Dendrimeer-tesaglitazar-conjugaat induceert een fenotypeverschuiving van Microglia en verbetert de amyloïde fagocytose† Deel 1

Het omzetten van microglia van een ziekteverergerende, ‘pro-inflammatoire’ toestand naar een neuroprotectief, ‘ontstekingsremmend’ fenotype is een veelbelovende strategie voor het aanpakken van meerdere neurodegeneratieve ziekten.

Microglia is een type cel in het centrale zenuwstelsel dat primair verantwoordelijk is voor het behoud van de gezondheid en functie van neuronen. Ze kunnen een verscheidenheid aan groeifactoren en neurotrofe factoren afscheiden en kunnen de normale metabolische activiteit van neuronen in stand houden door afvalmaterialen rond neuronen op te ruimen. Studies van de afgelopen jaren hebben aangetoond dat microglia nauw verwant zijn aan het geheugen. Laten we er samen naar kijken.

Ten eerste kunnen microglia neuronen stimuleren en de activering van neuronen bevorderen, waardoor het geheugen wordt verbeterd. Door een reeks neurotransmitters vrij te geven, zoals glutamaat en alanine, kunnen microglia de signaaloverdracht tussen neuronen bevorderen en de gliale-neuronsignaalresonantie tussen presynaptische membranen versterken, waardoor de neuronale prikkelbaarheid en geheugenvorming verder worden bevorderd.

Ten tweede kunnen microglia ook afval rond neuronen opruimen, de normale metabolische activiteit van neuronen behouden en de neuronale sterfte verminderen, waardoor geheugenverbetering wordt bevorderd. Wanneer te veel afval zich rond neuronen ophoopt, zal dit de normale metabolische activiteit van neuronen beïnvloeden, wat leidt tot neuronale dood en verzwakte functie, waardoor de geheugenprestaties afnemen. Microglia kan de normale metabolische omgeving van neuronen in stand houden en de neuronale sterfte verminderen door omringend afval op te slurpen en af ​​te breken, waardoor het geheugen wordt verbeterd.

Samenvattend zijn microglia nauw verwant aan het geheugen. Door de prikkeling van neuronen te bevorderen en omringend afval op te ruimen, kunnen microglia het geheugen verder verbeteren en onze hersenen gezond en actief houden. We moeten aandacht besteden aan het beschermen van de gezondheid van microglia om een ​​beter geheugen te bereiken. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche een traditioneel Chinees medicinaal materiaal is met veel unieke effecten, waaronder het verbeteren van het geheugen. De werkzaamheid van Cistanche komt voort uit de verschillende actieve ingrediënten die het bevat, waaronder looizuur, polysachariden, flavonoïde glycosiden, enz. Deze ingrediënten kunnen op verschillende manieren de gezondheid van de hersenen bevorderen.

Klik op 10 manieren kennen om het geheugen te verbeteren

Pro-inflammatoire microglia dragen bij aan de progressie van de ziekte door neurotoxische stoffen vrij te geven en de accumulatie van pathogene eiwitten te versnellen. Van zowel PPAR als PPAR-agonisten is aangetoond dat ze microglia verschuiven van een pro-inflammatoir ('M1-achtig') naar een alternatief geactiveerd ('M2-achtig') fenotype. Dergelijke strategieën zijn onderzocht in klinische onderzoeken naar neurologische ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson, maar zijn waarschijnlijk mislukt vanwege hun slechte penetratie in de bloed-hersenbarrière (BBB).

Van hydroxyl-getermineerde polyamidoamine-dendrimeren (zonder de aanhechting van enige doelgerichte liganden) is aangetoond dat ze de verminderde BBB passeren op de plaats van neuro-inflammatie en zich ophopen in geactiveerde microglia.

Daarom kan dendrimeerconjugatie van een PPAR / dubbele agonist gerichte fenotypewisseling van geactiveerde microglia mogelijk maken. Hier presenteren we de synthese en karakterisering van een nieuw dendrimeer-PPAR / dubbele agonist-conjugaat (D-tesaglitazar).

In vitro induceert D-tesaglitazar een fenotypeverschuiving van 'M1 naar M2', vermindert de secretie van reactieve zuurstofsoorten, verhoogt de expressie van genen voor fagocytose en enzymatische afbraak van pathogene eiwitten (bijv. -amyloïde, -synucleïne), en verhoogt -amyloïde fagocytose.

Deze resultaten ondersteunen de verdere ontwikkeling van D-tesaglitazar in de richting van vertaling voor meerdere neurodegeneratieve ziekten, met name de ziekte van Alzheimer en Parkinson.

Invoering

Alleen al in de Verenigde Staten zijn er momenteel ruim 5,3 miljoen mensen met de ziekte van Alzheimer (AD) en 1 miljoen mensen met de ziekte van Parkinson (PD).1 Omdat hogere leeftijd de grootste risicofactor is voor veel neurodegeneratieve ziekten, zijn de prevalentie en de kosten van de behandeling van deze ziekten zal blijven toenemen naarmate de bevolking ouder wordt.

Bovendien heeft het gebrek aan recent succes bij het ontwikkelen van nieuwe medicijnen om deze ziekten te behandelen de noodzaak van de ontwikkeling van innovatieve therapieën benadrukt.2,3 Deze klinische mislukkingen benadrukken de moeilijkheden bij het ontwikkelen van een medicijn, inclusief het afleveren van een voldoende hoge concentratie van het medicijn aan de hersenen voor werkzaamheid zonder waardoor nadelige bijwerkingen ontstaan.

Neurodegeneratieve ziekten zoals AD en PD hebben drie belangrijke neuropathologische componenten gemeen: neuro-inflammatie, pathogene eiwitaccumulatie en neuronale dood.4–7 Bij gezonde mensen fagocyteert de aangeboren immuuncel van de hersenen (themicroglia) voortdurend de verkeerd gevouwen eiwitten (bijv. -amyloïde, -synucleïne). ) die neuronale dood veroorzaken wanneer ze worden geproduceerd, waardoor de vorming van de kenmerkende aggregaten wordt voorkomen.

Bij mensen die uiteindelijk neurodegeneratieve ziekten ontwikkelen, verwijderen de microglia deze eiwitten echter niet langer effectief en verschuiven ze naar een ziekteverergerend, pro-inflammatoir fenotype (doorgaans aangeduid als M1).

Hoewel de overwegend pro-inflammatoire/anti-inflammatoire (M1/M2) classificatie van microgliale activering een oversimplificatie is van het spectrum van macrofaagpolarisatie, wordt deze nog steeds gebruikt als een brede nomenclatuur om het dominante fenotype van microglia bij neuro-inflammatie en respons op therapie te beschrijven.

M1-achtige microglia geven reactieve zuurstofsoorten en andere ontstekingsmediatoren vrij die zowel neuronale dood veroorzaken als de ziektepathologie verergeren door de productie van pathogene eiwitten (bijv. -amyloïde, -synucleïne) te verhogen.

Bovendien komen de belangrijkste genetische risicofactoren voor het ontwikkelen van AD (TREM2 en APOE) in hoge mate tot expressie in microglia, en is aangetoond dat de TREM2/APOE-route een amicrogliale fenotypeverschuiving veroorzaakt bij AD, amyotrofische laterale sclerose (ALS) en multiple sclerose. diermodellen.8

Deze bevindingen demonstreren verder de rol van microglia in de pathologie van meerdere menselijke neurodegeneratieve ziekten. Een aanpak om het fenotype van microglia te manipuleren zou onderzoekers in staat stellen hun rol in neurodegeneratieve ziekten te begrijpen, naast dat het mogelijk een effectief therapeutisch middel zou zijn.

Het omschakelen van microglia van een M1 naar een ontstekingsremmend en neuroprotectief (M2) fenotype is voorgesteld als een therapeutische strategie om meerdere neurodegeneratieve ziekten te behandelen.5,6 Van twee momenteel door de FDA goedgekeurde PPAR-agonisten, type II-diabetesmedicijnen, rosiglitazon en pioglitazon, is aangetoond dat ze een M1 naar M2 fenotypeverschuiving in macrofagen en microglia in vitro en in vivo.

Van PPAR-agonisten is aangetoond dat ze de door LPS geïnduceerde secretie van reactieve zuurstofsoorten verminderen door de activiteit van NF-KB te verminderen door NF-KB-afbraak en export uit de kern te induceren, evenals ligand-afhankelijke transrepressie.11

Bovendien hebben epidemiologische onderzoeken aangetoond dat diabetespatiënten die rosiglitazon of pioglitazon gebruiken een verlaagd risico lopen op het ontwikkelen van AD en PD.12 Vervolgens werden rosiglitazon en pioglitazon onderzocht via fase III klinische onderzoeken naar AD, maar dat mislukte.13

Een waarschijnlijke verklaring voor het mislukken van de bovengenoemde klinische onderzoeken is het slechte transport van deze medicijnen over de bloed-hersenbarrière (BBB), waardoor het aantal medicijnen dat de hersenen bereikt van patiënten die aan deze klinische onderzoeken deelnamen, wordt beperkt.14

Er wordt geschat dat de BBB verhindert dat ongeveer 98% van alle kleine molecuulgeneesmiddelen de hersenen bereiken, en dat slechts een fractie van het geneesmiddel dat de hersenen binnenkomt de microglia bereikt.15

Bovendien is PPAR een andere nucleaire receptor in de PPAR-familie.16 Het speelt een rol bij de lipidenhomeostase en het reguleren van ontstekingen, en van PPAR-agonisten is ook aangetoond dat ze ontstekingsremmende effecten vertonen in microglia.

Klinische onderzoeken met behulp van neuroimaging, post-mortem weefselanalyse en CSF-biomarkers hebben bewijs geleverd dat de BBB verstoord is bij AD en PD, evenals bij andere neurodegeneratieve ziekten.

Van 17 generatie-4 hydroxyl-getermineerde polyamidoamine (G4-PAMAM-OH) dendrimeren is aangetoond dat ze intrinsiek de aangetaste BBB omzeilen en zich ophopen in geactiveerde microglia zonder de noodzaak om zich op liganden te richten, na systemische toediening in meerdere verschillende modellen voor neuro-inflammatieziekten , inclusief bij knaagdieren, konijnen, honden en niet-menselijke primaten.18–28 Het is veelbetekenend dat G4-PAMAM-OH systemisch kan worden toegediend en de BBB kan overschrijden in ziektemodellen met milde BBB-verstoring zoals het Rett-syndroom.29

Bovendien is de mate van opname van G4-PAMAM-OH in de hersenen direct evenredig met de ernst van de ziekte in een konijnenmodel van hersenverlamming.30 Op hydroxyl eindigende dendrimeren hebben het voordeel dat ze niet-invasief worden toegediend vergeleken met de zeer invasieve, lokale toediening via de schedel die vereist was in eerdere onderzoeken met andere nanodeeltjes zoals poly-εcaprolacton en PEG, negatief geladen PAMAM-dendrimeren, kwantumdots en nanoformuleringen bestaande uit polyethyleenimine (PEI) en dextraansulfaat.31–35

Bovendien zijn deze hydroxyl-PAMAM-dendrimeren ideaal gepositioneerd voor translatie vanwege hun schaalbaarheid en goed verdragen in vivo veiligheidsprofiel.36–38 Vanwege positieve preklinische werkzaamheidsgegevens is een (G4-PAMAM-OH)-N- Het acetylcysteïneconjugaat wordt momenteel geëvalueerd in vroege klinische onderzoeken naar cerebrale adrenoleukodystrofie bij kinderen (NCT03500627) en ernstige ontstekingen die verband houden met de ziekte van het coronavirus 2019 (COVID-19) (NCT04458298).

We bestudeerden een dendrimeer-geneesmiddelconjugaat van tesaglitazar (Tesa) gehecht aan generatie -4 hydroxyl-getermineerde PAMAMdendrimeer. Tesaglitazar is een krachtige PPAR/dubbele agonist die de gunstige effecten van PPAR en PPAR-agonisten combineert. Het bevat een functionele carbonzuurgroep voor covalente conjugatie aan het dendrimeer en voor daaropvolgende afgifte.

Er zijn nog meer gitaren ontwikkeld en klinisch getest, maar Tesa werd gekozen vanwege de grotere PPAR-tot-PPAR-activiteitsverhouding, de relatief eenvoudige chemische structuur en het veiligheidsprofiel.39-43

Tesa heeft eerder fase III klinische onderzoeken voor diabetes type 2 in de Verenigde Staten van Amerika afgerond, maar faalde vanwege dosisafhankelijke toxiciteit, die kan worden voorkomen door de noodzakelijke toedieningsdosis te verlagen door middel van gecontroleerde dendrimeertoediening.39,40,44Aangezien Tesa een PPAR/dubbele agonist, de gerichte afgifte ervan aan geactiveerde microglia op de plaats van neuro-inflammatie zou zeer nuttig kunnen zijn.

Hierin demonstreren we de synthese en karakterisering van een dendrimeer-tesaglitazar-conjugaat (D-Tesa) en demonstreren we het vermogen van deze verbinding om een ​​'M1 naar M2'-fenotypeverschuiving in microglia te induceren en de fagocytose van fluorescent gelabeld -amyloïde te versterken.

Materialen en methoden

Materialen

1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidemethodide(EDC), 4(dimethylamino)pyridine (DMAP), CuSO4·5H2O,natriumascorbaat, hexynzuur en runderserumalbumine (BSA) werden gekocht bij Sigma Aldrich US en gebruikt zoals ontvangen (St. Louis, MO).

Tesaglitazar werd verkregen van AstaTech Inc. (Bristol, PA). PAMAM-dendrimeer met ethyleendiaminekern (generatie 4 met 64 hydroxyleindgroepen) werd ontvangen van Dendritech Inc. (Midland, MI) als een oplossing in methanol.

Het dendrimeer werd opgeslagen in methanol bij 4 graden en de methanol werd vóór gebruik verdampt. Een dialysemembraan met een grenswaarde voor het molecuulgewicht (MWCO) van 1 kDa werd gekocht bij Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

Alle andere oplosmiddelen werden gebruikt zoals ze werden ontvangen in hun watervrije vorm. Alle reacties, behalve de koper (I), gekatalyseerde alkyn-azide cycloadditie (CuAAC) klikreacties, werden uitgevoerd onder watervrije omstandigheden in een organisch medium met in de oven gedroogd glaswerk onder een inerte stikstof. sfeer.

Voor celcultuur: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), penicilline-streptomycine (P/S), 0,05% trypsine-EDTA en MTT-reagens werden verkregen van Invitrogen (Carlsbad, CA , VS).

Griess-reagens werd verkregen van Promega (Madison, WI) en TNF-ELISA werd verkregen van R&D Systems (Minneapolis, MN). Methanol van analytische kwaliteit werd gekocht bij Sigma-Aldrich. Trypaanblauw werd verkregen van Corning (Manassas, VA, VS).

Syntheseprocedures voor D-Tesa-conjugaten
Tetraethyleenglycolmonoazide (2) werd gesynthetiseerd met behulp van een eerder gepubliceerd protocol.45

Synthese en zuivering van Tesa-TEG-azide (3).
Tesa (950 mg, 2,32 mmol) werd opgelost in 10 ml dimethylformamide (DMF). Aan deze geroerde oplossing werd tetramethyleenglycolmono-azide (2, 662,1 mg, 3,02 mmol) in DMF (1 ml) druppelsgewijs toegevoegd. DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) en EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) werden vervolgens aan het reactiemengsel toegevoegd en de reactie werd 24 uur bij kamertemperatuur onder stikstofspoeling geroerd.

De reactie werd gevolgd met behulp van dunnelaagchromatografie en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). Het reactiemengsel werd verdund met 100 ml dichloormethaan (DCM) en het ruwe reactiemengsel werd overgebracht naar een scheitrechter, en de organische laag werd vervolgens driemaal gewassen met een verzadigde natriumbicarbonaatoplossing, gevolgd door een verzadigde ammoniumchlorideoplossing en tenslotte met pekel.

De organische laag werd vervolgens gedroogd met watervrij natriumsulfaat. Het oplosmiddel in de organische laag werd vervolgens verwijderd met behulp van een roterende verdamper, en de oplossing werd opnieuw opgelost in 3 ml DCM en geabsorbeerd op silicagel om te worden gezuiverd met een CombiFlash®-chromatografiesysteem met behulp van een gradiëntmethode met ethylacetaat/hexaan als oplosmiddelen om 3as helder te produceren. -gele olie.

Het gewenste, zuivere product wordt geëlueerd bij ongeveer 30–40% ethylacetaat. (Opbrengst: 70%.) 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,27 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7,15(d, J=1.9 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8.6 Hz,2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}}.8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J =7.8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J=8.7 , 3,8 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6.7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H),1,08 (t, J=7 0,0 Hz, 3H).ESI-MS: theoretische C28H39N3O10S: 609,24, verkregen (M + 1):610,13.

Synthese en zuivering van D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmol) werd toegevoegd aan een geroerde oplossing van G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) in 20 ml watervrij DMF. Aan dit mengsel werden DMAP (430 mg, 3,52 mmol) en EDC (1 g, 5,28 mmol) toegevoegd.

Het reactiemengsel werd 24 uur bij kamertemperatuur onder stikstofspoeling geroerd. Na voltooiing van de reactie werd het reactiemengsel overgebracht naar een dialysebuis met een molecuulgewicht van 1000 MW. DMF-dialyse werd gedurende 24 uur uitgevoerd en het DMF werd ongeveer elke zes uur ververst.

Vervolgens werd gedurende 24 uur dialyse met gedeïoniseerd (DI) water uitgevoerd, waarbij het water ongeveer elke zes uur werd ververst. Ten slotte werd de resulterende inhoud van de dialysebuis gedurende 48 uur gelyofiliseerd, wat een wit, pluizig poeder opleverde. (Opbrengst: 61%.) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,10–7,67 (m, dendrimeer intern amide H), 4,72 (s, dendrimeeroppervlak OH), 4,01 (t,ester –CH2), 3,32 (m, dendrimeer –CH2), 3,06 (m, dendrimeer en linker –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimeer –CH2), 2,56–1,89(m, dendrimeer en linker –CH2), 1,78–1,61 (m, linker –CH2). Synthese en zuivering van D-Tesa (6).

Tesa-TEG-azide (3.177,8 mg, 0.3{{10}}3 mmol) werd toegevoegd aan een geroerd mengsel van D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} mg, 0,023 mmol) in 5 ml van een 1:1 mengsel van tetrahydrofuran (THF) en water met 0,5 ml DMF in een magnetronreactorveilig flesje van 20 ml. Voor de CuAAC-klikreactie werden kopersulfaatpentahydraat (11,6 mg, 0,0467 mmol) en (+)-natriumlascorbaat (9,3 mg, 0,0467 mmol) aan het reactiemengsel toegevoegd.

Het flesje werd afgesloten en het reactievat werd vervolgens in een Biotage® Initiator-microgolfreactor geplaatst en gedurende 8 uur bij 50 graden onder roeren met 20 W microgolfstraling gereageerd. Het reactiemengsel werd overgebracht naar een 1000 MWCO-dialysebuis en DMF-dialyse werd gedurende 24 uur uitgevoerd, waarbij DMF ongeveer elke 4 uur werd vervangen door vers oplosmiddel.

Vervolgens werd de inhoud van de dialysebuis overgebracht naar een afalcon-buis en werd een equivalente hoeveelheid DI-water toegevoegd. Bovendien werd 200 µl ethyleendiaminetetra-azijnzuur-dinatriumzoutoplossing aan de inhoud van de valk-buis toegevoegd.

Dit mengsel werd vervolgens in een nieuwe 1000 MWCO-dialysebuis geplaatst en de dialyse werd gedurende 12 uur uitgevoerd in 1000 ml DI-water waaraan een EDTA-oplossing was toegevoegd, gevolgd door de waterdialyse gedurende 12 uur.

Het mengsel werd vervolgens gedurende 48 uur gelyofiliseerd en resulteerde in een wit, donzig poeder. (Opbrengst: 64%.) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,2–7,6 (m, dendrimeer internalamide H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, linkerH), 3,96 (dd, Tesa en linker H), 3,70 (m, Tesa en linker H) ,3,58–3,14 (m, dendrimeer –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimeer–CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimeer en linker –CH2), 2,25 (m, dendrimeer –CH2) , 1,82–1,67 (m, linker –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Karakteriseringstechnieken

Kernmagnetische resonantie (NMR). NMR-spectra werden bij kamertemperatuur opgenomen op een Bruker 500 MHz spectrometer. Protonchemische verschuivingen (δ) worden gerapporteerd in ppm.

1H NMR werd gebruikt om het aantal Tesa-moleculen te bepalen dat aan elk molecuul D-Tesa is gehecht door middel van de protonintegratiemethode, door de pieken van interne amideprotonen van dendrimeer bij δ 7,6–8,2 ppm te vergelijken met aromatische protonen van Tesa bij δ 7,36–6,76 ppm en methylprotonen van Tesa in het alifatische gebied. Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).

Er werd gebruik gemaakt van HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts), uitgerust met een 1525 binaire pomp, een In-Line-ontgasser AF, een 717 plus autosampler, een 2998 fotodiode-arraydetector en een 2475 multi-λ-fluorescentiedetector gekoppeld aan Waters Empower-software.

Er werd een Symmetry C18 omgekeerde fasekolom (Tosoh, Japan) met een deeltjesgrootte van 5 urn, een lengte van 25 cm en een interne diameter van 4,6 mm gebruikt. Verbindingen werden gevolgd bij 210 nm en 254 nm met behulp van de PDA-detectoren.

Oplosmiddel A was water van HPLC-kwaliteit met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA), en oplosmiddel B was acetonitril (ACN) met 5% water en 0,1% TFA. De gebruikte methode begon bij 1{ {7}}0: 0 (ACN: water), verlaagd naar 10: 90 (water: ACN) in 5 minuten, bleef 15 minuten op die polariteit en keerde terug naar 100: 0 (ACN: water) in 5 minuten. De stroomsnelheid werd op 1 ml min-1 gehouden. Massaspectroscopie.

ESI-MS werd uitgevoerd op een BrukermicroTOF-II massaspectrometer met behulp van acetonitril/water (9:1) als oplosmiddelsysteem. De moleculaire ionen als geprotoneerde pieken [M + nH]n+ of adducten [M + nX]n+ (X=Na, K of NH4) werden gebruikt om de empirische formule te bevestigen.

Dynamische lichtverstrooiing en ζ-potentiaal. Een Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, VK) uitgerust met een 50 mW He-Ne-laser (633 nm) werd gebruikt om de deeltjesgrootte en ζ-potentiaalverdeling te bepalen. D-Tesa werd opgelost in DI-water tot een concentratie van 0,2 mg ml−1 voor DLS en in 10 mM natriumchloride tot een concentratie van 0,1 mg ml−1 voor ζ-potentieel.

De metingen werden uitgevoerd bij een hoek van 25 graden, met gebruikmaking van een verstrooiingshoek van 173 graden, zoals eerder beschreven.27,46 Onderzoek naar de afgifte van geneesmiddelen. D-Tesa werd opgelost in een concentratie van 1 mg ml-1 in een fosfaatbufferoplossing (pH 7,4) om plasmaomstandigheden na te bootsen, of een natriumcitraatoplossing (pH 5,5) om lysosomale omstandigheden na te bootsen.

Esterasen uit varkenslever (van Sigma Aldrich) werden aan het begin van het vrijgaveonderzoek aan de natriumcitraatoplossing toegevoegd en werden tijdens het onderzoek ongeveer elke 3 dagen aangevuld.

Elk flesje bevatte 15 ml monster en ze werden gedurende de duur van het experiment continu bij 37 graden geschud. Op verschillende tijdstippen werden dubbele monsters van 200 µl van elke pH verzameld en de esterase-activiteit werd vervolgens geblust door het toevoegen van 200 µl methanol. Tijdpuntmonsters van nul uur dienden als controle.

De monsters werden bij -80 graden bewaard om eventuele hydrolyse verder te voorkomen. De monsters werden verder geanalyseerd met HPLC en het gebied onder de curve (bij 210 nm) voor de vrije geneesmiddelpiek werd berekend. Het gebied onder de curve werd gecorreleerd met de hoeveelheid geneesmiddel die vrijkwam door gebruik te maken van een ijkcurve waarbij bekende concentraties vrij Tesa op de HPLC bij 210 nm werden uitgevoerd.

For more information:1950477648nn@gmail.com