Bepaling van echinacoside in waterextract van Cistanche Herba door HPLC

Abstract:

Doelstelling Er werd een HPLC-methode ontwikkeld voor debepaling van echinacosidein dewaterextract van Cistanchehera.

Methoden Echinacoside werd bepaald met HPLC. De scheiding werd uitgevoerd op de Inertsil ODS-SP C18-kolom met een mobiele fase bestaande uit acetonitril (A) en 0,4% fosforzuuroplossing (B), door middel van gradiëntelutie. De detectiegolflengte was ingesteld op 333 nm en de kolomtemperatuur was 30 graden. De stroomsnelheid was 1,0 ml·min-1 en het injectievolume was 10 μl. Resultaten De lineaire relatie van echinacoside binnen het concentratiebereik van 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 was goed(r=0.999 8). De terugvorderingen bedroegen 94,59%-105,31% (RSD= 2,93%,n=9). Het gehalte aan echinacoside in waterextracten van Cistanche herba was 15,527,7,347,12,267 mg·g-1. Conclusie De gevestigde HPLC-methode met goede herhaalbaarheid is nauwkeurig, eenvoudig en haalbaar. Het is geschikt voor de bepaling van echinacoside in het waterextract van Cistanche herba.

Trefwoorden:HPLC;waterextract van Cistanche herba; echinacoside; bepaling van de inhoud

Cistanche deserticola is een versterkend traditioneel Chinees medicijn dat veel wordt gebruikt in de klinische praktijk en staat bekend als "woestijnginseng" [1]. De Cistanche deserticola die is opgenomen in de 2015-editie van de Chinese Farmacopee is de gedroogde, vlezige stengel met geschubde bladeren van Cistanche deserticola YC Ma of Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Het is warm, zoet en zout en keert terug naar de meridianen van de nieren en de dikke darm. Het heeft de effecten van het voeden van nier-yang, het aanvullen van essentie en bloed, en het hydrateren van de darmen en laxeermiddelen [2]. "Shen Nong's Materia Medica", zegt dat het "het midden kan versterken, de vijf interne organen kan voeden, yin kan versterken en de essentie kan voeden". Cistanche deserticola bevat voornamelijk fenylethanoïde glycosiden, iridoïden en hun glycosiden, lignanen en hun glycosiden, polysachariden, esterverbindingen en alkaloïden [3]. Fenylethanolglycosiden zijn de belangrijkste actieve ingrediënten van Cistanche deserticola. Onder hen worden echinacoside en verbascoside vermeld in Cistanche deserticola in de Chinese Farmacopee.

Indicatieve componenten voor identificatie en inhoudsbepaling. Farmacologische onderzoeken [4] tonen aan dat Cistanche deserticola verschillende farmacologische effecten heeft, zoals laxerend, leverbescherming, anti-osteoporose, antioxidant, anti-veroudering en anti-vermoeidheid. Waterig extract van Cistanche deserticola kan de expressie bevorderen van het botmorfogenetische eiwit 2-gen in osteoblasten van ratten, tartraatresistente zure fosfatase, osteocalcine in het serum van muizen waarbij de eierstokken zijn verwijderd, en Smad1-, mad5-genen, transformerende groeifactor-, enz. in het beenmerg. , heeft anti-osteoporose-effecten [5-6].

Echinacea kan de proliferatie van osteoblasten bevorderen en de differentiatie van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg bevorderen die in vitro tot osteoblasten zijn gekweekt [7-9]. De afgelopen jaren zijn er veel onderzoeksrapporten verschenen over de gehaltebepaling van echinacoside en verbascoside in Cistanche deserticola ethanolextract en de samengestelde preparaten [10-12], maar er zijn weinig rapporten over de gehaltebepaling van indexcomponenten in Cistanche deserticola waterig extract. In deze studie werd gebruik gemaakt van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) om het gehalte aan echinaceaside in het waterige extract van Cistanche deserticola te bepalen.

1 materiaal

1.1 Instrumenten

LC-20AT hoogwaardige vloeistofchromatografie, SPD-20Een detector, SIL-20Een autosampler, CTO-10ASvp-kolomoven, LC-oplossing vloeistofchromatografiewerkstation, Shimadzu Corporation of Japan; MES125P-OCE-DU elektronische analytische balans, Sartorius Company, Duitsland; SHZ-D (Ⅲ) multifunctionele vacuümpomp met circulatiewater, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; RC2B SO25 rotatieverdamper koelcirculatiesysteem, RV 10 D S96 rotatieverdamper, IKA Company, Duitsland; DK-S26

Elektrisch waterbad met constante temperatuur, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; UPR-serie ultrapuur watermachine, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Medicinale materialen en reagentia

Het medicinale materiaal Cistanche deserticola werd gekocht bij Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., batchnummer: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, de belangrijkste traditionele Chinese apotheker van het Third Affiliated Hospital van de Guangzhou University of Chinese Medicine, identificeerde het zoals de gedroogde, vlezige stengel met geschubde bladeren van Cistanche deserticola YCMa. Het monster wordt opgeslagen in de Drug Testing Room van het derde aangesloten ziekenhuis van de Guangzhou University of Chinese Medicine; Echinacea Glycoside referentiestof, gehalte 89,7%, China Institute of Food and Drug Control, batchnummer: 111670-

201706; acetonitril is chromatografisch zuiver (Merck, Duitsland); methanol en fosforzuur zijn analytisch zuiver (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); water is ultrapuur water.

2 Methoden en resultaten

2.1 Bereiding van waterextract van Cistanche deserticola

Neem het grove poeder van het geneeskrachtige materiaal Cistanche deserticola, voeg 10 keer de hoeveelheid gedestilleerd water toe, verwarm en reflux voor extractie tweemaal, telkens 1 uur, filtreer, combineer het filtraat en concentreer het filtraat met een rotatieverdamper tot een ruw geneesmiddelgehalte van 0,100 g·ml-1, en bewaar het bij 4 graden voor later gebruik.

2.2 Chromatografische omstandigheden en geschiktheid van het systeem

Chromatografische kolom: Inertsil ODS SP C18-kolom (150 mm x 4,6 mm, 5 μm); mobiele fase: acetonitril (A)-0.4% fosforzuuroplossing (B), gradiëntelutie: 0 ~ 5 min, 17%

A; 5 ~ 25 min, 20% A; 25 ~ 30 min, 17% A; detectiegolflengte: 333 nm; kolomtemperatuur: 30 graden; stroomsnelheid: 1,0 ml·min-1;

Injectievolume: 10 μl. Onder deze chromatografische omstandigheden is de scheiding tussen echinacoside- en aangrenzende componentpieken groter dan 1,5, en het aantal theoretische platen op basis van de echinaceaside-piek mag niet minder zijn dan 4,000. Het chromatogram wordt getoond in Figuur 1.

2.3 Bereiding van de oplossing

2.3.1 Oplossing van referentiestof Weeg een geschikte hoeveelheid echinacoside-referentiestof af, weeg deze nauwkeurig, plaats deze in een maatkolf van 10 ml, voeg methanol toe om deze op te lossen en bereid een referentiestofoplossing met 898,794 ug echinaceaside per ml, 4 graden Bewaar voor later gebruik.

2.3.2 Testoplossing

Meet nauwkeurig 2.0 ml waterig extract van Cistanche deserticola af, damp in een waterbad in tot droog, voeg methanol toe om op te lossen, verdun tot volume in een maatkolf van 10 ml, schud goed en filtreer met een microporeus membraan van 0,22 μm te verkrijgen.

2.4 Onderzoek naar lineaire relatie

Meet nauwkeurig {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, 3.00 ml van de referentieoplossing onder punt 2.3.1, plaats deze in een maatkolf van 5 ml, voeg methanol toe tot het volume is bereikt en schud goed om een ​​gradiëntconcentratie van 44 te verkrijgen.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 referentieoplossing, gefilterd door een microporeus membraan van 0,22 μm. Meet volgens de chromatografische omstandigheden onder 2.2 en noteer het piekgebied. Voer lineaire regressie uit met de massaconcentratie van de referentiestof als de abscis (X, ug·mL-1) en het piekoppervlak als de ordinaat (Y), en de regressievergelijking wordt verkregen: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. De resultaten laten zien dat echinacea een goede lineaire relatie heeft binnen het concentratiebereik van 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Precisietest

Neem 539,276 4 ug ·ml- 1 referentieoplossing, injecteer en meet 6 keer continu volgens de chromatografische omstandigheden onder 2.2, en noteer het piekoppervlak. De resultaten toonden aan dat de RSD van het piekgebied van de echinacoside 1,81% bedroeg, wat wijst op een goede instrumentprecisie.

2.6 Stabiliteitstest

Meet nauwkeurig 2.0 ml waterig extract van Cistanche deserticola af, damp in een waterbad in tot droog, voeg methanol toe om op te lossen, verdun in een maatkolf van 10 ml, schud goed, filtreer met een {{ 7}}.22 μm microporeus membraan, volg de chromatografische omstandigheden onder punt 2.2 en plaats respectievelijk op 0 en 2. , 4, 8, 12, 24 uur injectiemeting, registreer het piekgebied. De resultaten toonden aan dat de RSD van het piekoppervlak van echinacoside 1,16% was, wat aangeeft dat de testoplossing binnen 24 uur een goede stabiliteit had.

2.7 Herhaalbaarheidstest

Meet nauwkeurig 2,0 ml Cistanche deserticola-waterextract af en bereid parallel 6 testoplossingen volgens de methode onder 2.3.2. Injecteer monsters voor meting volgens de chromatografische omstandigheden onder 2.2 en noteer het piekoppervlak. Uit de resultaten bleek dat de RSD van deechinacosidede massaconcentratie was 1,28%, wat een goede herhaalbaarheid van de methode aangeeft.

2.8 Monsterhersteltest

Meet nauwkeurig 9 porties van 1.0 ml Cistanche deserticola-waterextract af, voeg 0.8, 1.0 en 1,2 ml referentieoplossing (1,552 mg·ml{{11) toe }}) respectievelijk indampen tot droog in een waterbad, methanol toevoegen om op te lossen en dit in een maatkolf van 10 ml doen; Goed schudden en filtreren door een microporeus membraan van 0,22 μm om testoplossingen met een hoge, gemiddelde en lage concentratie te bereiden. Bereid parallel 3 exemplaren van elke concentratie. Meet volgens de chromatografische omstandigheden onder 2.2. Noteer het piekoppervlak en bereken het monsterherstel. Tarief. De resultaten worden weergegeven in Tabel 1.

2.9 Bepaling van de monsterinhoud

Meet nauwkeurig 3 porties van 2.0 ml waterig Cistanche deserticola-extract af, damp in een waterbad in tot droog, voeg methanol toe om op te lossen, verdun in een maatkolf van 10 ml, schud goed, filtreer met een microporeus membraan van 0,22 μm, en meet volgens de chromatografische omstandigheden onder 2.2. Noteer het piekoppervlak en bereken het echinaceasidegehalte. De resultaten worden weergegeven in Tabel 2.

Tabel 1 Resultaten van hersteltests van echinacoside

Tabel 2 Resultaten van gehaltebepaling van echinacoside in waterextract van Cistanche herba