In vitro en in Silico inzichten in tyrosinaseremmers
Mar 28, 2022
Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a
Abstract
Tyrosinase is een sleutelenzym dat verantwoordelijk is voor de biosynthese van melanine en is effectief in het beschermen van huidbeschadiging veroorzaakt door ultraviolette straling. Als onderdeel van de voortdurende inspanningen om krachtige tyrosinaseremmers te ontdekken, hebben we systematisch dertien (E)-benzylideen-1-indanonderivaten (BID1-13) ontworpen en gesynthetiseerd en hun remmende activiteit tegen tyrosinase bepaald. Van de geëvalueerde verbindingen was BID3 de krachtigste remmer van paddenstoelentyrosinase (IC50=0,034 mM, mycofenolaatactiviteit; IC50=1,39 mM,difenolenactiviteit). Kinetische studies lieten zien dat BID3 een gemengd type tyrosinaseremming vertoonde met een Ki-waarde van 2,4 mM met L-DOPA als substraat. In silico toonden moleculaire dockingsimulaties aan dat BID3 kan binden aan de katalytische en allosterische plaatsen van tyrosinase om enzymactiviteit te remmen, wat in vitro experimentele studies tussen BID3 en tyrosinase bevestigde. Bovendien nam het melaninegehalte af en werd de cellulaire tyrosinase-activiteit geremd na behandeling met BID3. Deze waarnemingen onthulden dat BID3 een krachtige tyrosinaseremmer is en mogelijk zou kunnen worden gebruikt als bleekmiddel voor de behandeling van aan pigmentatie gerelateerde aandoeningen.
Cistanche: huidbleekmiddel kruid
1. Inleiding
Melanine wordt gesynthetiseerd door melanocyten in de vazallaag van de epidermis. Dit verwijst in het algemeen naar de familie van pigmenten die algemeen bekend staat om de bescherming van de huid van zoogdieren tegen schade veroorzaakt door schadelijke UV-straling door vrije radicalen op te vangen of binnenkomend UV-licht te verspreiden [1]. Een overvloedige aanmaak van melanine kan echter zichtbare hyperpigmentatie van de epidermis veroorzaken, wat duidelijk kan zijn als melasma, sproeten, ouderdomsvlekken of seniele lentigines [2].
Tyrosinase (EC 1.14.18.1), een koperhoudend metallo-enzym, is een sleutelenzym dat betrokken is bij melanogene processen. Tyrosinase katalyseert de twee snelheidsbeperkende stappen in melanogenese; hydroxylering van tyrosine (cresolase- of mycofenolaatactiviteit) om 3,4-dihydroxyfenylalanine (L-DOPA) te produceren en de daaropvolgende oxidatie van L-DOPA (catecholase- of difenolactiviteit) tot het overeenkomstige DOPA-chinon. Wanneer L-tyrosine het substraat is, is het product van de door tyrosinase gekatalyseerde reactie DOPA-chinon, dat vervolgens wordt omgezet in melanine [3]. Deze stappen zijn cruciaal voor de bescherming van de huid tegen UV-schade. Mushroom Agaricus is gewend aan zijn in de handel verkrijgbare en hoge homologie met het enzym tyrosinase van zoogdieren, waardoor het zeer geschikt is als model voor studies naar melanogenese [4]. Bij mensen helpt melanine de huid te beschermen tegen de schade veroorzaakt door UV [5]. Het overmatige niveau van melanine kan echter verschillende dermatologische aandoeningen veroorzaken, waaronder hyperpigmentaties, melasma, sproeten en ouderdomsvlekken [6]. Daarom zijn newtyrosinaseremmers die medicijnachtige en huidblekende eigenschappen vertonen vereist om overmatige huidpigmentatie te remmen.
1-Indanon, met een benzoyl-cyclopentanonskelet, wordt beschouwd als de starre neven van chalconen, met het onverzadigde ketonensysteem van chalconen dat een cyclische 5-ledige ring vormt, een natuurlijk voorkomend bestanddeel dat aanwezig is in verschillende eetbare plantaardige bronnen [7 ]. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat verbindingen met een 1-indanongroep van farmacologisch belang zijn, aangezien ze verschillende gunstige biologische activiteiten vertonen, waaronder ontstekingsremmende [8-10], kankerbestrijdende [11,12], antioxidant [13], anti-Parkinson's ziekte [14], anti-Alzheimerziekte [15-17], antimicrobiële [18], anti-immuun onderdrukkende [19] en anti-tyrosinase [20] eigenschappen.
Chalconen (1,3-diaryl-2-proper-1-onen) zijn aromatische ketonen bestaande uit twee aromatische ringen gekoppeld aan een drie-koolstof a,b-onverzadigd carbonylsysteem als centrale kern [21, 22]. Dit zijn natuurlijk voorkomende componenten die worden aangetroffen in verschillende eetbare natuurlijke planten en worden beschouwd als voorloperverbindingen voor een synthetische route van flavonoïden en isoflavonoïden zoals pyrazolines, pyrimidine, flavanol, flavonen, flavanonen, isoflavonen, auronen, anthocyanidine, dihydroflavanol en dihydrochalcon [23-25]. Het a,b onverzadigde carbonylsysteem is van het grootste belang voor het type biologische activiteit, aangezien deze systemen worden verspreid in veel natuurlijke producten zoals chalconen en indanon, waar de moleculaire relatief vlakker zijn, en de overdracht van de elektronische effecten van de arylsubstituenten gericht is. aan de carbonylgroep [7]. Eerder rapporteerden veel onderzoekers dat chalconen in verschillende publicaties werden benadrukt als een nieuwe klasse van tyrosinaseremmer [26-29]. Onlangs hebben Kim en collega's [30,31] een reeks chalconderivaten ontworpen en gesynthetiseerd en deze geëvalueerd op hun in vitro anti- tyrosinase en anti-melanogene activiteiten tegen muriene melanocyten.
Volgens onze eerder gerapporteerde gegevens vertoonden derivaten met een (E)-b-fenyl-a,b-onverzadigde carbonylsteiger potenttyrosinase-remming [32-34]. (E)-Benzylideen-1-indanonen kunnen een aantrekkelijk anti-melanogeen middel zijn, aangezien de verbindingen de (E)-b-fenyl-a,b-onverzadigde carbonylstructuur in hun chemische structuur hebben. Met name Radhakrishnan et al. (2015) [20]ontwierp en synthetiseerde een reeks benzylideen-1-indanonderivaten met een (Z)-configuratie en evalueerde ze op anti-tyrosinase-activiteit. Hoewel deze (Z)-benzylideen-1-indanonderivaten zijn onderzocht, moeten de anti-tyrosinase en anti-melanogene activiteiten van (E)-benzylideen-1-indanonderivaten nog worden onderzocht.
Daarom hebben we dertien verbindingen (BID1-13) van het 1-indanonskelet ontworpen en gesynthetiseerd die een (E)-vorm benzylideen dragen. Van deze synthetische verbindingen vertoonde een 2,4-dihydroxygroep op de B-ring van 1-indanon de grootste tyrosinaseremming (ongeveer 400-maal effectiever dan kojiczuur, positieve controle). Bovendien evalueren we BID3-tyrosinase-remmende activiteit verder en karakteriseren we de regulerende rol ervan in melaninesynthese met behulp van B16F10-melanoomcellen. In uitgebreide experimenten evalueerden we het anti-melanogene potentieel van BID3 en probeerden we de enzymkinetiek en moleculaire dockingstudies te identificeren. In opeenvolgende experimenten werden ook het BID3- cellulaire tyrosinasepotentieel en de melanineproductie in a-MSH- en IBMX-geïnduceerde B16F10-melanoomcellen onderzocht.
ANTI-OXIDATIE EN HUIDVERBINDING: CISTANCHE EXTARCT
2. materialen en methoden
2.1. Reagentia
Paddenstoelentyrosinase (EC 1.14.18.1), alfa-melanocyt-stimulerend hormoon (a-MSH), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), L-tyrosine, L-3,{{ 11}}dihydroxyfenylalanine (L-DOPA), dimethylsulfoxide (DMSO), kojinezuur, ftaalzuur en trans-kaneelzuur werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), streptomycine en amfotericine werden gekocht bij WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Zuid-Korea). Alle andere reagentia werden gekocht bij Sigma-Aldrich.
2.2. Chemie
2.2.1. Algemene methoden
Alle reagentia werden commercieel verkregen en zonder verdere zuivering gebruikt. Dunnelaagchromatografie (TLC) en kolomchromatografie werden uitgevoerd op respectievelijk Merck voorgecoate 60F245-platen en MP Silica 40-63, 60 A. Hoge resolutie (HR) massaspectroscopiegegevens werden verkregen op een Agilent AccurateMass quadruple-time of flight (Q-TOF) vloeistofchromatografie (LC) massaspectrometer (Agilent, Santa Clara, CA, VS) in ESI-positieve modus. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectra werden opgenomen op een Varian Unity INOVA 400-spectrometer of een Varian UnityAS500-spectrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VS) voor respectievelijk 1H NMR (400 en 500 MHz) en voor 13C NMR (100 MHz), respectievelijk . DMSO d6, CD30D en CDC13 werden gebruikt als NMR-oplosmiddelen voor NMR-monsters. Koppelingsconstante (J) en chemische verschuivingswaarden werden gemeten in respectievelijk hertz (Hz) en delen per miljoen (ppm). De afkortingen die worden gebruikt bij de analyse van 1H NMR-gegevens zijn als volgt: s (singlet), bs (breed singlet), d (doublet), dd (doublet van doubletten), t (triplet), TD (triplet van doubletten), q ( kwartet), andm (meerdere).
2.2.2. Procedure voor de synthese van BID1-13
Een oplossing van benzaldehyde (1,1-1,2 equiv.) en 1-indanon (100 mg, 0,76 mmol) in 1 M in HCl-azijnzuur (0,4 ml) werd bij kamertemperatuur geroerd voor 4-48 uur. Na toevoeging van water werden de precipitaten gefiltreerd en gewassen met water en hexaan: ethylacetaat (1:1), hexaan:dichloormethaan (4:1–1:1), of een mengsel van dichloormethaan en methanol, afhankelijk van de eigenschappen van de overblijvende benzaldehyden om (E)-benzylideen-1-indanonen (BID1-13) te geven in opbrengsten van 32,8-99,1 procent. Structurele karakterisering (1H en 13C NMR en massagegevens van alle BID's) van gesynthetiseerde verbindingen wordt gegeven in Aanvullende informatie.
2.2.2.1. (E)-2-(4-Hydroxybenzylideen)-2,3-dihydro-1H-inden-1-een(BID1).
Geel vast; opbrengst, 93,4 procent; reactietijd, 6 uur; molecuulformule, C16H12O2; mp, 224,7-225,9 C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,64-7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinyl H), 7,39 (t,1H, J=7,2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8,0 Hz, 30-H, {{46 }}H), 3,99 (s, 2H,CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 160,1, 150,4, 138,3,135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 126,7, 124,1, 116,7, 32,6;HRMS (ESI plus ) m/z C16H13O2 (M plus H) plus berekend 237,0910, obsd 237,0911.
2.2.2.2. (E)-2-(3,4-Dihydroxybenzylideen)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID2).
Geel vast; opbrengst, {{0}},6 procent; reactietijd, 5 uur; molecuulformule, C16H12O3; mp, 251,2-252,4 C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H,J=7 0,6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1H,J {{35 }}.2 Hz, 6-H), 7.35 (s, 1H, vinyl H), 7.19 (s, 1H, 20-H), 7.08 (d,1H , J=8,0 Hz, 60-H), 6,83 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-}H), 3,98 (s, 2H,CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,8, 150,4, 148,7, 146,3,138,3, 135,1, 134,5, 132,0, 128,2, 127,3, 127,1, 125,0, 124,0,118,2, 116,7, 32,7; HRMS (ESI plus ) m/z C16H1303 (M plus H) plus calcd253.0859, obsd 253,0857.
2.2.2.3. (E)-2-(2,4-Dihydroxybenzylideen)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID3).
Geel vast; opbrengst, 5{{20}},9 procent; reactietijd, 10 uur; molecuulformule, C16H12O3; mp, 198,5-199,9 C (dec.); 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinyl H), 7,82 (d, 1H, J=8,0 Hz,60-H), 7,67-7,63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7,0 Hz, 6-H), 6,45 (d , 1H, J=8,5 Hz, 50-H), 6,39 (s, 1H, 30-H), 4,01 (s, 2H,CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 161,6, 160,4, 150,3,138,6, 134,8, 131,7, 130,3, 128,7, 128,1, 127,2, 123,9, 114,3,108,6, 103,1, 32,7; HRMS (ESI plus ) m/z C16H1303 (M plus H) plus calcd253.0859, obsd 253,0858.
2.2.2.4. (E)-2-(4-Hydroxy-3-methoxybenzylideen)-2,3-dihydro-1Hinden-1-een (BID4).
Geel vast; rendement, 52.0 procent; reactietijd, 4 uur; molecuulformule, C17H14O3; mp, 186,9–187,4°C; 1H NMR(400 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,67-7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7,43(t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinyl H), 7,24 (dd, 1H, J=8.0,2.0 Hz, 60-H), 6.87 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 4.05 (s, 2H, CH2 ), 3,84(s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 150,5,149,7, 148,5, 138,3, 135,2, 134,4, 132,3, 128,2, 127,3, 127,1,125,7, 124,1, 116,6, 115,4, 56,3, 32,5; HRMS (ESI plus ) m/z C17H1503(M plus H) plus berekend 267,1016, obsd 267,1016.
2.3. Biologische evaluatie
2.3.1. Paddestoel tyrosinase remmende test
Tyrosinase-remmende activiteitstest werd uitgevoerd met behulp van paddenstoelentyrosinase zoals eerder beschreven, met kleine modificatie [35,36]. In het kort, 10 ml van een gespecificeerde concentratie van elke verbinding (0,0005-50 mM) en 20 ml paddenstoelentyrosinase (1000 eenheden/ml) in een 50 mM fosfaatbuffer (pH 6,5) werden toegevoegd aan een reactie van 170 ml mengsel in een 96-well microplaat (Corning, VS). De verhouding van 1 mM L-tyrosine- of L-DOPA-oplossing, 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 6,5) en gedestilleerd water was 10:10:9. Reactiemengsels werden gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Daarna werd de hoeveelheid dopachroom die in elk putje werd geproduceerd, gemeten door spectrofotometrische analyse bij 492 nm (OD492) met behulp van een microplaatlezer. De mate van tyrosinaseremming (procent) werd berekend als (1 Abssample/Abscontrol) 100 procent. De mate van remming van het monster werd uitgedrukt als de concentratie die nodig is voor 50 procent remming (IC50).
2.3.2. Enzymkinetische analyse met tyrosinase
Om de kinetische mechanismen van remming te bepalen, werden twee complementaire kinetische methoden gebruikt: Lineweaver-Burk en Dixonplots [37-39]. Met behulp van Lineweaver-Burk-plots (dubbele reciprocalplots) werd het remmingstype van BID3 bepaald met behulp van verschillende concentraties L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 en 1 mM), als substraten, in de afwezigheid en aanwezigheid van verschillende concentraties BID3 (1, 2 en 4 M). Een Dixon-plot (enkele reciproke plots) fortyrosinase-remming werd verkregen in aanwezigheid van verschillende concentraties L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 en 1 mM ). De concentraties van BID3 waren 1, 2 en 4 mM. De enzymatische procedures bestonden uit de eerder beschreven tyrosinase-assaymethoden. De remmingsconstante (Ki) werd bepaald uit de interpretatie van Dixon-plots.
2.3.3. Moleculaire dockingsimulaties van tyrosinase
Om de structuur van het enzym-remmercomplex te bepalen en om de nauwkeurigheid, herhaalbaarheid en betrouwbaarheid van de koppelingsresultaten te garanderen, hebben we AutoDock4.2-software gebruikt. Voor dicking-onderzoeken werden de kristalstructuren van het paddenstoeltyrosinase-eiwitdoel verkregen uit de eiwitsequentie-uitlijning (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (//www.rcsb.org/adb) [40]. Geautomatiseerde docking-simulaties werden uitgevoerd tussen tyrosinase en kojiczuur, ftaalzuur, kaneelzuur of BID 3. Voor de koppelingsprocedure: 2D omgezet in 3D-structuren, berekende ladingen en toegevoegde waterstofatomen met behulp van het ChemOffice-programma (http://www.cam bridgesoft.com) [41 LigandScout 4.1.5 werd gebruikt voor de voorspelling van mogelijke interacties tussen liganden en tyrosinase en de identificatie van farmacoforen.
2.3.4. Celcultuur en cellevensvatbaarheidstest
Muizenmelanoom B16F10-cellen werden gekocht van de Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) en gekweekt in DMEM aangevuld met 10 procent FBS en 1 procent streptomycine, en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C, bevochtigd met 5 procent atmosferische CO2. Cellevensvatbaarheidsanalyses werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [42]. In het kort werden cellen 24 uur lang uitgezaaid met een dichtheid van 1 104 cellen/putje in een 96-putjesplaat. De volgende dag werden de cellen blootgesteld aan verschillende concentraties BID3 en respectievelijk 24 of 48 uur geïncubeerd. Vervolgens werd 10 ml EZ-Cytox-oplossing aan elk putje toegevoegd en werden de cellen 2-4 uur geïncubeerd. Absorptie werd bepaald met behulp van ELISA bij een golflengte van 450 nm. Elke test werd in drievoud uitgevoerd.
2.3.5. Melanine inhoudstest
Het melaninegehalte werd bepaald zoals eerder beschreven [43]. B16F10-melanoomcellen (2105 cellen/putje) werden uitgezaaid in kweekplaten met 6-putjes. Om het remmende effect van BID3-onmelanogenese te bepalen, werd vers medium vervangen door medium met BID3 (1, 5 en 10 M) of kojiczuur (10 mM) als positieve controle gedurende 1 uur, en vervolgens gestimuleerd met a-MSH (5 M ) en IBMX (200 mM) gedurende 48 uur. Na tweemaal gewassen te zijn met PBS, werden de cellen losgemaakt door incubatie in Trypsine/EDTA, en werden de pellets opgelost in 100 ml 1 N NaOH, en vervolgens geïncubeerd bij 60°C voor 1 hand gemengd om de melanine op te lossen. Het melaninegehalte werd bepaald door de absorptie bij 405 nm te meten met behulp van de ELISA-lezer (TECAN, Sunrise, Oostenrijk). Het melaninegehalte werd berekend met behulp van de volgende vergelijking: (monster/controle) - 100 procent. Alle bepalingen werden in drievoud uitgevoerd.
2.3.6. Cellulaire tyrosinase-activiteit
Cellulaire tyrosinase-activiteit werd beoordeeld zoals eerder beschreven, met kleine wijzigingen [44,45]. In het kort werden 2 105/cellen uitgeplaat in 6-putjesschalen en overnacht geïncubeerd. De cellen werden gedurende 1 uur blootgesteld aan verschillende concentraties BID3 (1, 5 en 10 mM) orkojiczuur (10 mM) en vervolgens gedurende 48 uur gestimuleerd met a-MSH (5 mM) en IBMX (200 mM). Na tweemaal te zijn gespoeld met PBS, werden de cellen gelyseerd met 100 ml lysisoplossing die 50 mM fosfaatbuffer (pH 6,5), 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 1% Triton X -100 bevatte en gedurende 30 minuten bij 80 ° C ingevroren. Lysaten werden ontdooid en gecentrifugeerd bij 12 000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 C. Vervolgens werd supernatant (80 ml) gecombineerd met 2 mg/ml L-DOPA (20 ml) in een 96-well-plaat . Na 30 minuten incubatie bij 37 ° C werd de optische dichtheid bij 492 nm gemeten met behulp van een ELISA-lezer (TECAN, Salzburg, Oostenrijk). De eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van een BCA-eiwitassayreagens met BCA als standaard (Thermo Scientific, Rockford, IL, VS).
Cistanche-extract voordeel: remt tyrosinase.
2.3.7. statistische analyse
Alle gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). De gegevens werden geanalyseerd door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) om verschillen tussen behandelingen te bepalen, gevolgd door de Bonferroni posthoc-test. Een waarde van p < 0.05="" werd="" als="" statistisch="" significant="">
3. Resultaten en discussie
3.1. Chemie
De (E)-benzylideen-1-indanonderivaten (BID1-13) werden gesynthetiseerd volgens het algemene schema 1. In deze huidige studie werden dertien (E)-2-benzylideen-1-indanonderivaten gesynthetiseerd en hun tyrosinase remmende eigenschappen werden onderzocht. Doelwit (E)-2-benzylideen-1-indanonderivaten werden gesynthetiseerd onder gebruikmaking van zure (1 M HCl in azijnzuur) omstandigheden. Deze reacties genereerden het doel (E)-2-benzylideen-1- indanonderivaten in opbrengsten van 32,8-99,1 procent. Het lijkt erop dat alleen de E-isomeren van 2-benzylideen-1-indanonen werden gegenereerd dankzij de A-stam die bekend staat als de 1,3-allylische stam. De A-stam (sterichindantie) tussen de fenylring en de carbonylgroep in het Z-isomeer is blijkbaar groter dan die tussen de fenylring en de methyleengroep in het E-isomeer. De structuren van synthetische verbindingen werden geverifieerd door 1H en 13C NMR en massaspectrometrie zoals beschreven in de experimentele sectie (Fig. S1-S38). In het bijzonder wordt de chemische verschuiving van olefinisch proton afgeschermd in de E-isomeer van 2- benzylideen vanwege het anisotrope effect van de carbonylgroep en lijkt downfield (boven 7 ppm) vergeleken met de Z-isomeer (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
Schema 1. Synthese van (E)-2-benzylideen-1-indanonen.
3.2. Tyrosinase-remmende eigenschappen van verbindingen
Het tyrosinase-remmende vermogen van de (E)-benzylideen-1-indanonderivaten werd onderzocht met behulp van paddenstoelentyrosinase. Het mycofenolaat (L-tyrosine) en difenolen (L-DOPA) werden gebruikt als substraten voor deze experimenten [35]. Enzymreacties werden uitgevoerd met tyrosinase, substraat en testremmers. Alle geteste verbindingen vertoonden een concentratieafhankelijke remming. De IC50-waarden van de (E)-benzylideen-1-indanonderivaten worden weergegeven in Tabel 1.
In zowel L-tyrosine- als L-DOPA-substraten vertoonde BID3 een sterke remmende activiteit met IC50-waarden van 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM en 1,39 ± 0.00004 mM, vergeleken met het positieve controle-kojiczuur, dat IC50-waarden had van respectievelijk 13,77 ± 0,20 mM en 33,14 ± 0,93 mM (Fig. 1A). Verder vertoonde BID6 een krachtige activiteit tegen L-tyrosine en L-DOPA met IC50-waarden van respectievelijk 5,00 ± 0,91 mM en 53,11 ± 2,79 mM. BID1 vertoonde een significante remming van tyrosinase via L-tyrosine en L-DOPA-pathways, met IC50-waarden van respectievelijk 39,74 ± 3,71 mM en 130,0 ± 5,39 mM. BID4 en BID11 vertoonden matige tyrosinaseremmende activiteit. Andere derivaten waren inactief. Evenzo vertoonde BID2 significante activiteit ten opzichte van L-tyrosine en L-DOPA, met IC50-waarden van 41,27 ± 3,03 mM en 52,93 ± 2,62 mM. Bovendien vertoonden gerapporteerde gemengde type remmers, ftaalzuur en kaneelzuur geen remmende effect bij een concentratie van 200 mm [47].
In overeenstemming met de bevindingen van onderzoeken naar structuur-activiteitsrelaties (SAR), hadden derivaten die (E)-benzylideen-1-indanonsubstituenten op de fenylring bevatten een aanzienlijke invloed op de remming van potentiaaltyrosinase. BID3, dat tyrosinase met de hoogste potentie remde, draagt een 2-hydroxygroep in aanwezigheid van een 4-hydroxygroep en remde sterk de tyrosinase-activiteit (BID1 vsBID3). Deze resultaten suggereerden dat de 2,4-dihydroxygroep (resorcinolgroep) in de fenylringstructuur verantwoordelijk kan zijn voor de verhoogde remming van tyrosinase. Interessant is dat we in een eerdere studie naar potentiële synthetische tyrosinaseremmers hebben aangetoond dat de 2,4-dihydroxysubstitutie de tyrosinase-activiteit sterk remde [48,49]. Bovendien gaven onze SAR-gegevens ook aan dat de introductie van een 3-hydroxygroep in aanwezigheid van een 4-hydroxygroep de remming van tyrosinase beïnvloedt. Deze verschijnselen werden aangetoond door de bevinding dat een 4-methoxy-3-hydroxyfenylring de remmende activiteit tegen tyrosinase verhoogde, terwijl de introductie van een 3,4-dihydroxygroep (catecholgroep) de remmende activiteit van tyrosinase verminderde ( BID2 versus BID6) [35]. Deze resultaten suggereren dat de 3-hydroxy-4-methoxygroep ook verantwoordelijk is voor de remmende activiteit van fortyrosinase. Desalniettemin vertoonden BID9 en BID11, die 2,4-dimethoxyfenyl- of 3,5-dimethoxyfenylgroepen bevatten, in onze huidige studie een matige tyrosinase-remmende activiteit. Gebaseerd op IC50-waarden via de L-tyrosine- en L-DOPA-route, vertoonde BID3 de meest krachtige tyrosinaseremmende activiteit. Daarom hebben we het onderliggende mechanisme van dit remmende effect verder bestudeerd. Radhakrishnan et al. (2015) [20] meldde dat hydroxyl-gesubstitueerde (Z)-benzylideen-1-indanon krachtige tyrosinaseremmers vormt. Hoewel eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat hydroxyl-gesubstitueerde (Z)-benzylideen-1-indanonderivaten anti-tyrosinase-activiteit hebben, zijn er, voor zover wij weten, geen meldingen van tyrosinaseremming door (E)-benzylideen-1- indanonderivaten met behulp van celgebaseerde experimenten.
Tabel 1. Paddenstoel-tyrosinaseremmend vermogen van het gesubstitueerde 2,3-dihydro-1H-inden-1-on (1-indanon) chalcon-achtige
derivaten (BID1-13).
Fig. 1. Concentratie-afhankelijke remming van paddestoeltyrosinase-activiteit door BID3 en kojiczuur (positieve controle) (n=3).
3.3. Enzymkinetische analyse van tyrosinaseremming
Omdat BID3 de krachtigste remmer was, hebben we het onderliggende mechanisme van het remmende effect verder bestudeerd. In een poging om de wijze van enzymremming te verklaren, werden kinetische analyses uitgevoerd bij verschillende concentraties L-DOPA en verschillende BID3-concentraties. Dixon- en Lineweaver-Burk-plots werden getekend met behulp van de gegevens verkregen uit de kinetische onderzoeken om het remmingspatroon te bevestigen en de remmingsconstanten (Ki) werden bepaald door interpretatie van Dixon-plots (Fig. 2A en B). De concentratie van L-DOPA wordt als volgt aangegeven: 1, 2, 4 mM. De kruising ligt aan de linkerkant, wat wijst op gemengde type remming tegen tyrosinase met een Ki-waarde van 2,4 mM (Fig. 2B). De Ki-waarde vertegenwoordigt de concentraties die nodig zijn om een enzym-remmercomplex te vormen, dus een remmer met een lagere Ki-waarde duidt op een grotere tyrosinase-remmingsactiviteit.
Moleculaire koppeling heeft gedurende vele jaren belangrijke inzichten in de ontdekking van geneesmiddelen bijgedragen. Dockingprocedures zijn echter gericht op het identificeren van de juiste posities van liganden in de bindingsholte van aproteïne en om de affiniteit tussen ligand en eiwit te voorspellen. Met andere woorden, docking beschrijft een proces waarbij twee moleculen bij elkaar passen in een driedimensionale ruimte. Om te bepalen of BID3 bindt aan de actieve plaats van tyrosinase, werd moleculaire docking-analyse uitgevoerd om de mogelijke bindingsposities van BID3 in de kristalstructuur van paddenstoelentyrosinase te identificeren (PDB ID: 2Y9X) (Fig. 3A). Deze resultaten zijn berekend met AutoDock4.2. programma. De meest stabiele bindingspositie was die met de laagste score [50]. Onlangs hebben Hassani et al. [47] meldde dat kaneelzuur en ftaalzuur mixed-mode tyrosinaseremmers waren. Zo werden hulp, kaneelzuur en ftaalzuur gebruikt om de koppelingsresultaten te valideren [51]. De moleculaire koppelingsmodellen van BID3 en kojiczuur (bekende competitieve type remmer) in de katalytische plaats van tyrosinase worden geïllustreerd in Fig. 3B [52 ]. Het tyrosinase-BID3-remmercomplex vertoonde 6,28 kcal/mol bindingsenergie, waaronder twee waterstofbindingen met de ASN260- en MET280-resten van tyrosinase, en hydrofobe interacties werden waargenomen tussen BID3- en tyrosinaseresten VAL248, PHE264 en VAL283, wat de interactie in de katalytische plaats verder stabiliseerde paddenstoeltyrosinase (Tabel 2 en Fig. 3E en H). Bovendien zijn moleculaire koppelingsmodellen van BID3, ftaalzuur (allostere remmer 1) en kaneelzuur (allostere remmer 2) in de twee allostere plaatsen geïllustreerd in Fig. 3C en 3D. Ftaalzuur en kaneelzuur werden als referentieliganden genomen op respectievelijk allosterische plaatsen 1 en 2 [47,51]. Zoals getoond in Fig. 3F en I, vertoonden BID3 en ftaalzuur een waterstofbinding met de TRY140-rest van tyrosinase en drie hydrofobe interactieresten met de LEU24, PHE147 en ILE148 van tyrosinase op allosterische plaats 1. De overeenkomstige ligand-interacties van BID3 en kaneelzuur in de allosterische plaats2 van tyrosinase omvatte waterstofbindingen tussen ASP312 en LYS376 van tyrosinase, terwijl THR308 hydrofobisch een interactie aanging op allosterische plaats 2 (Fig. 3G en J). Bovendien bleek BID3-tyrosinasebinding bindingsenergie uit te oefenen in beide allosterische plaatsen van tyrosinase (respectievelijk 4,38 en 5,68 kcal/mol), wat wijst op een hoge bindingsaffiniteit met beide allosterische plaatsen. Op basis van enzymkinetische studies oefende BID3 een gemengde remming uit, de bindingscapaciteit van BID3 met zowel de katalytische plaats als twee allosterische plaatsen bevestigde de gemengde remming van tyrosinase.
Fig. 2. Lineweaver-Burk (A) en Dixon-plots (B) voor de remming van paddenstoelentyrosinase door BID3 met L-DOPA als substraat.
3.4. Biologische activiteiten
Om de anti-tyrosinase-effecten van BID3 in het celcultuurmodel te benutten, hebben we de cytotoxische effecten ervan op B16F10-cellen onderzocht. Cellen werden 48 uur behandeld met verschillende concentraties BID3 (1-20 mM) en beoordeeld met behulp van de EZ-Cytox-assay. De resultaten gaven aan dat BID3 geen significant cytotoxisch effect had in B16F10-melanomacellen tot 20 mM (Fig. 4A en B). Daarom werden daaropvolgende experimenten uitgevoerd met BID3 tot 20 mM.
Tabel 2 Bindingsplaatsen en koppelingsscores van BID3 in paddestoeltyrosinase (PDB ID: 2Y9X) zoals bepaald met behulp van het AutoDock4.2-programma.
Melanogenese wordt gereguleerd door een enzymatische tyrosinase-cascade. Om deze reden zijn er verschillende huidblekende verbindingen ontwikkeld om de tyrosinase-activiteit te verminderen. Kojiczuur, een tyrosinaseremmer, werd gebruikt als een positieve controle [53]. Om de effecten van BID3 op door cAMP-elevatie geïnduceerde hyperpigmentatie te onderzoeken, werden B16F10-cellen dus behandeld met a-MSH en IBMX in aanwezigheid van BID3 (1, 5 en 2{{2{0}}} mM) gedurende 48 uur, en de melanine-inhoud en cellulartyrosinase-activiteiten werden bepaald (Fig. 4C en D). Behandeling met a-MSH en IBMX induceerde een significante toename (P <0,001 #)="" in="" melaninegehalte="" (fig.="" 4c)="" en="" cellulaire="" tyrosinase-activiteit="" (fig.="" 4d)="" in="" b16f10-cellen="" vergeleken="" met="" de="" onbehandelde="" controle.="" bid3-behandeling="" echter="" significant="" (p="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" en="" concentratieafhankelijke="" verlaagde="" melaninegehaltes="" en="" cellulaire="" tyrosinase-activiteit="" van="" b16f10-cellen="" vergeleken="" met="" met="" a-msh="" ofibmx="" behandelde="" cellen,="" wat="" aangeeft="" dat="" de="" afname="" van="" cellulair="" melanine="" te="" wijten="" kan="" zijn="" aan="" de="" remming="" van="" tyrosinase-activiteit="" .="" deze="" bevindingen="" tonen="" dus="" duidelijk="" aan="" dat="" bid3="" anti-melanogene="" effecten="" uitoefende="" die="" de="" tyrosinase-activiteit="" en="" melaninesynthese="" in="" b16f10-cellen="" remden="" zonder="" cytotoxiciteit="" te="">
Indanon is een van de bevoorrechte structuren van de medicinale chemie en wordt over het algemeen geassocieerd met een verscheidenheid aan farmacologisch actieve verbindingen [54]. De indanongroep is aanwezig in een verscheidenheid aan fysiologisch actieve natuurlijke producten. Met het oog hierop rapporteerde Okpekonet al., [55] dat een nieuwe 1-indanonverbinding is geïsoleerd uit Uvaria-wortels. Deze verbinding is het eerste 1-indanonderivaat dat uit planten wordt geïsoleerd. Nagle et al., [56] meldden dat een nieuw gemethyleerd indaan-aldehyde werd geïsoleerd uit marinecyanobacterium als een regulator van tumorangiogenese. Evenzo hebben onderzoekers zich de afgelopen jaren, sinds het biologische belang van de indanonkern, geconcentreerd op het ontwikkelen van farmacologisch actieve indanonanalogen als therapeutische middelen. De structurele diversiteit van 1-indanonen impliceert een verscheidenheid aan biologische reacties en deze verbindingen kunnen worden toegepast in de landbouw en de geneeskunde. Er zijn verschillende op indanon gebaseerde verbindingen ontwikkeld als de ziekte van Alzheimer [16,57-59], tegen kanker [60-] 62], antimicrobiële [63,64] en antivirale middelen [65,66]. Vanwege het brede toepassingspotentieel waren 1-indanonen interessante objecten voor verder onderzoek en is het wenselijk om nieuwe klassen te ontwerpen voor hun synthese.
cistanche tubolosa: anti-aging
4. Conclusie
Om nieuwe krachtige tyrosinaseremmers te identificeren, hebben we dertien (E)-benzylideen-1-indanonderivaten ontworpen en gesynthetiseerd. Van deze verbindingen is (E)-2-(2,4-dihydroxy-benzylideen){ {6}},3-dihydro-1H-in-1-on (BID3) remde krachtig de tyrosinase-activiteit (IC50=0.034 en 1.39 mM, voor L-tyrosine en respectievelijk L-DOPA), die beter was dan de referentieverbinding, kojic acid (IC50=13, respectievelijk 0,77 mM en 33,14 mM). De structuur-activiteitsrelatie onthulde dat de aanwezigheid van de dihydroxylgroep op de 2 en 4-positie van het (E)-benzylideen-1-indanonskelet de activiteit tegen tyrosinase verbeterde. De wijze van enzymatische remming van het enzym, bepaald door Lineweaver-Burk- en Dixon-plots, gaf aan dat BID3 een remmer van het gemengde type is. Moleculaire docking-onderzoeken tonen aan dat binding op de actieve plaats en op allosterische plaatsen belangrijke mechanismen zijn voor de remmende activiteit van tyrosinase. Op basis van deze resultaten leek BID3 een krachtige tyrosinaseremmer te zijn voor de behandeling van huidaandoeningen zoals hyperpigmentatie.
voordelen van woestijncistanche: remt melaninevorming
