Ontwikkeling van multifunctionele cosmetische crème met behulp van bioactieve materialen van Streptomyces

Ram Hari Dahal1 , Tuan Manh Nguyen1,2, Dong Seop Shim3, Joon Young Kim4, Jangyul Lee4 en Jaisoo Kim1,*

Abstract:Verschillende cosmetica met één functie worden steeds vaker gebruikt, maar cosmetica met multifunctionele activiteiten blijven beperkt. We wilden een multifunctionele cosmetische crème ontwikkelen met:antioxidant, anti-tyrosinase, anti-aging en antimicrobiële activiteiten. Antimicrobiële activiteiten werden uitgevoerd door de schijfdiffusiemethode. Celtoxiciteit en celproliferatie werden geëvalueerd in een 96-well-plaat met verschillende cellijnen zoals HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1 en B16F10. Paddestoeltyrosinaseremming, elastaseremming en 1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicalen wegvangende activiteiten werden geëvalueerd en IC50 werd berekend. Mesoporeuze silicadeeltjes werden gesynthetiseerd met behulp van Pluronic P123 en tetraethylorthosilicaat (TEOS). Gezichtsfoto's werden gemaakt door VISIA-CR (Facial Imaging System for Clinical Research). De ruwheid van het beeld werd geanalyseerd met PRIMOS-software en de helderheid van het beeld werd geanalyseerd met Chromameter CR-400. Het ruwe product van stam T65 remde de verschillende menselijke pathogene bacteriën zoals Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus epidermidis. De IC50 van ruw T65-product voor paddenstoelentyrosinase, elastase en DPPH-radicaalafvangende activiteiten waren respectievelijk 58,73, 14,68 en 6,31 ug/ml. T65 ruw product prolifereerde collageen type I in CCD-986Sk-cel tot 145,91 procent ± 9,11 procent (gemiddelde ± SD; gemiddelde van 24, 48 en 72 uur) bij 250 pg/ml. Gesynthetiseerde mesoporeuze deeltjes (SBA-15) bevestigden de duurzame prestaties door controle-afgifte gedurende drie dagen. Geformuleerde functionele cosmetische crème met in T65 ingebed SBA-15, verminderde de ruwheid van de huid aanzienlijk met 4,670 procent en verhoogde de helderheid van de huid met 0,472 procent na het aanbrengen van 4 weken. T65 ruw product remde zowel Gram-positieve als Gram-negatieve pathogenen. Gesynthetiseerd mesoporeus deeltje, SBA-15, bevestigde dat de fysiologisch actieve stof vrijkwam in een toestand van duurzame afgifte. T65 ruw product vertoonde onberispelijke antimicrobiële,antioxidant, anti-aging en whitening-activiteiten met niet-cytotoxische effecten op verschillende cellijnen die verband houden met de menselijke huid.

trefwoorden: antioxidant; cytotoxiciteit; anti-tyrosinase; anti-veroudering; antimicrobieel; mesoporeuze silicadeeltjes; cosmetische formuleringen; esthetische toepassing

cistanche verloren rijkkruidenheeft ook eenhuid whitening effect.

1. Inleiding

De huid is het grootste orgaan en de buitenste laag van het menselijk lichaam. Het visuele uiterlijk van de huid maakt het mogelijk om leeftijd, geslacht, gezondheid, aantrekkelijkheid en schoonheid in te schatten [1,2]. Cosmetische producten worden veelvuldig gebruikt voor het verbeteren van het uiterlijk van de huid en het verminderen van huidveroudering. Bovendien laat de plaatselijke toepassing van cosmetica zien hoe de aantrekkelijkheid kan worden vergroot door schoonheidsfactoren te manipuleren die verband houden met gezichtscontrast [3,4]. Cosmetische industrieën zijn voortdurend op zoek naar nieuwe en natuurlijke bioactieve materialen met anti-aging, antioxiderende, anti-tyrosinase en antimicrobiële eigenschappen voor cosmeceutische formuleringen om huidverzorgingsbenaderingen te verbeteren [5,6].

Huidveroudering is een complex biologisch proces dat wordt veroorzaakt door verschillende intrinsieke en extrinsieke factoren die leiden tot fysiologische disfunctie en verlies van de structurele integriteit van de huid. Intrinsieke veroudering, algemeen bekend als natuurlijke veroudering (chronologische veroudering) van de huid, houdt verband met hormonale veranderingen op basis van leeftijd, terwijl extrinsieke veroudering wordt geassocieerd met beweging van de spieren, vervuiling, nicotine, blootstelling aan zonnestraling, cafeïne, temperatuur, levensstijlen zoals zoals dieet (voeding), gebrek aan slaap, stress en andere gezondheidsproblemen [7-9]. Elastine helpt de huid om na beweging terug te keren naar zijn oorspronkelijke positie, terwijl elastase geproduceerd in acinaire cellen de elastine afbreekt en leidt tot huidveroudering [9]. Anti-elastase remt het elastase en houdt elastine in zijn oorspronkelijke toestand, waardoor huidveroudering wordt voorkomen. Cosmetische of huidverzorgingsproducten met anti-aging eigenschappen hebben een positieve invloed op huidveroudering [10–13].

Vrije radicalen worden meestal gegenereerd tijdens het cellulaire metabolisme. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) en reactieve stikstofsoorten (RNS), zoals anionradicaal, superoxide, peroxide, hydroxylradicaal, stikstofoxide (NO), peroxynitriet en hypochloorzuur zijn verantwoordelijk voor oxidatieve schade aan de cellen, lipiden, eiwitten, en DNA, leidend tot atherosclerose, carcinogenese, hart- en vaatziekten, celveroudering, chronische ontsteking, diabetes, hypertensie, mutagenese, neurodegeneraties, reumatoïde artritis, beroerte, septische shock en andere degeneratieve ziekten [7,14-17]. Antioxidanten voorkomen oxidatie van eiwitten en vorming van ROS en RNS die schade door vrije radicalen aan normale weefsels kunnen verminderen door oxidatieve stress te bestrijden [17-19].

De huid produceert een donker pigment dat bekend staat als melanine. De aanmaak van melanine voorkomt dat de huid door UV-straling beschadigd raakt [9]. Overproductie en accumulatie van melanine veroorzaken echter hyperpigmentatie van de huid, wat leidt tot esthetische complicaties zoals melasma, sproeten, seniele lentigines, naevus en ephelis [9,20]. Tyrosinase is een glycoproteïne dat wordt aangetroffen in de membranen van melanosomen die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese van melanine door hydroxylering van l-tyrosinase tot 3,4-dihydroxyfenylalanine (l-DOPA) en daaropvolgende oxidatie van l-DOPA tot dopaquinon [21]. Door de spontane polymerisatie wordt dopaquinon uiteindelijk omgezet in melanine [22]. Overgeproduceerde melanine moet worden gecontroleerd om de integriteit van de huid te behouden. Dat is de reden waarom de ontdekking van nieuwe tyrosinaseremmers voor de ontwikkeling van cosmeceutische formuleringen veel belangstelling heeft gekregen [23-25].

Antimicrobiële conserveermiddelen worden aan cosmetische producten toegevoegd om de microbiologische zuiverheid te behouden gedurende de gehele gebruiksperiode [26]. In plaats van cosmetische conserveermiddelen zoals methylparaben te gebruiken, zijn natuurlijke antimicrobiële verbindingen met andere functies beter en gunstiger voor de menselijke gezondheid [27-29]. De secundaire metabolieten die uit bacteriële bronnen worden geïsoleerd, kunnen zowel conserverende als antimicrobiële eigenschappen hebben die de kolonisatie van bacteriële pathogenen (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis en Staphylococcus aureus) in de huid remmen [9,26,28].

Bioactieve verbindingen geproduceerd door bodem- of zeebacteriën, met name actinobacteriën, zijn niet geëxploiteerd en nog steeds onontgonnen [23,30]. Verschillende bioactieve verbindingen die toepasbaar zijn in de cosmeceutische en cosmetische industrie, waaronder die met anti-aging, antioxidant, anti-tyrosinase, antimicrobiële en niet-cytotoxische eigenschappen, hebben een groot potentieel voor nieuwe toepassingen.

Er zijn talloze onderzoeken naar bioactieve materialen geïsoleerd uit planten die momenteel worden gebruikt in cosmeceutische formuleringen, maar er zijn zeer weinig onderzoeken beschikbaar over bioactieve materialen uit bacteriën [9,21,24-27,31]. Deze studie had tot doel het cosmeceutische potentieel van ethylacetaatextracten van de bacteriestam Streptomyces sp. T65 voor antioxiderende, anti-aging, anti-tyrosinase en antibacteriële activiteiten en eventuele cytotoxische effecten op verschillende muis- en menselijke cellijnen. Daarnaast wilden we mesoporeuze silicadeeltjes synthetiseren. Ten slotte was het belangrijkste doel van deze studie om het uiteindelijke cosmetische product te ontwikkelen voor plaatselijke toepassing met behulp van bioactief materiaal dat is geëxtraheerd uit bodemmicro-organismen.

2. materialen en methoden

2.1. Reagentia, cellijnen en apparatuur

Alle gebruikte oplosmiddelen waren van analytische kwaliteit. B16-F10-melanoomcellijn, B16-F1-muizenmelanoomcellijn en menselijke keratinocytcellijn (HaCaT) werden gekocht bij American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, VS). Dulbecco's gemodificeerd Eagles-medium (DMEM), penicilline-streptomycine en door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (HI FBS) werden gekocht bij Gibco (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., Seoul, Zuid-Korea). De Cell Counting Kit-8 (CCK-8) werd gekocht bij Dojindo (Kumamoto, Japan). Een muismacrofaagcellijn RAW264.7 en CCD-986Sk humane fibroblasten werden gekocht bij de Korean Cell Line Bank (Seoul, Zuid-Korea). Lipopolysacharide (LPS, Escherichia coli, serotype O11:B4), sulfanilamide, naftylethyleendiaminedihydrochloride, paddenstoelentyrosinase, varkenspancreas-elastase, l-tyrosine, ascorbinezuur, arbutine, N-Succ-(Ala)3-p-nitroanilide , 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), collageen type I, Tween 20, tetramethylbenzidine (TMB ), tetraethylorthosilicaat (TEOS), pluronic P-123 (poly(ethyleenglycol)-blok-poly(propyleenglycol)-blok-poly(ethyleenglycol); PEG-PPG-PEG) en -melanocyt -stimulerend hormoon (-MSH) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). 1,1-Difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en oleanolzuur werden gekocht bij Aldrich (St. Louis, MO, VS). COL1A1 (Collageen, type I, alfa 1) primair antilichaam en secundair antilichaam geconjugeerd met HRP (mierikswortelperoxidase) werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, VS). Een SpectraMax 340PC384 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, VS) werd gebruikt voor het lezen van 96-putjesplaten.

2.2. Pathogene bacteriestammen

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 en Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 werden gekocht bij de Korean Agriculture Culture Collection (KACC, Jeonju, Zuid-Korea); Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234 en Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 werden verkregen van de Korea Environmental Micro-organismen Bank (KEMB, Suwon, Zuid-Korea); en Propionibacterium acnes KCTC 3314 werd gekocht bij de Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Jeongeup, Zuid-Korea).

2.3. Isolatie en behoud

Verschillende bodemmonsters werden verzameld van teruggewonnen graslanden in Hwaseong (37◦16′10" N 126◦45′43" E) en Kyonggi University forest (37◦18′1" N 127◦2′20" E) in Korea. Bacteriën werden geïsoleerd met behulp van een eerder beschreven methode [9]. Kolonies werden elke 1 week uitgestreken op R2A-platen voor conservering op korte termijn en bewaard bij -80 ◦C als een suspensie in R2A-bouillon aangevuld met 20 procent (v/v) glycerol voor conservering op lange termijn.

2.4. Screening, identificatie en fylogenetische positie van geïsoleerde stammen

Screening op cosmetica en antimicrobiële activiteiten van geïsoleerde stammen werd voltooid zoals eerder beschreven [9]. Bacteriën met functies werden geïdentificeerd met behulp van 16S rRNA-gensequencing. Genomisch DNA van stammen werd geëxtraheerd met behulp van een InstaGene Matrix-kit (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) en het 16S-rRNA-gen werd geamplificeerd door PCR met behulp van de universele bacteriële primer 27F en 1492R [32]. Het PCR-product werd gezuiverd met een multiscreen-filterplaat (Millipore Corp., Bedford, MA, VS) en werd gesequenced met een Applied Biosystems 3770XL DNA-analysator met behulp van een BigDye Terminator cycle sequencing-kit v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS). Een bijna volledige sequentie voldeed aan de SeqMan-software (DNASTAR Inc., Madison, WI, VS). De dichtstbijzijnde stam van geïsoleerde functionele stammen werd geïdentificeerd met behulp van EzBioCloud [33] en de NCBI GenBank-database [34]. Gerelateerde 16S-rRNA-sequenties werden verkregen van GenBank en fylogenetische analyse werd bereikt met behulp van MEGA7 [35].

2.5. Cultuur van bacteriën

P. acnes werd gekweekt door incubatie bij 37 ◦C gedurende 3-4 dagen anaëroob in Schaedler anaërobe bouillon (Oxoid). Voor de anaërobe kweek werd BBL anaërobe pot met GasPak EZ Gas Generating Container System (Becton Dickinson, NJ, VS) gebruikt. S. epidermidis en S. aureus werden 24 uur aeroob gekweekt in TSB (Tryptic sojabouillon) medium (Oxoid) bij 37 ◦C. E. coli, P. aeruginosa en B. subtilis werden gekweekt in LB (Luria-Bertani) (Oxoid) medium. Geïsoleerde bacteriestammen werden 4-5 dagen in R2A bij 28 ◦C gekweekt.

2.6. Fermentatie

Voor het fermentatieproces werd het inoculum bereid in R2A-bouillon bij 28 ◦C gedurende 4-5 dagen om 150 uur. Stam T65 werd gefermenteerd met 1-2 procent inoculum in ISP2 (International Streptomyces Project 2) medium bij 28 ◦C gedurende 1 week om 140 pm.

2.7. Extractie

De geoogste kweekbouillon werd 20 minuten bij 11.305 x g bij 4 C gecentrifugeerd met een centrifuge met grote capaciteit van 1736R (LABOGENE, Seoul, Korea). Het kweeksupernatant werd gefilterd met filtreerpapier van 150 mm (Whatman 1001-150, GE Healthcare, Maidstone, VK) om celresten te verwijderen en geconcentreerd met een roterende verdamper bij 40 C. Het geconcentreerde ruwe product werd vervolgens tweemaal geëxtraheerd met een gelijk volume met gebruikmaking van vijf verschillende oplosmiddelen (n-hexaan, diethylether, dichloormethaan, chloroform en ethylacetaat). Ethylacetaat bleek het beste oplosmiddel te zijn en verdere analyses werden uitgevoerd met ethylacetaatextract. De organische laag werd gescheiden door een scheidingstrechter en drooggedampt. Tenslotte werd het gedroogde ruwe product voor verdere beoordeling in methanol opgelost.

cistanche extract

2.8. Verzameling van actieve fracties door preparatieve HPLC (Prep-HPLC)

Actieve fracties van ruw kweekextract van T65 werden verzameld met behulp van preparatieve HPLC (Agilent 1200 serie). Shim-pack-PREP-ODS (K) C18 omgekeerde kolom (30 mm id x 25 cm) met een deeltjesgrootte van 15 m werd gebruikt als de stationaire fase. Voor de mobiele fase werden 0,1 procent HCHOOH-water (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B) gebruikt. Oplosmiddel B-concentratie was 10 procent tot 100 procent van 0 min tot 60 min en 100 procent van 60 min tot 75 min werden gebruikt. De stroomsnelheid was 15 ml/min. Multi-wave detector (MWD) werd gebruikt met 208, 230, 254 en 280 nm. Verzamelde fracties van 14 min tot 21 min werden drooggedampt en opgelost in methanol (T65 ruw product) voor verdere beoordeling.

2.9. Levensvatbaarheid van de cel van HaCaT-cel

De levensvatbaarheid van de cellen van HaCaT-cellen werd bepaald met een CCK-8 (Cell Counting Kit-8)-assay volgens de instructies van de fabrikant. De HaCaT-cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten met 104 cellen per putje en vervolgens 24 uur bij 37 C geïncubeerd in Dulbecco's gemodificeerd Eagles'-medium (DMEM) dat 10 procent foetaal runderserum (FBS) bevat. Cellen werden behandeld met verschillende concentraties T65 ruw product (10 mg/ml, 1 mg/ml, 100 ug/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml, 100 ng/ml en 1 ng/ml) en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in een bevochtigde atmosfeer die 5 procent CO2 bevat met toevoeging van 10 μL CCK-8 reagens. De absorptie van het reactiemengsel werd gemeten met een microplaat-spectrofotometer bij 450 nm en het percentage levensvatbaarheid van de cellen werd berekend.

2.10. Evaluatie van antioxidantactiviteiten

2.10.1. Evaluatie van toxiciteit in RAW264.7-cellen

RAW264.7-cellen werden bewaard in DMEM met 10 procent FBS, 100 U/mL penicilline en 100 ug/mL streptomycine bij 37 C in een 5 procent CO2-incubator. RAW264.7-cellen werden gezaaid in een 96-putje microtiterplaat met vlakke bodem met een dichtheid van 104 cellen per putje met verschillende concentraties (0-1 mg/ml) ruw T65-product en gedurende 24 dagen bij 37 ◦C geïncubeerd. h in een 5 procent CO2-incubator. Na 24 uur incubatie werden de cellen tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en 190 L vers medium en 10 μL MTT-werkoplossing (5 mg/ml) werden aan elk putje toegevoegd en de plaat werd vervolgens geïncubeerd bij 37 ◦C gedurende 4 uur in een 5 procent CO2-incubator. Vervolgens werd het supernatant verwijderd en werden de gevormde formazankristallen opgelost door 150 L DMSO (dimethylsulfoxide) toe te voegen aan elk putje gedurende 10 minuten bij 37 ◦C in een 5 procent CO2-incubator. De intensiteit van de opgeloste formazankristallen werd gekwantificeerd met behulp van een microplaatlezer bij 570 nm.

2.10.2. Bepaling van stikstofmonoxide

De RAW264.7-cellen (105 cellen/ml) werden gedurende 30 minuten voorbehandeld met verschillende concentraties T65 ruw product (15,5-125 ug/ml), gevolgd door stimulatie met 1 ug/ml LPS gedurende 24 uur. De concentratie NO die vrijkomt uit de cellen werd bepaald door Griess-reagens met behulp van de standaardcurve van NO2- [36]. Honderd microliter kweeksupernatant werd gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd met 100 L Griess-reagens (mengsel van N-1-naftylethyleendiaminedihydrochloride (NEDHC) en sulfanilamide). De absorptie werd gemeten bij 540 nm.

2.10.3. DPPH-test voor het opruimen van vrije radicalen

DPPH-activiteiten voor het opruimen van vrije radicalen werden uitgevoerd volgens een eerder beschreven methode [9]. Het ruwe product van T65-kweekextract werd verdund tot concentraties 600, 200, 100, 20 en 4 ug/ml in methanol. Het reactiemengsel van 180 L werd gemaakt met 90 μL 0,1 mM DPPH (opgelost in MeOH) en 90 μL monsteroplossingen van verschillende concentraties (Tabel S1). Testreacties werden grondig gemengd in platen met 96-putjes, 30 minuten geïncubeerd bij 37 ◦C en absorptie werd gemeten bij 516 nm met een spectrofotometer. Het percentage DPPH-remming werd als volgt berekend:

Remming( procent)=[1 − (ODexp − ODcon) / (ODstd − ODbln)] × 100 (1)

waarbij ODexp de absorptie van het experimentele monster is; ODcon is de absorptie van de besturing; ODstd, de absorptie van de standaard; en ODbln, de absorptie van de blanco.

2.11. Evaluatie van antiverouderingsactiviteiten

2.11.1. Evaluatie van cytotoxiciteit in CCD-986Sk-cellen

Celcytotoxiciteit van verschillende concentraties (0–1 mg/ml) ruw T65-product in menselijke huidfibroblastcellen (CCD-986Sk) werd bepaald met MTT-assay zoals eerder beschreven voor MTT-assay van RAW264.7 cellen.

2.11.2. Proliferatie van menselijke fibroblasten met behulp van CCD-986Sk-cellen

De proliferatie van menselijke dermale fibroblasten (HDF) werd bepaald in CCD{{0}}Sk-cellen met behulp van een CCK-8-assay. CCD-986Sk-cellen werden uitgezaaid in 96-putjesplaten bij 5 x 103 cellen/putje en vervolgens 24 uur bij 37 ◦C geïncubeerd in DMEM met 10% FBS. Cellen werden behandeld met verschillende concentraties T65 ruw product (0-1 mg/ml) en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd in een bevochtigde atmosfeer die 5 procent CO2 bevatte met toevoeging van 10 μL CCK-8 reagens. De absorptie van het reactiemengsel werd gemeten met een microplaatlezer bij 450 nm en het percentage levensvatbare cellen werd bepaald in vergelijking met de absorptie van de onbehandelde cellen.

Cistanche gaat veroudering tegen.

2.11.3. Collageen Type I Synthese Assay

De synthese van collageentype I werd bepaald door middel van een enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA). CCD-986Sk-cellen werden uitgezaaid in 96-putjesplaten met een dichtheid van 5 x 103 cellen/putje in DMEM met 10 procent FBS en geïncubeerd bij 37 ◦. C gedurende 24 uur. Verschillende concentraties T65 ruw product (31,25-25{{30}} pg/ml) werden gedurende 24 uur toegevoegd in een FBS-vrij medium. Vervolgens werd 100 L kweekmedium en collageen type I toegevoegd aan met collageen beklede 96-putjesplaten en 24, 48 en 72 uur bij 37 ◦C geïncubeerd. Elk putje werd gewassen met 0,05% fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (PBST) en het primaire antilichaam COL1A1 werd toegevoegd en gedurende 1 uur geïncubeerd. Opnieuw werden de putjes gewassen met 0,05% PBST en werd een secundair antilichaam geconjugeerd met HRP (mierikswortelperoxidase) toegevoegd en gedurende 1 uur geïncubeerd. Elk putje werd gewassen met 0,05% PBST en TMB (tetramethylbenzidine) werd toegevoegd. Na het verkrijgen van de gewenste kleurintensiteit (blauw), werd de reactie beëindigd door 0,5 N H2S04 toe te voegen, waardoor de kleur van de oplossing geel werd. De absorptie werd gemeten bij 450 nm met een microplaatlezer en de productie van collageen type I werd bepaald.

2.11.4. Elastase-remmingstest

Varkenspancreatisch elastase (PPE) remmingsactiviteiten werden getest volgens een eerder beschreven procedure [9]. Het ruwe T65-product werd verdund tot concentraties van 30{{10}}0, 1000, 500 en 100 ug/ml in methanol. Het reactiemengsel werd bereid met 0,2 M Tris-HCl-buffer (pH 8,0), 0,5 mM N-Succ-(Ala)3-ρ-nitroanilide (SANA) als substraat, varkenspancreas-elastase (3,5 U/ml in 0,2 M Tris-HCl-buffer, pH 8,0), en de remmer (monster). Elk monster werd gedurende 15 minuten bij 37 C voorgeïncubeerd en het totale reactiemengsel werd 20 minuten bij 37 C geïncubeerd. De absorptie werd gemeten bij 400 nm. Het totale reactiemengsel van 150 L werd bereid zoals weergegeven in tabel S2. De eindconcentraties van het monster in het reactiemengsel waren 300, 100, 50 en 10 ug/ml. Het percentage PPE-remming werd berekend met formule (1).

2.12. Evaluatie van bleekactiviteiten

2.12.1. Evaluatie van cytotoxiciteit in B16F1-cellen

Cytotoxiciteit van ruw T65-product voor B16F1-melanoomcellen werd bepaald met een MTT-assay. B16F1-cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten met 104 cellen per putje en vervolgens 24 uur bij 37 ◦C geïncubeerd in DMEM met 10% FBS. Cellen werden behandeld met verschillende concentraties T65 ruw product (0-1 mg/ml) en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd in een bevochtigde atmosfeer die 5 procent CO2 bevat. De absorptie van het reactiemengsel werd gemeten met een microplaat-spectrofotometer bij 450 nm en het percentage levensvatbaarheid van de cellen werd berekend.

2.12.2. Melaninesyntheseremming in B16F10-cellen

B16F10-cellen werden voorbehandeld met -MSH in 6-putjesplaten met 105 cellen per putje en 24 uur bij 37 ◦C geïncubeerd in DMEM met 10% FBS om de melaninesynthese te bevorderen. De cellen werden 48 uur geïncubeerd met verschillende concentraties ruw T65-product (31,25-125 ug/ml) en 100 ug/ml arbutine als een positieve controle in aan- of afwezigheid van -MSH. De remming van de melaninesynthese in B16F10-melanoomcellen werd waargenomen.

Cistanche remt de vorming van melanine.

2.12.3. Paddestoel Tyrosinase-remmingstest

De tyrosinaseremmingsactiviteiten van paddenstoelen werden bepaald zoals eerder beschreven [9]. Het ruwe T65-product werd verdund tot concentraties van 3000, 1000, 500 en 100 ug/ml in methanol. Het reactiemengsel werd bereid met 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 6,8), 3 mM l-tyrosine-oplossing [opgelost in DW (gedestilleerd water)] en 2000 E/ml paddenstoelentyrosinase (opgelost in 0,05 M kaliumfosfaatbuffer, pH 6,8). ; Sigma) in 96-putjesplaten. Totaal testmengsel van 150 L (120 L fosfaatbuffer, 10 μL l-tyrosine, 15 L monsteroplossing en 5 μL paddenstoelentyrosinase; Tabel S3) werd gedurende 10 minuten bij 37 ◦C geïncubeerd en de absorptie werd gemeten bij 475 nm. De eindconcentraties van het monster in het reactiemengsel waren 300, 100, 50 en 10 ug/ml. De standaard was zonder de monsteroplossing, de controle was zonder l-tyrosine en de blanco was zonder l-tyrosine en de monsteroplossing. Het percentage tyrosinaseremming werd berekend door formule (1) toe te passen.

2.13. Analyse van aminozuren

Het vrije aminozuur van het ruwe T65-product werd bepaald met de GC-FID-methode (gaschromatografie – vlamionisatiedetector) bij het Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Voor de GC-FID-methode was de gebruikte machine een Agilent 6890N GC-FID; kolom, ZB-AAA (10 m x 0,25 mm); temperatuur injectiedeel, 250 ◦C; injectiekolom, 2 L; splitsingsverhouding, 5:1; temperatuurconditie, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detector, FID @ 320 C; drager, stikstofgas, 1,5 ml/min; maker, Phenomenex; aminozuur standaard; en concentratie, 200 mol/L.

De samengestelde aminozuren van het ruwe T65-product werden bepaald met de GC-FID-methode (gaschromatografie-vlamionisatiedetector) bij het Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Voor GC-FID was de gebruikte machine een Agilent 6890N GC-FID; kolom, ZB-AAA (10 m x 0,25 mm); temperatuur injectiedeel, 250 ◦C; injectiekolom, 2 L; splitsingsverhouding, 5:1; temperatuurconditie, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detector, FID @ 320 C; drager, stikstofgas, 1,5 ml/min; maker, Phenomenex; aminozuur standaard; en concentratie, 200 mol/L.

2.14. Vetzuur

Het vetzuur van het ruwe T65-product werd bepaald met de GC-FID-methode (gaschromatografie-vlamionisatiedetector) bij het Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Voor GC-FID was de gebruikte machine Agilent 6890N GC-FID; kolom, Supelco SP–2500 (100 m × 0,25 mm × 0,20 m); temperatuur injectiedeel, 250 ◦C; injectiekolom, 1 L; splitsingsverhouding, 50:1; temperatuurconditie, 100 ◦C (4 min) → 3 ◦C/min → 240 ◦C (15 min); detector, FID @ 285 ◦C; drager, stikstofgas, 0,8 ml/min; maker, SUPELCO 37 Component FAME Mix; en concentratie, 0,5 mg/ml.

2.15. Antimicrobiële activiteiten

Remming van pathogene bacteriën werd uitgevoerd door de schijfdiffusiemethode. Honderd microliter P. acnes-kweek bij 108 CFU (kolonievormende eenheid)/ml werd verspreid en gedurende 2-3 dagen anaëroob bij 35 ◦C geïncubeerd op Schaedler-agarplaten samen met een schijf van 6 mm (Whatman) met 15 ug van ruw extract opgelost in methanol, en de remmingszones werden gemeten. Evenzo werd 100 L S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli en P. aeruginosa bij 108 CFU/ml verspreid en aeroob bij 35 ◦C geïncubeerd op R2A- of LBA-platen voor 1-2 dagen en de remmingszones werden gemeten.

2.16. Synthese van mesoporeuze silicadeeltjes

Het structuurinducerende polymeer werd opgelost in gedeïoniseerd water om een ​​miceloplossing te bereiden. Mesoporeuze silicamaterialen werden gesynthetiseerd volgens de in de literatuur beschreven methoden [37]. Voor de synthese van mesoporeuze silicadeeltjes (SBA-15) werd 10 g Pluronic P123 (EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, VS) opgelost in 55 ml 2 M HCl, gevolgd door roeren bij kamertemperatuur temperatuur gedurende 30 min. Verder werd 22 g tetraethylorthosilicaat (TEOS) aan de oplossing toegevoegd en 30 min verder geroerd en 24 uur op 36 C geplaatst en vervolgens in de oven geplaatst, waarin de temperatuur op 100 ◦C werd gehouden, en werd gedurende 4 dagen onder de statische voorwaarde. Na 4 dagen veranderde de oplossing in een troebele oplossing in de fles. De troebele oplossing werd gefiltreerd met de twee lagen cellulosefilterpapier en gewassen met EtOH (twee keer) en DI (gedeïoniseerd) water (twee keer). Het resulterende gefilterde poeder werd gedroogd in de 120 ◦C convectieoven en in de moffeloven geplaatst (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Seoul, Zuid-Korea). Zes monsters werden gesynthetiseerd onder dezelfde omstandigheden, maar in een andere batch. Transmissie-elektronenmicrofoto's (TEM) van gesynthetiseerde SBA-15 werden genomen in Seoul National University met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (Talos L120C; FEI).

2.17. BET Oppervlakte Analyse

De deeltjesgrootte van silica werd gemeten door de Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt., Malvern, Verenigd Koninkrijk). Voor de monsterbereiding van BET-analyse (Brunauer-Emmett-Teller) werd 5 g P-123 toegevoegd aan 76 g 2M HCl en 24 uur geroerd bij 250 rpm. Na 24 uur, toen P-123 volledig was opgelost, werden 160 ml DI (gedeïoniseerd) water en TEOS gelijkmatig (15 ml/min) toegevoegd en 24 uur geroerd bij 750 rpm. Daarna werd het gevormde poeder afgescheiden door filtratie en het afgescheiden poeder werd in een vingerhoed gedaan en 24 uur gewassen met Soxhlet. Daarna werd het gewassen met gedeïoniseerd water en verbrand in een moffeloven (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Zuid-Korea). BET-oppervlakteanalyses werden uitgevoerd om de prestatie van het poeder geproduceerd door SBA-15-synthese te bevestigen. BET-analyses werden uitgevoerd door de Inha University en Changwon National University.

De gassorptieanalysator (Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, OR, VS) werd gebruikt om het oppervlak en de poriegrootteverdelingen van bereide mesoporeuze silicamaterialen te onderzoeken. Het oppervlak en de poriegrootteverdelingen werden berekend met behulp van ASiQwin-software (Anton Paar Quanta Tech Inc., Boynton Beach, FL, VS) op basis van adsorptie-desorptie-isothermen. De ongerepte gesynthetiseerde deeltjes werden ontgast bij 300 ◦C/3h, vervolgens werden N2-adsorptie- en desorptie-isothermen gemeten bij een temperatuur van -196 ◦C. Multipoint BET-analyse werd toegepast voor de berekening van de totale oppervlakte.

2.18. Duurzaamheidsbeoordeling

Om de aanwezigheid van T65 in ingebed SBA-15 te bevestigen, werd de volgende prestatie als volgt uitgevoerd: 12 g SBA-15 en 1,2 g ruw T65-product werden gemengd in 500 ml acetonitril. De oplossing werd 18 uur onder 30°C geroerd. Na filtratie werd van het mengsel gefiltreerd en werden gefiltreerde deeltjes gedroogd in een convectieoven van 100 C. Om het T65-deeltje zelf in SBA-15 te vinden, werd 1 g gedroogd T65 ingebed in SBA-15 opgelost in acetonitril en werd 25 ml 3 M fluorzuur toegevoegd. Het mengsel werd 24 uur bij kamertemperatuur geroerd totdat de oplossing helder werd. Vervolgens werd de oplossing gefiltreerd en werd de filtraatoplossing als monster gebruikt. Monsters verkregen uit de bovenstaande experimenten werden geanalyseerd met HPLC.

Om de eigenschap van gecontroleerde afgifte te bepalen, werd 35 ml ingebed SBA-15 in 50 ml minerale olie (M3516; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) gegoten en goed gemengd. Vervolgens werd 50 ml DI-water aan het mengsel toegevoegd en gedurende 6 uur bij kamertemperatuur geschud en vervolgens 12 uur op het bureau gelaten. Toen de vloeistoflaag was afgescheiden, werd de waterlaag weggegooid en werd 1 ml olielaag verzameld als een monster voor HPLC-analyse. Hetzelfde experiment werd herhaald op de tweede en derde dag en het monster werd opnieuw geanalyseerd met behulp van HPLC.

2.19. Cosmetische formulering en toepassing

2.19.1. Formulerings- en stabiliteitstest

Er werd een cosmetisch product samengesteld uit een crème van het emulgatortype. De stabiliteit van de cosmetische formulering werd bepaald door het cosmetische product tot 28 dagen bij verschillende temperaturen (37, 45 en 60 C), inclusief in de vriezer, koelkast en bij kamertemperatuur, te bewaren. De stabiliteit van cosmetische crème werd waargenomen in de eerste, tweede, derde en vierde week.

2.19.2. Klinische onderzoeken, vrijwilligers en toepassingsmethoden

Een functionele cosmetische crème met een ruw product van T65 werd aangebracht op 21 vrouwelijke vrijwilligers voor het bepalen van de verbetering van de rimpels en het bleken van de huid door middel van ruwheid en helderheid van de huid. Alle experimentele procedures voor menselijke betrokkenheid voor deze studie werden goedgekeurd door de Elad Institutional Review Board (IRB) (EL-P-7400). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle individuele deelnemers. Tests werden uitgevoerd voor het aanbrengen van het product, na 2 weken en na 4 weken. Ongeveer 5 mg cosmetisch product werd twee keer per dag ('s ochtends en' s avonds) op het gezicht aangebracht na het reinigen van het gezicht en het werd zacht verdeeld volgens de huidtextuur. De vrijwilligers mochten 1 week voor de proef en tijdens de proef geen andere crèmes of producten gebruiken.

2.19.3. Methoden voor het vastleggen en verwerken van afbeeldingen

Foto's zijn gemaakt door VISIA-CR. De ruwheid van afbeeldingen werd geanalyseerd door PRIMOS-software (PRIMOS versie 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, VS). De gemiddelde ruwheid (Ra) en de maximale ruwheidsdiepte (Rmax) werden berekend met behulp van de volgende formule:

Ra- of Rmax-percentage ( procent)=(waarde vóór behandeling − waarde na behandeling)/waarde vóór behandeling × 100 (2)

De helderheid van afbeeldingen is geanalyseerd door Chromameter CR-400. L* is de helderheidsparameter en wordt gemeten met de volgende formule:

L* stijgingspercentage ( procent )=(waarde voor behandeling − waarde na behandeling)/waarde voor behandeling × 100 (3)

2.20. Statistische analyse

Statistische berekeningen van de IC5 0-waarde werden uitgevoerd door OriginPro 8.5 statistische software (OriginLab Corporation, Northampton, MA, VS). Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en alle resultaten werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van drie afzonderlijke experimenten. Gegevens werden geanalyseerd door middel van een onafhankelijke steekproef t-test one-way variantieanalyse (one-way ANOVA), gevolgd door Tukey's post-hoc test met OriginPro 8.5. Verschillen werden als significant beschouwd bij p <>

3. Resultaten en discussies

3.1. Isolatie, selectie en fylogenie van geselecteerde actieve stammen

Uit de verzamelde bodemmonsters zijn in totaal 2285 bacteriestammen geïsoleerd. Screeningsresultaten toonden aan dat 102 bacteriestammen functies hadden die van toepassing waren op de cosmeceuticals (Tabel S4). Op basis van primaire screening, Streptomyces sp. T65 bleek hogere activiteiten te hebben voor alle cosmetische toepassingen, namelijk anti-oxidant, anti-elastase, anti-tyrosinase en antimicrobiële activiteiten. Ten slotte werd stam T65 gekozen voor verdere beoordeling om de mogelijke toepassing ervan in cosmeceuticals te identificeren. Fylogenetische analyse toonde aan dat stam T65 een clade vormde met Streptomyces bungoensis DSM 41781T (de dichtstbijzijnde stam op basis van 16S rRNA-gensequentie) met een sterke bootstrap-waarde (Figuur S1).

3.2. Detectie en verzameling van bioactief materiaal

Gemengde bioactieve materialen uit T65-ethylacetaatkweekextract werden verzameld uit Prep-HPLC. Bioactieve materialen werden gemeten bij 208, 230, 254 en 280 nm door detectoren. De fracties werden verzameld op basis van tijd (van 14 min tot 21 min). De verzamelde fracties werden drooggedampt en opgelost in methanol (T65 ruw product) en werden gebruikt voor alle beoordelingen, inclusief antimicrobiële activiteiten.

3.3. Cytotoxiciteit in HaCaT-cel

De levensvatbaarheid van de cellen in de menselijke keratinocytcellijn (HaCaT-cel) bleef onaangetast door T65 ruw product tot 10 mg/ml. Aan de andere kant nam de levensvatbaarheid van de cellen op een dosisafhankelijke manier toe wanneer concentraties van 10 ng/mL tot 10 mg/mL van het ruwe T65-product werden toegepast (Figuur S2). Dit concentratiebereik resulteerde in meer dan 100 procent levensvatbaarheid van de cellen, wat aangeeft dat het de proliferatie van HaCaT-cellen bevorderde en dus niet-toxisch was voor de HaCaT-cellijn.

3.4. Antioxiderende activiteiten

3.4.1. Cytotoxiciteit in RAW264.7-cel

Cytotoxiciteit van het ruwe T65-product werd beoordeeld aan de hand van de levensvatbaarheid van de cellen in RAW264.7-macrofagen met de MTT-assaymethode. T65 ruw product vertoonde geen cytotoxisch effect op RAW264.7-cellijnen.

Integendeel, het ruwe product van T65 hielp om RAW264.7-cellen te prolifereren op een dosisafhankelijke manier wanneer het werd behandeld met 13,5 tot 1000 ug/ml. Wanneer 1000 ug/ml ruw T65-product werd gebruikt, was de cellevensvatbaarheid van RAW264.7-cellen 118,7 procent (p < 0,05).="" deze="" resultaten="" toonden="" aan="" dat="" de="" ruwe="" t65-verbinding="" niet-toxisch="" was="" tot="" 1="" mg/ml="" en="" kon="" worden="" gebruikt="" in="" cosmeceutische="">

3.4.2. Remming van de productie van stikstofmonoxide (NO)

Griess-reagens werd gebruikt om de NO-niveaus te bepalen. Om de NO-remming te bepalen, RAW264.7cellen werden behandeld met 1 ug/ml LPS (lipopolysacharide) samen met verschillende concentraties ruw T65-product. RAW264.7-cellen werden geactiveerd door LPS en NO-productie werd gemeten als nitrietconcentratie in het kweekmedium. Vergeleken met alleen LPS remde het ruwe T65-product significant (p < 0.001)="" de="" nitrietconcentratie="" in="" de="" lps-gestimuleerde="" raw264.7-cellen="" op="" een="" concentratieafhankelijke="" manier="" bij="" gebruik="" van="" 15,5="" tot="" 125="" ug/ml="" (figuur="" 2).="" de="" macrofagen="" waren="" lps-toll-achtige="" expressie="" van="" induceerbare="" no-synthase="" (ino's)="" door="" celactivering="" te="" signaleren="" via="" receptoren="" [38].="" lps="" is="" een="" activator="" van="" macrofagen="" en="" speelt="" een="" belangrijke="" rol="" bij="" de="" productie="" van="" no="" in="" zoogdiercellen="" [39].="" no="" is="" een="" vrije="" radicaal="" die="" wordt="" geproduceerd="" door="" immunocompetente="" cellen="" zoals="" macrofagen="" [40].="" de="" productie="" van="" no="" heeft="" een="" fagocytisch="" effect="" op="" macrofagen.="" zo="" werd="" macrofaagcellijn="" raw264.7="" geselecteerd="" voor="" antioxidanttest.="" lange="" tijd="" is="" er="" veel="" aandacht="" besteed="" aan="" de="" zoektocht="" naar="" natuurlijke="" antioxidanten="" om="" de="" no-productie="" te="" remmen="" [41].="" bij="" 125="" ug/ml="" verlaagde="" het="" ruwe="" t65-product="" de="" no-niveaus="" voldoende="" met="" 57,4="" procent="" vergeleken="" met="" de="" no="" geproduceerd="" door="" 1="" ug/ml="" lps.="" op="" basis="" van="" remming="" van="" no="" geproduceerd="" in="" de="" lps-geïnduceerde="" raw264.7-macrofaagcellijn,="" kan="" het="" t65-kweekextract="" worden="" beschouwd="" als="" een="" krachtige="">

DPPPHrRaaddicial lsScacvaveennggininggpAerccteivnitayges bij verschillende concentraties en IC50-waarde van T65 ruw product worden gegeven in Tabel S5. Ascorbinezuur (vitamine C) werd als standaard gebruikt omdat het wordt gebruikt in lotions, crèmes, serums en pleisters, waarvan bekend is dat ze krachtige antioxiderende activiteiten hebben voor plaatselijke toepassingen [42]. De IC50 voor DPPH radicale wegvangende activiteiten voor secundaire vitamine C- en T65-producten bleek respectievelijk 5,01 en 6,31 ug/ml te zijn (Figuur 3).

Er zijn slechts een paar studies over de antioxidantactiviteiten van bacteriële isolaten in vergelijking met die van plantaardig materiaal en de meeste studies hebben zich gericht op gevestigde plantaardige producten [43-49]. Een concentratie van 10 ug/ml product was in staat 68,66 ± 2,83 procent van de DPPH-vrije radicalen op te vangen. De IC50 van ruw T65-product was bijna vergelijkbaar met die van de sterkste antioxidant vitamine C, waaruit bleek dat het als antioxidant kan worden gebruikt bij de formulering van cosmeceuticals.

3.5.1. Cytotoxiciteit in CCD-986Sk-cellen

Cytotoxiciteit van ruwe verbindingen van T65 in humane dermale fibroblastcellen (HDF) werd geëvalueerd in de CCD-986Sk-cellijn met behulp van de MTT-assay. Wanneer de concentratie van T65 ruw product van 0 tot 1 mg/ml werd geleverd, prolifereerden de HDF-cellen op een dosisafhankelijke manier tot de concentratie van 500 ug/ml. Dit resultaat toonde aan dat de ruwe verbindingen van T65 niet-cytotoxisch waren voor HDF-cellen. Een concentratie van meer dan 1 mg/ml bleek echter cytotoxisch te zijn en slechts 81,34 procent van de cellen overleefde in vergelijking met de controle (Figuur 4).

3.5.2. Proliferatie van HDF

De proliferatie van HDF-cellen werd bepaald met behulp van de CCD{{0}}Sk-cellijn. T65 ruw product prolifereerde de HDF-cellen op een concentratieafhankelijke manier van 0 tot 500 ug/ml (Figuur 5). Het was echter cytotoxisch bij een concentratie van 1 mg/ml. De groei van menselijke dermale epitheelcellen bevestigde het vermogen om rimpels te verbeteren door de verandering in de primaire gekweekte cellen geïsoleerd uit menselijke dermale cellen en uitgescheiden collageen [50,51].

3.5.3. Collageen Type I Synthese

Synthese van collageen type I werd gedetecteerd met ELISA. Het ruwe product van T65 bij 250 pg/ml verhoogde de concentratie van collageen type I op een dosisafhankelijke manier tot 145,91 procent ± 9,11 procent (gemiddelde ± SD; gemiddelde van 24, 48 en 72 uur). Het resultaat van drie experimenten na 24, 48 en 72 uur toonde de synthese van type I collageen (Figuur 6). Aldus bevestigde dermale celsecretie van collageen vergezeld van menselijke dermale epitheelcelgroei het rimpelverbeterende vermogen van T65-verbindingen.

3.6. Whitening-activiteiten

3.6.1. Cytotoxiciteit in B16F1-cellen

Het resultaat van cytotoxiciteit van ruw T65-product op B16F1-melanoomcellen door de MTT-assay wordt getoond in figuur 8. Het resultaat van incubatie van ruw T65-product in B16F1-cellen vertoonde niet-toxische effecten tot een concentratie van 1 mg/ml. B16F1-cellen prolifereerden op een dosisafhankelijke manier tot een concentratie van 62,5 ug/ml, maar een significante (p < 0,05)="" dosisafhankelijke="" afname="" in="" cellevensvatbaarheid="" werd="" geëvalueerd="" van="" 125="" tot="" 1000="" ug/ml.="" bij="" een="" concentratie="" van="" 1="" mg/ml="" werd="" echter="" 99,12="" procent="" ±="" 4,16="" procent="" van="" de="" levensvatbare="" cellen="" waargenomen="" (figuur="" 8).="" de="" experimentele="" resultaten="" toonden="" aan="" dat="" het="" ethylacetaatextract="" van="" stam="" t65-cultuur="" niet-cytotoxisch="" was="" voor="" de="" b16f1-melanoomcellijn="" en="" kon="" worden="" gebruikt="" bij="" de="" formulering="" van="" cosmetische="" producten="" voor="" het="" bleken="" van="" de="" menselijke="">

3.6.2. Melaninesyntheseremming in B16F10-cellen

Voor bevestiging van het whitening-effect, B16F10-cellen, een cellijn die afscheidt en produceertmelanine in cellen, werden gebruikt. Om de melaninesynthese te bevorderen, werd B16F10 aangevuld met 1 ug -MSH. Arbutine (100 ug/ml; een in de handel verkrijgbaar bleekmiddel) werd als positieve controle gebruikt. De microscopische observatie van dit experiment toonde bijna volledige remming van melanine door toepassing van 125 ug/mL T65-kweekextract in 48 uur (Figuur 9A, B). Dit experiment bewees dat T65-kweekextract het potentieel heeft om de melaninesynthese op een dosisafhankelijke manier te remmen en kan worden gebruikt als bleekmiddel voor de formulering van cosmetische producten voor plaatselijke toepassingen.

3.7. Mesoporeuze Silica Materialen

Mesoporeus materiaal is een materiaal dat poriën bevat met een diameter van 2 tot 50 nm volgens de IUPAC-nomenclatuur (International Union of Pure and Applied Chemistry), en dus is mesoporeus silicamateriaal een silicamateriaal met poriën met een diameter van 2-50 nm. Dit materiaal werd in de jaren 70 voor het eerst gerapporteerd in Amerikaanse octrooien, maar werd niet goed opgemerkt in de verwante gebieden, en dus werd gelijkaardig materiaal opnieuw onafhankelijk onderzocht en gesynthetiseerd door Japan in 1990 [69]. Meer gedetailleerd onderzoek werd gevolgd door Mobil Corporation Laboratories, en zij noemden dit materiaal MCM (Mobil kristallijn materiaal), met voorbeelden zoals MCM-41 of MCM-48, waarvan de mesoporiëndiameter varieert van 2 tot 6 nm [70,71]. Een andere onderzoeksgroep aan de Universiteit van Californië, Santa Barbara, slaagde er 6 jaar later in om een ​​grotere poriegrootte (5-30 nm) mesoporeuze silica te synthetiseren, en ze noemden het SBA (Santa Barbara amorf materiaal)-15 [72] . Mesopore-silicamateriaal werd aanvankelijk ontworpen om als moleculaire zeef te worden gebruikt vanwege zijn eigen structurele karakter, maar heeft onlangs een breed scala aan toepassingen gevonden in medicijnafgifte, katalysator, biosensor, energieopslag, enzovoort.

Er zijn verschillende verschillen in mesoporeuze materialen SBA-15 en MCM-41. De eenvoudigste manier om deze twee te onderscheiden, is echter de wanddikte van silica. De SBA-15 met een dikkere silicawand heeft een stabielere en stijvere structuur in vergelijking met die van MCM-41, die een dunnere wanddikte heeft. Bovendien is de synthetische methode van SBA-15 eenvoudiger dan die van MCM-41. Vanwege deze verschillen werd SBA-15 geselecteerd om het bioactieve ruwe T65-product in de mesoporie van het silicamateriaal te vervoeren.

3.8. Synthese van mesoporeuze silicadeeltjes

Nadat het calcinatieproces gedurende 2 uur onder 200 C en 3 uur continu onder 600 C was uitgevoerd, werd het resulterende witte mesoporeuze silicapoeder verkregen. In dit proces werden SBA-15 van 8 nm-poriën gesynthetiseerd. De deeltjesgroottes van SBA -15 bleken een diameter van 11,539-13,630 mm te hebben (Figuur S4) en werden bepaald door twee verschillende faciliteiten: het Inha University Laboratory en het Changwon National University Laboratory. Bovendien werden alle zes monsters in figuur S4 gesynthetiseerd met dezelfde methode, maar met een andere batch.

Toen het mengsel op 60 ◦C werd gehouden en gedurende 4 dagen onder statische omstandigheden werd bewaard volgens de bovenstaande methode, werd SBA-15 met een porie van 5 nm bekend. Bovendien, toen de temperatuur op 120 ◦C werd gehouden, werd SBA-15 van 10 nm gesynthetiseerd. Volgens de resultaten kan de mesoporiegrootte worden gecontroleerd, afhankelijk van het verouderingsproces [73]. SBA-15 van 10 nm porie (Figuur 11) werd gebruikt voor verdere verwerking omdat mesoporeuze silica-nanomaterialen met grote poriën betere afleveringsacties hebben voor biomoleculen dan de smalle porie [74].

3.9. Duurzame prestatie-evaluatie

Om te bepalen of de mesoporeuze SBA-15 een vermogen tot gecontroleerde afgifte heeft, werden SBA-15 en het ruwe T65-product gecombineerd in DI-water, methanol, acetonitril of ethyleenglycoloplosmiddel. Toen SBA-15 en water werden gemengd, werd de oplossing een slurry vanwege de coagulatie tussen het silica-oppervlak en water. Methanol was een goed oplosmiddel voor zowel silica als ruw T65-product. Vanwege de toxiciteit werd acetonitril echter vervangen door methanol. De deeltjes voor de T65-immersieverhouding werden bepaald door de PV-waarde (Tabel S13). Zoals weergegeven in Tabel S13, nam de PV-waarde van SBA-15 af na onderdompeling met het ruwe T65-product. Hieruit bleek dat de T65-materialen goed waren ondergedompeld in de mesoporeuze silicadeeltjes.

Om te bepalen of er T65 in het deeltje zat, werd T65 zelf onderzocht met HPLC (Figuur S5). Zoals uit de gegevens blijkt, waren er twee specifieke pieken (binnen de rode doos) die altijd zichtbaar waren in het geval van de T65-cultuurextracten, ook al was de T65-bereidingsbatch gewijzigd. Deze twee pieken hadden retentietijden van 10 min en 12 min bij 230 nm. Het filtraatmonster werd onderzocht in HPLC om te bepalen of T65 aanwezig was in de ingebedde SBA-15. Zoals weergegeven in figuur S6, werden twee specifieke pieken waargenomen in de buurt van 10 min en 12 min. Bovendien werd een kleine piek waargenomen in de buurt van 18 min retentietijd, wat erg belangrijk is om de T65-producten te traceren die in de tijd worden vrijgegeven.

Afbeelding 12 geeft de gecontroleerde afgifte weer van de duurzame test van T65 embedded SBA-15 van 0 tot 3 dagen. De specifieke piek van T65 was zichtbaar in de buurt van 15 en 20 minuten van dag 0 tot 3. De ruwe T65-producten werden op de juiste manier ondergedompeld en werden in de loop van de tijd geleidelijk uitgescheiden. Bovendien konden de mesoporeuze silicamaterialen (SBA-15) die in dit onderzoek werden voorgesteld, fysiologisch actieve stoffen in het ruwe T65-product bevatten en bevestigden dat de fysiologisch actieve stoffen na het laden op een manier met aanhoudende afgifte werden afgegeven. Bovendien zou het mesoporeuze silicamateriaal dat in deze studie wordt voorgesteld, in de toekomst kunnen worden gebruikt als een goede drager om verschillende functionele materialen te impregneren en als materiaal met aanhoudende afgifte door verschillende fysiologisch actieve stoffen te ondersteunen.

4. Conclusies

Secundaire bioactieve materialen gewonnen uit de bodemmicro-organismen zijn van belang voor cosmetische toepassingen vanwege hun antimicrobiële, antioxiderende, antirimpel-, huidblekende en antimicrobiële werking. Deze studie beschrijft de nieuwe activiteit van ethylacetaatextract van stam T65-cultuur voor de functionele ingrediënten in cosmetische formuleringen. Het ruwe T65-product was niet-toxisch voor de verschillende cellijnen, zoals HaCaT (menselijke keratinocyt), RAW264.7 (macrofaagcel), CCD-986Sk (menselijke huidfibroblastcel) en B16F1- en B16F10-melanoomcellen . Bovendien vertoonde het ruwe T65-product een opregulatie van de collageentype I-synthese, wat erg belangrijk is voor het verminderen van rimpels op de huid. Bovendien remde het ruwe T65-product voldoende de menselijke pathogene bacteriën zoals B.subtilis, E. coli, P. acnes, S. aureus en S. epidermidis, wat kan helpen bederf van het cosmetische product en kolonisatie van pathogene bacteriën te voorkomen het vormen van acne vulgaris op de menselijke huid. Bovendien remde het ruwe T65-product het paddenstoelentyrosinase voor whitening-effect en varkenspancreas-elastase voor anti-verouderingsactiviteiten, en remde het NO en weggevangen DPPH-radicalen voor antioxiderende activiteiten. Synthese van mesoporeuze silicadeeltjes, SBA-15, bewees dat het ruwe T65-product effectief zou zijn in cosmeceutische formuleringen met effectieve gecontroleerde afgifte-eigenschappen. Ten slotte bewees in vivo toepassing van geformuleerd cosmetisch product samen met ruw T65-product op de gezichten van vrijwilligers het whitening- en anti-rimpeleffect van T65. De chemie van verschillende bioactieve verbindingen en de moleculaire mechanismen die verband houden met de verschillende enzymremming en pathogene remmingsactiviteiten moeten echter nog worden ontdekt. Concluderend ondersteunde onze studie het idee dat bacteriële middelen kunnen worden toegevoegd aan plaatselijk aangebrachte cosmetische producten voor een witmakend effect, anti-rimpelvorming, antioxiderend effect en antimicrobiële activiteiten.

cistanche pharma special

Voor meer details, klik hier.