Echinacoside induceert apoptotische kankerceldood door remming van het nucleotidepool-ontsmettingsenzym MTH1

Deel één Hoe remt echinacoside celapoptose en verbetert het het geheugen?

Neem voor meer informatie contact op met: Ali.ma@wecistanche.com

Abstract:Remming van het nucleotide-pool-zuiverende enzym MTH1 veroorzaakt uitgebreide oxidatieve DNA-schade en apoptose in kankercellen en kan daarom worden gebruikt als een strategie tegen kanker. Omdat natuurlijke producten een rijke bron van medicinale chemicaliën zijn, hebben we in de huidige studie de door MTH1-gekatalyseerde enzymatische reactie gebruikt als een high-throughput in een vitro screeningstest om te zoeken naar natuurlijke verbindingen die MTH1 kunnen remmen.Echinacoside, een verbinding afgeleid van de geneeskrachtige planten Cistanche en Echinacea, remde effectief de katalytische activiteit van MTH1 in een in vitro test. Behandeling van verschillende menselijke kankercellijnen metEchinacosideresulteerde in een significante toename van het cellulaire niveau van geoxideerd guanine (8-oxoguanine), terwijl het niveau van cellulaire reactieve zuurstofsoorten onveranderd bleef, wat aangeeft datEchinacosideremde ook de activiteit van cellulair MTH1. Vervolgens,Echinacosidebehandeling veroorzaakte een onmiddellijke en dramatische toename van merkers voor DNA-schade en opregulatie van de G1/S-CDK-remmer p21, gevolgd door duidelijke apoptotische celdood en stopzetting van de celcyclus bij kanker, maar niet in niet-kankercellen. Alles bij elkaar genomen, identificeerden deze onderzoeken een natuurlijke verbinding als een MTH1-remmer en suggereren ze dat natuurlijke producten een belangrijke bron van middelen tegen kanker kunnen zijn.

trefwoorden:Echinacoside, MTH1, 8-oxoG, DNA-schade,apoptose, arrestatie van de celcyclus.

Click to Cistanche gebruikt voor geheugen

Invoering

De cellulaire en mitochondriale nucleosidetrifosfaat (NTP) en deoxynucleosidetrifosfaat (dNTP) pool is een belangrijk doelwit van verschillende reactieve zuurstofspecies (ROS).1-3 Omdat de specificiteit van DNA-polymerasen niet perfect is, kunnen 4,5 geoxideerde dNTP's opgenomen in nieuw gesynthetiseerd DNA om genetische afwijkingen te veroorzaken als ze niet worden opgelost.6 De belangrijkste geoxideerde base in de nucleotidepool, 8-oxoguanine (8-oxoG), kan bijvoorbeeld basenparen met cytosine en adenine. Wanneer het tijdens DNA-replicatie in tegenovergestelde adenine wordt ingebracht, kan het mogelijk T: A=G: C-transversie veroorzaken,7 wat een van de meest voorkomende mutaties is die wordt gevonden bij menselijke kankers.8,9 Hoewel de meeste geoxideerde vrije dNTP's worden verwijderd door nucleotidepool-reinigende enzymen, hebben studies in het verleden aangetoond dat de nucleotidepool nog steeds een belangrijke bron van geoxideerde basen in DNA-moleculen is en een belangrijke bijdrage levert aan oxidatieve DNA-schade.3,10 Zoogdiercellen zijn bewapend met geavanceerde verdedigingsmechanismen om ROS-geïnduceerde genomische laesies minimaliseren. Nucleotidepoolreinigende enzymen hydrolyseren geoxideerde dNTP's en NTP's, waardoor hun opname in DNA- en RNA-moleculen wordt voorkomen.11,12 MTH1, een lid van de Nudix-hydrolase-superfamilie (vandaar ook NUDT1 genoemd),13 is een trifosfatase dat verantwoordelijk is voor het verwijderen van geoxideerde purine-NTP's en dNTP's (8-oxodGTP, 2-OH-dATP, 8-OH-GTP en 2-OH-ATP) uit de nucleotidepools.14 Sinds 8-oxoguanine (8-oxoG) is de belangrijkste geoxideerde base in cellen, MTH1 is het belangrijkste enzym voor de zuivering van nucleotidepools.15 Niettemin, zelfs onder toezicht door de nucleotidepoolreinigende enzymen, is een aanzienlijk deel van de geoxideerde dNTP's opgenomen in DNA, en basen in DNA-moleculen kunnen ook direct door ROS worden geoxideerd.6 Cellen vertrouwen dan op meer uitgewerkte strategieën waarbij verschillende DNA-glycosylasen betrokken zijn, zoals OGG1 en MUTYH, en DNA-herstelprocessen, waaronder base-excisieherstel (BER) en mismatch reparatie (MMR), om problematische basen in DNA-moleculen te fixeren.10, 16,17 BER en MMR repareren normaal gesproken talloze geoxideerde basen in DNA per dag en spelen dus een belangrijke rol bij het beschermen van de integriteit en stabiliteit van het genoom.

In cellen die onder verhoogde oxidatieve stress staan, kan een verhoogde opname van geoxideerde nucleotiden in het DNA de cellulaire reparatiecapaciteit overweldigen en de DNA-schaderespons (DDR) veroorzaken.18 Aanhoudende DDR-signalering zal leiden tot stilstand van de celcyclus, vroegtijdige cellulaire veroudering of apoptose, dus het vormen van een barrière voor tumorigenese.19 Hoewel kankercellen een sterk verhoogde oxidatieve spanning vertonen en een potentieel dodelijke belasting van geoxideerde nucleotiden genereren,20 kunnen ze de DDR-geassocieerde veroudering of apoptose overleven.21 Een groot aantal onderzoeken heeft aangetoond dat MTH1 door het effectief verwijderen van de gevaarlijk overvloedige 8-oxodGTP en 2-OH-dATP in tumorcellen, speelt een sleutelrol bij de ontwikkeling van kanker.22 MTH1 bleek tot overexpressie te komen in verschillende soorten kanker,23– 25 en 8-oxoG-niveaus, en de mate van oxidatieve DNA-laesies was lager in tumoren dan in de omringende normale weefsels.26-28 Functioneel verminderde de overexpressie van MTH1 de gevoelloosheid aanzienlijk DNA-mutaties gezien in MMR-deficiënte muizenembryofibroblasten10 en stelden cellen in staat oncogene Ras-geïnduceerde voortijdige cellulaire senescentie en apoptose te overwinnen;29 terwijl de onderdrukking van MTH1 de ontwikkeling van kanker in OGG1-deficiënte muizen30 verhinderde en ROS bevorderde -geïnduceerde DDR en cellulaire veroudering in door Ras getransformeerde cellen.3,29,31 Hoewel MTH1 dus een beschermende rol speelt door ROS-geïnduceerde mutaties in gezonde cellen te voorkomen, vonden deze studies dat MTH1 vooral nodig is voor het ontstaan ​​en overleven van kanker cellen. Recente studies hebben meer bewijs geleverd om de rol van MTH1 bij de ontwikkeling van kanker te ondersteunen.31–34 Onderdrukking van MTH1 door RNAi of kleine molecule-remmers in verschillende kankercellijnen resulteerde in een duidelijk verhoogde opname van 8-oxodG in genomisch DNA, wat leidde tot tot uitgebreide DNA-schade, apoptotische celdood en verminderde overleving van kankercellen. 32,33 In muizenxenotransplantaatonderzoeken onderdrukte remming van MTH1 op efficiënte wijze de groei van kankerexplantaten. Belangrijk is dat het onderdrukken van MTH1 geen invloed had op de groei en overleving van normale cellen, waarschijnlijk omdat normale cellen een lagere ROS hebben en daarom minder afhankelijk zijn van MTH1 om te overleven.32,33 Deze bevindingen suggereren dat remming van MTH1 een veelbelovende nieuwe strategie is om kanker te bestrijden. .

Natuurlijke producten zijn een rijke bron van geneeskrachtige stoffen.35 Veel moderne therapieën, waaronder geneesmiddelen tegen kanker, zijn afgeleid van kruiden- of botanische preparaten.36–39 Toch stelde een groot aantal traditionele kruiden voor om verschillende therapeutische eigenschappen te bezitten om te blijven bestaan. moeten worden gekarakteriseerd, grotendeels vanwege problemen bij het controleren van hun samenstellingen om hun werkzaamheid en werkingsmechanismen ondubbelzinnig te definiëren.40 Er zijn nieuwe benaderingen nodig die de detectie van actieve verbindingen en analyse van moleculaire mechanismen mogelijk maken. In dit opzicht kan doelgerichte high-throughput in vitro screening een hulpmiddel zijn bij het vinden van mechanistisch gedefinieerde medicinale verbindingen uit natuurlijke hulpbronnen. In de huidige studie hebben we de MTH1-gekatalyseerde enzymatische reactie gebruikt als een high-throughput in vitro-assay om te zoeken naar natuurlijke verbindingen die MTH1 kunnen remmen. Verrassend genoeg onthulde de screening dat:Echinacoside, een natuurlijk product dat vooral bekend staat om zijn krachtige antioxidatieve activiteit, is in staat om MTH1 te remmen.

materialen en methodes

Materialen

Natuurlijke kruidenverbindingen werden gekocht bij Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Volksrepubliek China. De naam, het catalogusnummer, het registratienummer van de Chemical Abstracts Service (CAS) en de zuiverheid van elke verbinding staan ​​vermeld in tabel S1. Voorraadoplossingen van de verbindingen werden bereid in 100 procent dimethylsulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en werkoplossingen werden bereid in testbuffer of compleet celkweekmedium. Dezelfde oplossing zonder de testverbinding maar met dezelfde hoeveelheid DMSO werd gebruikt als dragercontrole. (S)-crizotinib werd gekocht bij Selleck Chemicals, Houston, TX, VS.

In-vitroscreening

De in vitro enzymatische test die werd gebruikt om natuurlijke kruidenverbindingen te screenen, volgde de procedures beschreven door Gad et al. acetaat (pH 8,0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg-acetaat, 0,005 procent Tween 20 en 1 mM DTT. Vervolgens werden 0,5 nM recombinant humaan MTH1 (Abcam, Cambridge, VK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) en 0,2 U / ml anorganische pyrofosfatasen (Thermo Fisher Scientific) toegevoegd en werden de platen geïncubeerd op een bordenschudder gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Het uiteindelijke reactievolume was 100 L op een 96-well-plaat. Aan het einde van de reactie werd malachietgroen (J&K Scientific, Peking, Volksrepubliek China) toegevoegd41, en de platen werden nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Absorptie bij 630 nm werd gemeten met een BioRad 680 microplaatlezer (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, VS). De waarden van de remmende concentratie (IC50) werden bepaald door niet-lineaire regressieanalyse met behulp van de GraphPad Prism-software.

Cel cultuur

Humaan MG-63 osteosarcoom, SK-HEP-1 hepatocarcinoom, MCF7 borstkanker, SW480 colorectale kanker, HEK293 embryonale nier en muis NIH/3T3 fibroblastcellijnen waren afkomstig van American Type Culture Collection, en de humane normale levercellijn L-O2 werd gekocht bij KenGen Biotech, Nanjing, Volksrepubliek China. Deze cellen werden op 37 graden gehouden in een bevochtigde atmosfeer met 5 procent CO2, volgens de instructies van de leveranciers. Er was geen ethische verklaring vereist van de institutionele beoordelingsraad voor het gebruik van deze cellijnen.

Meting van intracellulaire 8-oxoG

Intracellulaire {{0}}oxoG-niveaus werden gemeten door kleuring met Cy3-geconjugeerd avidine.42 Een totaal van 1 × 104 cellen werden gezaaid op een rond dekglaasje in 12-putjesplaten. De volgende dag werden de cellen behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M of 80 MEchinacosidegedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur en werden vervolgens gefixeerd met ijskoude methanol gedurende 20 minuten, gevolgd door incubatie in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1 procent Triton X -100 (Sigma-Aldrich) gedurende 15 minuten. De monsters werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd in TBS met 0,1 procent Triton X-100 en 15 procent foetaal runderserum en vervolgens gekleurd met Cy3-geconjugeerd avidine (0,5 ug/ ml) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, VS) in blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij 37 graden. Na 3 keer wassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten, werden de dekglaasjes verzegeld op glasplaatjes in VECTASHIELD Mounting Medium met 4′,6-diamidino-2-fenylindole (Vector Laboratories, Burlingame, CA , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). Beelden werden genomen en geanalyseerd door een Zeiss LCM 510 confocale microscoop.

Meting van intracellulaire ROS

Intracellulaire ROS-niveaus werden gemeten door flowcytometrie met behulp van een celgebaseerde ROS-assaykit (Beyotime Biotechnology, Haimen, Volksrepubliek China). Cellen gekweekt in platen met zes putjes werden behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M of 80 MEchinacosidegedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur, tweemaal gewassen met PBS en 30 minuten bij 37°C geïncubeerd met 10 uM dichloorfluoresceïnediacetaat. De cellen werden vervolgens getrypsiniseerd en geanalyseerd door de FACCaliber-flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, VS). Intracel-cellulaire ROS-niveaus werden uitgedrukt als de gemiddelde dichloordi-hydrofluoresceïnefluorescentie-intensiteit van de cellen. De getoonde getallen waren gemiddelden van drie onafhankelijke experimenten.

Immunofluorescentiekleuring

Cellen gekweekt op dekglaasjes werden behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M of 80 MEchinacosidegedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur en daarna eenmaal gewassen met PBS, gefixeerd met 4 procent paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten, en geblokkeerd in TBS met 0,1 procent Triton X-100 en 15 procent foetaal runderserum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gefixeerde cellen werden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur gekleurd met een primair antilichaam tegen 8-oxoG (muis monoklonaal anti-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (konijn anti-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, VS), of actieve caspase-3 (konijn anti-caspase-3, Bioss, Beijing, Volksrepubliek China), gevolgd door kleuring met een Alexa 488-geconjugeerde ezel-antimuis ( Abcam) of Cy3-geconjugeerd geit-anti-konijn (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, VS) secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na 3 keer wassen in PBS gedurende 5 minuten werden de dekglaasjes verzegeld op glasplaatjes in VECTASHIELD Mounting Medium met DAPI (Vector Laboratories). Beelden werden genomen door een Zeiss LCM 510 confocale microscoop.

Kolonievormingstest

De dag voor de behandeling werden de cellen uitgezaaid in een plaat met zes putjes in een concentratie van 1x104 cellen per putje. Vervolgens werden ze gedurende 7 dagen behandeld met 0 M, 60 M of 80 M echinacoside. Na wassen met PBS werden de cellen gefixeerd met ijskoude methanol en gekleurd met kristalvioletoplossing (Sigma Aldrich) (0,5 procent in 25 procent methanol). Beelden werden gefotografeerd na een nacht drogen van de platen. De kristalviolette kristallen werden opgelost door 70 procent ethanol toe te voegen en de absorptie bij 595 nm werd gemeten met een BioRad 680 microplaatlezer. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de GraphPad Prism-software.

MTT-test

Een dag voor de behandeling werden cellen uitgezaaid in 96-putjesplaten met een concentratie van 1 x 104 cellen per putje, gevolgd door behandeling met seriële verdunningen van Echinacoside gedurende 24 uur of 48 uur, of met 60 μM Echinacoside gedurende 5 uur , 12 uur of 24 uur. Het medium werd verwijderd en de cellen werden gewassen met PBS en vervolgens 20 L 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,

5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-oplossing (5 mg/ml in PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) werd aan elk putje toegevoegd. De platen werden nog 4 uur bij 37°C geïncubeerd. Uiteindelijk werd de MTT-oplossing verwijderd en werd 150 L DMSO aan elk putje toegevoegd. De platen werden gedurende 10 minuten op een platenschudder geïncubeerd en de absorptie bij 570 nm werd gemeten met een BioRad 680 microplaatlezer. Elk experiment werd tweemaal in drievoud uitgevoerd. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de GraphPad Prism-software. IC50-waarden werden bepaald met behulp van niet-lineaire regressieanalyse.

Celcyclusanalyse

Cellen in platen met zes putjes werden gedurende 24 uur behandeld met 0 μM, 6{{10}} M of 80 μM Echinacoside, geoogst met trypsine (Life Technologies, Carlsbad, CA, VS) , tweemaal gewassen met PBS en vervolgens gefixeerd met ijskoude ethanol (70 procent) gedurende 2 uur bij -20 graden. Vaste cellen werden tweemaal gewassen in koude PBS en opnieuw gesuspendeerd in 300 L vers bereide PBS met 0,1 procent Triton X-100, 0,2 mg/ml DNase-vrij RNase A (Sigma Aldrich), 10 ug/ml propidiumjodide (PI ) (Hoffman-La Roche Ltd., Bazel, Zwitserland). Na incubatie bij 37 graden in het donker gedurende 20 minuten werden de cellen gefilterd door een Falcon nylon gaas (BD Biosciences), geladen op de FAC-Calibur flowcytometer en geanalyseerd met behulp van de ModFit-software (BD Biosciences).

DNA-fragmentatie-analyse

Cellen gekweekt in platen met zes putjes werden behandeld met 0 M, 60 M of 80 μM Echinacoside gedurende 24 uur en gefixeerd in ijskoude 4 procent paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) gedurende 20 minuten. Na wassen met PBS werden de cellen afgesloten in VECTASHIELD Mounting Medium met DAPI (Vector Laboratories). Nucleaire morfologie werd gefotografeerd met een Olympus fluorescentiemicroscoop. Om DNA-fragmentatie op agarosegels te detecteren, werd DNA geëxtraheerd met behulp van de QIAamp DNA-microkit (Qiagen NV, Venlo, Nederland) en werd elektroforese uitgevoerd op 2 procent agarosegels die 0,1 ug/ml ethidiumbromide bevatten.

Analyse van apoptose door flowcytometrie

Apoptotische cellen werden onderzocht met behulp van een Annexin V-FITC Apoptosis-detectiekit (Best, Shanghai, Volksrepubliek China), volgens de instructies van de fabrikant. Cellen gekweekt in 96-putjesplaten werden gedurende 2 uur, 5 uur, 12 uur of 24 uur behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M, 80 M of 160 M echinacoside, tweemaal gewassen met PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in een bindingsbuffer. Vervolgens werden achtereenvolgens 5 L Annexin V-FITC en 5 μL PI (Roche) toegevoegd en werden de cellen gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. De cellen werden op de FACSCalibur-stroomcytometer (BD Biosciences) geladen en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Cell Quest-software (BD Biosciences).

Western-blot-analyse

Cellen gekweekt in platen met zes putjes werden 5 uur, 12 uur of 24 uur behandeld met 0 M, 6{{10}} μM of 80 μM echinacoside, tweemaal gewassen met PBS en van de plaat afgeschraapt met 100 μL radio-immunoprecipitatiebuffer (150 mM NaCl, 1,0 procent IGEPAL CA-630, 0,5 procent natriumdeoxycholaat, 0,1 procent natriumdodecylsulfaat en 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) met 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride. Monsters werden gecentrifugeerd bij 12,000x g gedurende 20 minuten bij 4 graden. Eiwitconcentraties in de supernatanten werden bepaald door het Bradford-reagens (Dingguo, Changchun, Volksrepubliek China). Monsters werden gedurende 10 minuten bij 95 graden gedenatureerd en gescheiden op 12 procent natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforesegel. Na elektroforese werden eiwitten overgebracht naar polyvinylideenfluoridemembranen (Millipore), gevolgd door blokkering in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 procent Tween 20) met 5 procent (w/v) magere melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Blots werden onderzocht met primaire antilichamen tegen p21 (Abcam), poly (ADP-ribose) polymerase (Bioss) of geactiveerd caspase -3 (Bioss), gevolgd door met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichamen (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Signalen werden ontwikkeld met behulp van de verbeterde chemiluminescentie Western blotting-detectiekit (Trans gen Biotech, Changchun, Volksrepubliek China). De experimenten werden drie keer herhaald.

Meting van mitochondriale

membraanpotentiaal

De mitochondriale membraanpotentiaal werd gemeten met behulp van de JC{{0}}-kleurstof (Biotechnology), volgens de instructies van de fabrikant. Cellen gekweekt in platen met zes putjes werden behandeld met 0 M, 60 M of 80 μM Echinacoside gedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur, tweemaal gewassen in PBS en vervolgens 20 minuten geïncubeerd met JC-1. Beelden werden genomen met behulp van een Olympus fluorescentiemicroscoop.

statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism Software. De significantie werd berekend met behulp van een eenzijdige variantieanalyse en P0.05 werd als statistisch significant beschouwd. Resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie.

Resultaten

Identificatie van echinacoside als een MTH1-remmer

Om te zoeken naar natuurlijke verbindingen die MTH1 kunnen remmen, gebruikten we de MTH1-gekatalyseerde enzymatische reactie als een hoge doorvoer in de Vitro-screeningtest. Naast geoxideerde purinenucleotiden kan MTH1 ook normaal deoxyguanosinetrifosfaat hydrolyseren om deoxyguanosinemonofosfaat en pyrofosfaat te genereren. In aanwezigheid van een overmaat aan anorganische pyrofosfatase worden alle pyrofosfaten omgezet in anorganische fosfaten, die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een op malachietgroen gebaseerde absorptietest,41 waardoor indirecte meting van de MTH1-activiteit mogelijk wordt.32 Om het testsysteem te testen, hebben we eerst de effect van (S)-crizotinib, een verbinding met bewezen potentie als MTH1-remmer.33 Het resultaat toonde aan dat (S)-crizotinib inderdaad krachtig MTH1 remde (Figuur 1A) met een IC50 van 500 nM, die zevenmaal hoger was dan de gerapporteerde door Huber et al (72 nM).33 Dit was waarschijnlijk te wijten aan de verschillen in de detectiemethoden of bronnen van chemicaliën en enzymen. We kozen voor een minder gevoelige chromogene benadering, terwijl Huber et al. een zeer gevoelige bioluminescente methode gebruikten.33 Met dit in gedachten hebben we 12 in de handel verkrijgbare natuurlijke verbindingen gescreend (Tabel S1), die elk een belangrijk ingrediënt zijn van traditionele kruiden met potentiële antitumormiddelen. werkzaamheid. Echinacoside, een verbinding die is gezuiverd uit de parasitaire medicinale plant Cistanche salsa (Figuur 1C), remde de reactie significant (Figuur 1B), met een IC50 van 7,01 ± 2,13 M (Figuur 1D). Het toevoegen van 50 keer meer pyrofosfatase had geen invloed op het resultaat, terwijl het toevoegen van vijf keer meer MTH1-eiwit de mate van remming significant verminderde, wat suggereert dat Echinacoside specifiek de activiteit van MTH1 remde in de in vitro enzymatische test.

Echinacoside remde cellulair MTH1 om intracellulair 8-oxoG . te verhogen

Vervolgens vroegen we of Echinacoside de intracellulaire MTH1-activiteit kan remmen. Remming van cellulair MTH1 zal de intracellulaire 8-oxoG verhogen. Van Avidine is aangetoond dat het bindt aan 8-oxoG met een hoge specificiteit;42 daarom gebruikten we immunofluorescentiekleuring met Cy3-geconjugeerd avidine om intracellulaire 8-oxoG-niveaus in verschillende kankercellijnen voor en na behandeling met Echinacoside. Humaan MG-63 osteosarcoom, SK-HEP-1 hepatocarcinoom, MCF{{10}} borstkanker en SW480 colorectale kankercellen werden behandeld met 0 M, 15 μM, 30 μM, 60 M of 80 M Echinacoside gedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur. Kleuring met Cy3-geconjugeerd avidine onthulde dat behandeling met 60 M echinacoside gedurende 24 uur duidelijk en significant het niveau van cellulaire 8-oxoG (Cy3-avidine-reactieve stof) in deze kankercellen verhoogde ( Figuur 2A en B). Hogere concentratie (80 M) Echinacoside resulteerde in sterkere cellulaire 8-oxoG-kleuring (Figuur 2B), wat een dosis-responsrelatie suggereert. Vergelijkbare resultaten werden verkregen door immunofluorescentiekleuring met een monoklonaal anti--8-oxoG-antilichaam van muizen (Figuur S1A).43 De concentratie van echinacoside (60 M) die nodig was voor een significante toename van cellulair 8-oxoG was veel hoger dan de IC50 (7,01 M) van de in vitro test. Dit was waarschijnlijk te wijten aan het verschil in gevoeligheid van de twee testen. Immunofluorescentiekleuring is veel minder gevoelig dan de in vitro enzymatische test; bovendien wordt het aantal remmermoleculen dat cellulair MTH1 kan bereiken en ermee kan interageren, beïnvloed door complexe biologische processen; bovendien wordt in de in vitro test de minder favoriete dGTP als substraat gebruikt, en daarom kan het gemakkelijker zijn (minder remmers nemen) om MTH1 te remmen, wat resulteert in een lagere IC50 in de in vitro test.

Cellulair {{0}}oxoG wordt gegenereerd door ROS, dat wordt tegengewerkt door antioxidanten. Een toename in cellulaire ROS of onderdrukking van de activiteit van antioxidanten zou dus ook resulteren in een toename van het cellulaire 8-oxoG-niveau. Echinacoside zelf is een krachtige antioxidant44,45 en zou dus de activiteit van antioxidanten moeten versterken in plaats van onderdrukken. Om te onderzoeken of het cellulaire ROS-niveau was veranderd door behandeling met Echinacoside, werden dezelfde kankercellen behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M of 80 μM Echinacoside gedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur en vervolgens geanalyseerd met flow cytometrie na kleuring met de fluorescerende sonde 2′,7′-dichloorfluoresceïne diacetaat. De resultaten toonden aan dat geen van deze behandelingen het cellulaire ROS-niveau veranderde (Figuur 2C en D). Het verhoogde cellulaire 8-oxoG-niveau is dus hoogstwaarschijnlijk het gevolg van de remming van MTH1 door Echinacoside.

Echinacoside veroorzaakte uitgebreide DNA-schade, specifiek in kankercellen. Opname van {{0}}oxoG in DNA zal BER en MMR stimuleren, die enkelstrengige DNA-breuken (SSB) en hiaten genereren.16,17 Normaal gesproken zijn deze breuken, en hiaten worden gedicht door reparatiemechanismen waarbij hiaten worden gevuld en ligatie door DNA-polymerasen en ligasen.46,47 Snelle toename van cellulaire SSB kan echter de cellulaire reparatiecapaciteit verzadigen, wat leidt tot de vorming van talrijke dubbelstrengs DNA-breuken (DSB)18 en DDR-signalering. Om te onderzoeken of de door Echinacoside geïnduceerde toename van cellulair 8-oxoG DNA-schade veroorzaakte, onderzochten we een van de vroege markers van DNA-schade, 53BP1, die bindt aan plaatsen van DSB als de vroegste cellulaire respons op DSB.48 De MG -63, SK-HEP-1, MCF-7 en SW480 kankercellijnen en de niet-kankercellijnen menselijke normale lever L-O2,49 menselijke embryonale nier HEK 293 en muisfibroblast NIH /3T3 werden gedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M of 80 M Echinacoside. Fluorescerende immunokleuring toonde aan dat behandeling met 60 M Echinacoside gedurende 24 uur specifiek het aantal cellen verhoogde met vijf of meer sterk gekleurde nucleaire 53BP1-foci in alle kankers, maar niet in een van de niet-kankercellijnen (Figuur 2E en F). Een significante toename van het aantal 53BP1 plus-cellen werd al 5 uur na het begin van de behandeling met Echinacoside waargenomen (Figuur 2F). Hogere concentratie (80 M) Echinacoside of langere behandelingstijd (12 uur en 24 uur) resulteerde in grotere toenames in zowel het aantal 53BP1 plus-cellen (Figuur 2F) als het aantal cellulaire 53BP1-foci. Samen suggereren deze resultaten dat de remming van MTH1 door Echinacoside 8-oxo-accumulatie en uitgebreide DNA-schade veroorzaakte in kanker, maar niet in niet-kankercellen.

Echinacoside onderdrukte proliferatie van kankercellen

In cyclische cellen zullen niet-herstelde DNA-strengbreuken een ineenstorting van de DNA-replicatievorken veroorzaken, wat vervolgens zal leiden tot blokkering van celproliferatie door inductie van celcyclusstop en apoptose.50 Om de effecten van Echinacoside op celgroei en -proliferatie te controleren, gaan we eerst analyseerde de groei van met Echinacoside behandelde MG-63-, SK-HEP-1-, MCF-7- en SW480-kankercellen door middel van een kolonievormingstest. De resultaten toonden aan dat de kankercellen die werden behandeld met 60 M of 80 μM Echinacoside veel minder kolonies vormden, en dat de gevormde kolonies veel kleiner waren (Figuur 3A en B), wat wijst op een sterk onderdrukt groeipotentieel. Vervolgens analyseerden we de proliferatie van deze kankercellen, samen met de L-O2, HEK 293 en NIH/3T3 niet-kankercellen door een MTT-assay. De resultaten toonden aan dat Echinacoside dosisafhankelijk de proliferatie van kanker remde, maar niet de niet-kankercellen (Figuur 3C). Tijdsverloopstudie van kankercellen behandeld met 60 M Echinacoside toonde aan dat er na 5 uur geen significant verschil was tussen niet-behandelings- en behandelingsgroepen, maar na 12 uur werd de proliferatie van kankercellen significant geremd door 60 μM Echinacoside (Figuur 3D).

Door echinacoside geïnduceerde stopzetting van de celcyclus

In overeenstemming met de waarnemingen over celgroei en proliferatie, toonde Western-blot-analyse aan dat een behandeling van 24 uur met 60 M en 80 μM Echinacoside het eiwitniveau van de G1/S-CDK-blokker en DNA-syntheseremmer p21Cip/ significant verhoogde. WAF1 in de MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 en SW480 kankercellen (Figuur 4A en B). Bovendien werd, vergelijkbaar met 53BP1, een significante toename van het p21-eiwitniveau al 5 uur na het begin van de behandeling met echinacoside waargenomen (Figuur 4B). Analyse van het aantal cellen in verschillende stadia van de celcyclus door middel van flowcytometrie onthulde dat behandeling met Echinacoside dosisafhankelijk het percentage cellen in zowel de S- als de G2/M-fase verminderde, terwijl het percentage cellen in de G1-fase toenam (Figuur 4C). en D). Na 80 μM Echinacoside-behandeling van MG-63-cellen gedurende 24 uur, namen de cellen in de G2/M-fase af van 15 procent tot bijna nul, en de cellen in de S-fase namen af ​​van 37 procent tot 17 procent, terwijl cellen in de G0/ 1-fase steeg van 43 procent naar 80 procent (Figuur 4E). Deze resultaten geven aan dat behandeling met Echinacoside de celcyclus tot stilstand bracht en de kankercellen in de G1-fase blokkeerde.

Door echinacoside geïnduceerde apoptose in kankercellen

Consistent met waarnemingen over celproliferatie, toonde Western-blot-analyse aan dat behandeling met 60 μM en 80 μM echinacoside gedurende 24 uur de niveaus van actief caspase-3 en gesplitst poly (ADP-ribose) polymerase-eiwitten in de kankercellen (Figuur 5A en B), wat duidt op inductie van caspase-afhankelijke apoptose. Vervolgens hebben we verschillende cellulaire markers van apoptose onderzocht. Ten eerste werd de nucleaire morfologie van met Echinacoside behandelde kankercellen onthuld door kleuring met de DNA-kleurstof DAPI, waaruit bleek dat 24 uur behandeling met 60 M en 80 μM Echinacoside het aantal kenmerken van apoptose verhoogde, waaronder pyknosis en gecondenseerd chromatine (helderdere kernen ) (Figuur 5C). Ten tweede werd het DNA geëxtraheerd uit op dezelfde manier behandelde kankercellen geanalyseerd door elektroforese op agarosegel, wat een typisch apoptotisch ladderpatroon onthulde (Figuur S1B). Ten slotte werd cellulair actief caspase -3 gedetecteerd door immunofluorescentiekleuring, die sterke geactiveerde caspase -3-signalen onthulde in met Echinacoside behandelde kankercellen (Figuur S1C). Vervolgens werd het percentage apoptotische cellen gemeten door Annexin V-FITC en PI dubbele kleuring en flowcytometrie. Analyse van cellen behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M, 80 M of 160 M Echinacoside gedurende 2 uur, 5 uur, 12 uur of 24 uur toonde aan dat 60 μM of hogere concentraties Echinacoside significante apoptose induceerden in de MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 en SW480 kankercellen (Figuur 6A), maar niet in de niet-kanker L-O2, HEK 293 en NIH/3T3 cellen (Figuur S2). Na behandeling van MG-63-cellen met 60 M, 80 M of 160 M echinacoside gedurende 24 uur, steeg het percentage apoptotische cellen van respectievelijk 8,89 procent tot 33,72 procent, 39,01 procent en 48,12 procent (Figuur 6A) . Het tijdsverlooponderzoek toonde aan dat er na 5 uur geen significant verschil was tussen niet-behandelde en behandelingsgroepen, maar significante apoptose werd waargenomen na behandeling met 60 M of hogere concentraties Echinacoside gedurende 12 uur (Figuur 6B en S3).

Ten slotte toonde meting van het mitochondriale membraanpotentieel door de JC-1 fluorescerende kleurstof duidelijk een prominent verlies van mitochondriaal membraanpotentieel na behandeling met 60 μM echinacoside gedurende 12 uur (Figuur 6C), maar niet na 5 uur, wat wijst op de activering van de intrinsieke apoptose-route na de DNA-schade veroorzaakt door verhoogde 8-oxodG.