Klonen, functionele identificatie en expressieanalyse van chalconsynthase uit Cistanche Tubulosa

Samenvatting: Doelstelling Het bestuderen van de functie van chalconsynthase uit Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) en het expressiepatroon van het CtCHS-gen in witte, rode en paarse bloemen.

Methoden Het CtCHS-gen werd gekloneerd door RT-PCR en er werd bio-informatica-analyse uitgevoerd. Het pET-28a-CtCHS-plasmide werd overgebracht naar de Escherichia coli om eiwitexpressie door IPTG te induceren. Het recombinante CtCHS-eiwit werd geïncubeerd met de substraten p-coumaroyl CoA en malonyl CoA, en de producten werden gedetecteerd met HPLC en MS. Het pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-plasmide werd overgebracht naar de protoplast van Arabidopsis thaliana om de subcellulaire lokalisatie van het CtCHS-eiwit waar te nemen. Het expressiepatroon van CtCHSgene in de bloemen vanC. tubulosamet drie kleuren werd gedetecteerd door qRT-PCR.

Resultaten Een CtCHS-gen werd gekloneerd. De lengte van het open leesraam (ORF) was 1173 bp, coderend voor 390 aminozuren, en het molecuulgewicht van het eiwit was 42 8000. CtCHS bevatte de katalytische residuen Cys164, His303, Asn336, die waren geconserveerd in chalconsynthase. Het CtCHS-eiwit werd tot expressie gebracht in E. coli en gezuiverd om het recombinante eiwit te verkrijgen. CtCHS-eiwit zou p-coumaroyl CoA en malonyl CoA kunnen katalyseren om naringenine chalcon te produceren. Het CtCHS-eiwit was voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma. Het CtCHS-gen kwam in hoge mate tot expressie in paarse en rode bloemen, en de relatieve expressieniveaus waren respectievelijk 8,44 en 3,21 maal hoger dan die in witte bloemen.

Conclusie Een CtCHS-gen werd gekloneerd uit de bloem vanC. tubulosaen eiwit werd tot expressie gebracht. CtCHS-eiwit heeft een chalconsynthasefunctie en de expressie van het CtCHS-gen is hoger in donkerdere bloemen, wat aangeeft dat CtCHS-gen de bloemkleur van C. tubulosa kan reguleren, wat een basis legt voor verder onderzoek naar deregulatiemechanisme van de bloemkleur van C. tubulosa.

Trefwoorden:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalcon synthase; analyse van enzymactiviteit; subcellulaire lokalisatie; expressieanalyse

KLIK HIER VOOR NATUURLIJK BIOLOGISCH CISTANCHE-EXTRACT MET 30% ECHINACOSIDE EN 12% ACTEOSIDE

Ondersteunende service van Wecistanche, de grootste cistanche-exporteur in China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Winkel voor meer specificaties:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-winkel

De biosynthetischeroute van flavonoïdenbegint met de fenylpropanoïderoute.Fenylalaninewordt eerst omgezet in kaneelzuur onder dewerking van fenylalanine-ammonialyase(PAL) en kaneelzuur wordt 4-gehydroxyleerd door kaneelzuur. Het enzym (kaneelzuur-4-hydroxylase, C4H) en 4-coumaratecoenzym A-ligase (4-coumaratecoenzym A-ligase, 4CL) katalyseren de reactie om 4-coumaroyl-CoA te genereren [11 ]. Eén molecuul 4-coumaroyl-CoA en drie moleculen malonyl-CoA worden gekatalyseerd door chalconsynthase (CHS) om naringenine-chalcon te genereren, dat flavonoïdeverbindingen bevat. Het basisskelet van chalcon-isomerase, flavanon-3-hydroxylase, dihydroflavonol 4-reductase, enz. genereert een verscheidenheid aan flavonoïden zoals isoflavonen, flavonolen, anthocyanines, enz. [12]. Als sleutelenzym in de biosyntheseroute van flavonoïden reguleert CHS het gehalte aan flavonoïden in planten en speelt het ook een belangrijke rol bij het reguleren van de bloemkleur van planten [13]. Post-transcriptionele genuitschakeling van Gentiana scabra Bunge CHS kan bijvoorbeeld de biosynthese van anthocyanines remmen en specifiek wit worden van bloemkroonlobben veroorzaken [14]. CHS-genuitschakeling van Actinidia erianthaBenth. CHS vermindert het anthocyaninegehalte in bloemblaadjes en maakt de bloemblaadjes rood. De bloemblaadjes worden lichter van kleur[15]. Daarom werd in deze studie een CtCHS-gen gekloond uit Cistanche tubulosa-bloemen, en werden bioinformatica-analyse, prokaryote expressie en zuivering, analyse van enzymactiviteit, subcellulaire lokalisatieanalyse en expressieanalyse in drie kleuren bloemen erop uitgevoerd om de functie van CtCHS te onderzoeken. eiwit en het expressiepatroon van het CtCHS-gen werden gebruikt om voorlopig de relatie tussen CtCHS en de bloemkleur van Cistanche tubulosa te onderzoeken, wat de basis legde voor de studie van het regulerende mechanisme vanBloemkleur van Cistanche tubulosa.

1 Materialen en instrumenten

1.1 Materialen

Cistanche tubulosa-bloemen werden in mei 2018 verzameld in Yutian County, Hotan Prefecture, Xinjiang. Tijdens de bemonstering werd het willekeurige principe gevolgd en werden Cistanche tubulosa-bloemen met een goede fysiologische status en consistente planthoogte geselecteerd. Drie stammen van Cistanche tubulosa met drie bloemkleuren wit, rood en paars werden genomen en geïdentificeerd als Cistanche tubulosa (Schenk) Wight door professor Tu Pengfei van de Peking University School of Pharmacy. Ze werden snel ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens in droogijsopslag naar Peking getransporteerd. E. coli DH5 chemisch competente cellen werden gekocht bij Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., en E. coli BL21 (DE3) chemisch competente cellen werden gekocht bij Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP De vector is gekocht bij Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA is gekocht bij Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -chalcon werd gekocht bij Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., en naringenin werd gekocht bij Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumenten

Nanodrop 2000C spectrofotometer (Thermo Fisher Company, VS); gradiënt-PCR-instrument (Eppendorf Company, Duitsland); CFX 96 fluorescentie kwantitatief PCR-instrument, UVP-gelimager, gelelektroforese-instrument, eiwitelektroforese-instrument (BioRad Company, VS); EnSpire

Microplaatlezer (PerkinElmer Company, VS); incubator met constante temperatuur (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D-oscillator op volledige temperatuur met grote capaciteit (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Een waterbad-oscillator met constante temperatuur (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultraschone werkbank (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); hogedrukstoomsterilisator (TOMY Company, Japan); Milli Q zuiver waterinstrument (Millipore, Verenigde Staten); LC-20Een hoogefficiënte vloeistoffasechromatograaf (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap massaspectrometrie met hoge resolutie (Thermo Fisher Company, VS); FV1200 laserconfocale microscoop (Olympus Company, Japan).

2 Experimentele methoden

2.1 RNA-extractie en cDNA-synthese.

Cistanche tubulosa-bloemen werden gemalen in vloeibare stikstof en vervolgens onderworpen aan RNA-extractietest.

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van een kit (Norgen, Cat 17200), de RNA-concentratie en kwaliteit werden gedetecteerd door NanoDrop 2000C, en RNA-monsters met een A260/A280-verhouding tussen 1,8 en 2,1 werden geselecteerd voor reverse transcriptie om cDNA te synthetiseren. M-MLV reverse transcriptase (Promega, M170B) werd gebruikt om het gekwalificeerde totale RNA reverse-transcriberen in cDNA. De experimentele operaties werden uitgevoerd volgens de instructies.

2.2 Klonering van het CtCHS-gen

Gebaseerd op de transcriptoomgegevens van Cistanche tubulosa-bloemen van onze onderzoeksgroep [16], werd een CtCHS met een volledig open leesraam uitgescreend en werd SnapGene-software gebruikt om specifieke primers te ontwerpen op basis van de gensequentie (Tabel 1). PCR-amplificatie werd uitgevoerd met behulp van het cDNA van Cistanche tubulosa-bloemen als matrijs. Het amplificatiesysteem was 2 x Phanta Max Buffer 25 μl, dNTPMix (10 mmol/l) 1 μl, stroomopwaartse en stroomafwaartse primers (10 μmol/l) elk 2 μl, cDNA 2 μl, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μl, ddH2O 17 µl. De reactieomstandigheden waren: pre-denaturatie bij 95 graden gedurende 3 minuten; 25 cycli van denaturatie bij 95 graden gedurende 15 seconden, uitgloeien bij 55 graden gedurende 15 seconden en verlenging bij 72 graden gedurende 1 minuut; reactieverlenging bij 72 graden gedurende 5 minuten. Het PCR-product werd gedetecteerd door 1% agarosegelelektroforese, en de DNA-zuiveringskit (Novizan, Cat DC301-01) werd gebruikt voor gelwinning, en vervolgens werd het teruggewonnen DNA gezuiverd door een snelle kloneringskit (Novizan, Cat. C601-01). Het DNA-fragment werd geligeerd met de pCE2TA/Blunt-Zero-vector, getransformeerd in Escherichia coli DH5-competente cellen, en na een nacht kweken bij 37 graden werden enkele kloonstammen geselecteerd en naar het bedrijf gestuurd voor sequentiëring.

Tabel 1 Primersequenties

2.3 Bio-informatica-analyse

Gebruik ProtParam online software om de fysische en chemische eigenschappen van eiwitten te analyseren; gebruik de online tool Prot Scale om de hydrofiliteit/hydrofobiciteit van eiwitten te analyseren; gebruik online tool SOPMA om de secundaire structuur van eiwitten te voorspellen; gebruik online analysesoftware SWISS-MODEL om de tertiaire structuur van eiwitten te voorspellen; gebruik online software TMHMM Voorspel de transmembraanstructuur van het eiwit; DNAMAN-software gebruiken om de homologie van CtCHS te vergelijken met de CHS-aminozuursequenties van andere soorten; gebruik MEGA-X-software om een ​​fylogenetische boom te construeren, met behulp van buur-joining (NJ) en Poisson-correctie. De evolutionaire afstand wordt berekend met behulp van de Bootstrap-methode en het aantal Bootstrap-herhalingen is 1000 keer.

2.4 CtCHS prokaryotische expressie en zuivering

Ontwerp primers met restrictieplaatsen BamHⅠ en XhoⅠ op basis van de CtCHS-sequentie, en PCR amplificeer de overeenkomstige doelfragmenten. De pET-28een vector en het doelfragment werden gedigereerd met behulp van de endonucleasen BamHI en de gekloneerde stam wordt gesequenced en het plasmide wordt geëxtraheerd na correcte sequencing. Het pET-28a-CtCHS-plasmide, geverifieerd door sequencing, werd overgebracht naar Escherichia coli BL21 (DE3)-competente cellen. Zie de methode van Ding Ning et al. [17] met isopropyl

-D-thiogalactopyranoside (IPTG) werd gebruikt om eiwitexpressie bij lage temperatuur te induceren en werd gezuiverd via een Ni2+ affiniteitschromatografiekolom (Cytiva, Cat 17531901). Het eiwit werd geconcentreerd door centrifugatie in een ultrafiltratiebuis (Millipore, 30 000) en ontzout. Bewaren in 20 mmol/L KPB-buffer (pH 8,0, met 1 mmol/LEDTA) en bewaren in een koelkast van -80 graden voor langdurige opslag.

2.5 Analyse van CtCHS-enzymactiviteit

CtCHS-enzymreactiesysteem: 100 mmol/l KPB (pH 7,5) 468 μl, 1 mmol/l malonyl-CoA 10 μl, 5 mmol/l 4-coumaroyl-CoA 2 μl, CtCHS recombinant eiwit 20 μl, in Na 12 uur reageren in een waterbad bij 37 graden werd het mengsel driemaal geëxtraheerd met 800 μl ethylacetaat, gedroogd door een stikstofstroom en vervolgens opgelost in 100 μl methanol. Gebruik hoogwaardige vloeistofchromatografie om het product te detecteren. De omstandigheden zijn de ultieme LP-C18-kolom (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), kolomtemperatuur 30 graden, monstervolume 10 μl en water (A) en acetonitril (B) als de stroom. Fase, elutiegradiënt: 0~10

min, 30% B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. De volumetrische stroomsnelheid is 1 ml/min en de detectie vindt plaats bij een golflengte van 290 nm.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS werd gebruikt voor verdere detectie. De omstandigheden in de vloeistoffase waren Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18-kolom (100 mm x 3,0 mm, 1,7 μm), kolomtemperatuur 40 graad, naringenin- chalcon- en naringeninecontroles. Het laadvolume van het product is 4 μl en het laadvolume van het enzymreactieproduct is 7 μl. Als mobiele fase wordt water (A)-acetonitril (B) gebruikt. De elutiegradiënt is: 0 tot 5 min, 30% B; 5 tot 15 minuten, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. De volumetrische stroomsnelheid is 0,3 ml/min. De massaspectrometrieomstandigheden zijn elektrospray-ionenbron, stikstof als draaggas, mantelgasdruk 3,5 MPa, hulpgasdruk 1,0 MPa, sproeidruk 3500 V, capillaire temperatuur 350 graden, hulpgasverwarmingstemperatuur 200 graden, positieve en negatieve ionenmodi, scannen ionenbereik m/z is 100-1500, volledige MS-resolutie is 35 000, dd-MS2-resolutie is 17 500, (N)

CE/stapsgewijze nce ingesteld op 35, 60.

2.3 Bio-informatica-analyse

Gebruik ProtParam online software om de fysische en chemische eigenschappen van eiwitten te analyseren; gebruik de online tool Prot Scale om de hydrofiliteit/hydrofobiciteit van eiwitten te analyseren; gebruik online tool SOPMA om de secundaire structuur van eiwitten te voorspellen; gebruik online analysesoftware SWISS-MODEL om de tertiaire structuur van eiwitten te voorspellen; gebruik online software TMHMM Voorspel de transmembraanstructuur van het eiwit; DNAMAN-software gebruiken om de homologie van CtCHS te vergelijken met de CHS-aminozuursequenties van andere soorten; gebruik MEGA-X-software om een ​​fylogenetische boom te construeren, met behulp van buur-joining (NJ) en Poisson-correctie. De evolutionaire afstand wordt berekend met behulp van de Bootstrap-methode en het aantal Bootstrap-herhalingen is 1000 keer.

2.4 CtCHS prokaryotische expressie en zuivering

Ontwerp primers met restrictieplaatsen BamHⅠ en XhoⅠ op basis van de CtCHS-sequentie, en PCR amplificeer de overeenkomstige doelfragmenten. De pET-28een vector en het doelfragment werden gedigereerd met behulp van de endonucleasen BamHI en de gekloneerde stam wordt gesequenced en het plasmide wordt geëxtraheerd na correcte sequencing. Het pET-28a-CtCHS-plasmide, geverifieerd door sequencing, werd overgebracht naar Escherichia coli BL21 (DE3)-competente cellen. Zie de methode van Ding Ning et al. [17] met isopropyl

-D-thiogalactopyranoside (IPTG) werd gebruikt om eiwitexpressie bij lage temperatuur te induceren en werd gezuiverd via een Ni2+ affiniteitschromatografiekolom (Cytiva, Cat 17531901). Het eiwit werd geconcentreerd door centrifugatie in een ultrafiltratiebuis (Millipore, 30 000) en ontzout. Bewaren in 20 mmol/L KPB-buffer (pH 8,0, met 1 mmol/LEDTA) en bewaren in een koelkast van -80 graden voor langdurige opslag.

2.5 Analyse van CtCHS-enzymactiviteit

CtCHS-enzymreactiesysteem: 100 mmol/l KPB (pH 7,5) 468 μl, 1 mmol/l malonyl-CoA 10 μl, 5 mmol/l 4-coumaroyl-CoA 2 μl, CtCHS recombinant eiwit 20 μl, in Na 12 uur reageren in een waterbad bij 37 graden werd het mengsel driemaal geëxtraheerd met 800 μl ethylacetaat, gedroogd door een stikstofstroom en vervolgens opgelost in 100 μl methanol. Gebruik hoogwaardige vloeistofchromatografie om het product te detecteren. De omstandigheden zijn de ultieme LP-C18-kolom (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), kolomtemperatuur 30 graden, monstervolume 10 μl en water (A) en acetonitril (B) als de stroom. Fase, elutiegradiënt: 0~10

min, 30% B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. De volumetrische stroomsnelheid is 1 ml/min en de detectie vindt plaats bij een golflengte van 290 nm.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS werd gebruikt voor verdere detectie. De omstandigheden in de vloeistoffase waren Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18-kolom (100 mm x 3,0 mm, 1,7 μm), kolomtemperatuur 40 graad, naringenin- chalcon- en naringeninecontroles. Het laadvolume van het product is 4 μl en het laadvolume van het enzymreactieproduct is 7 μl. Als mobiele fase wordt water (A)-acetonitril (B) gebruikt. De elutiegradiënt is: 0 tot 5 min, 30% B; 5 tot 15 minuten, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. De volumetrische stroomsnelheid is 0,3 ml/min. De massaspectrometrieomstandigheden zijn elektrospray-ionenbron, stikstof als draaggas, mantelgasdruk 3,5 MPa, hulpgasdruk 1,0 MPa, sproeidruk 3500 V, capillaire temperatuur 350 graden, hulpgasverwarmingstemperatuur 200 graden, positieve en negatieve ionenmodi, scannen ionenbereik m/z is 100-1500, volledige MS-resolutie is 35 000, dd-MS2-resolutie is 17 500, (N)

CE/stapsgewijze nce ingesteld op 35, 60.

2.6 Subcellulaire lokalisatie van CtCHS-eiwit

Gebaseerd op de CtCHS-sequentie en het principe van naadloos klonen, werden primers met enzymknipplaatsen Kpn Ⅰ en BamH Ⅰ ontworpen, en de overeenkomstige doelfragmenten werden geamplificeerd door PCR. Het pCAMBIA1300-35S-GFP-plasmide werd gedigereerd met restrictie-endonucleasen Kpn Ⅰ en BamH Ⅰ, en het doelfragment en de vector werden verbonden via de naadloze kloonkit (Novizan, Cat C115-01) en vervolgens overgebracht in E. coli DH5 competente cellen. , selecteer enkele kloonstammen voor sequencing en extraheer plasmiden uit de juiste stammen. De pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS- en pCAMBIA 1300-35S-GFP-plasmiden werden met behulp van PEG4000 in Arabidopsis thaliana-protoplasten getransformeerd en gedurende 8 tot 10 uur bij weinig licht gekweekt. De subcellulaire lokalisatie van CtCHS-eiwit werd waargenomen onder een laserconfocale microscoop.

2.7 Analyse van CtCHS-expressiepatronen

Real-time fluorescerende kwantitatieve primers werden ontworpen met behulp van DNAMAN op basis van de CtCHS-sequentie, met F-box als het interne referentiegen. De primersequenties worden getoond in Tabel 1. De relatieve expressie van CtCHS in Cistanche tubulosa-bloemen van verschillende kleuren werd gedetecteerd door realtime fluorescente kwantitatieve PCR. Gebruik TransStart Green qPCR SuperMix (volledig goud, AQ101-02) om te meten met de SYBRGreen fluorescerende kleurstofmethode. Reactiesysteem: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μl, stroomopwaartse en stroomafwaartse primers (10 μmol/l) 0,2 μl elk, cDNA-sjabloon 0,5 μl, 4,1 μl nucleotidase-vrij water werd gebruikt voor de reactie met behulp van een tweestapsmethode. De reactieprocedure was gebaseerd op de methode van Dong Xianjuan et al. [18]. Elk monster bevatte drie biologische replicaties en het experiment werd drie keer herhaald. De experimentele gegevens werden geanalyseerd met behulp van Excel, de relatieve expressie van CtCHS werd berekend met behulp van de 2−ΔΔCt-methode, en GraphPadPrism 8 werd gebruikt om significantieanalyse uit te voeren en histogrammen te tekenen.