score 0,84, cijfers SI-30 en SI-31), eerder gevonden in Kameroense propolis-monsters,42 werden gevalideerd in BC2_F{ {30}} en BC2_F5, respectievelijk. 6-Geranylnaringenin (14, rang 1, score 0,84, figuren SI-32 en SI-33), eerder beschreven in propolis van de Salomonseilanden,67 werd verondersteld en bevestigd in BC{{41 }}V7-5. Ten slotte werd 6-dimethylallylnaringenin (11) als tweede voorgesteld door MixONat in BC2_F6 (plaats 2, score 0,65, figuren SI-26 en SI- 27). De isomeer op positie 8 werd in de eerste positie voorgesteld, maar een vergelijking met gegevens uit de literatuur 68,69 toonde aan dat het de isomeer op positie 6 is. Verbinding 11 was nieuw in propolis maar al beschreven in organische extracten van Monotes africanus. 70 1 H- en 13C-NMR-gegevens van 8–14 zijn beschikbaar in de ondersteunende informatie.

【Voor meer info: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】