Echinacoside bevordert de proliferatie van menselijke niertubulaire epitheelcellen door de HBX/TREM2-gemedieerde NF-κB-signaalroute te blokkeren

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

YuFan ZHanG, QinFanG Wu, liMin ZHonG, donGWei GonG

Abstract.

Hepatitis B virus X (HBX) eiwit is nodig voor de replicatie van HBV en speelt een rol bij de progressie van hepatitis bij mensen. De onderliggende functie van HBX tijdens door HBV geïnduceerde chronische glomerulonefritis (HBV-Gn) is echter onbekend. (echinacoside uit cistanche)(ecH) is een fenylethanoïde glycoside van het geslacht Cistanche, dat sterke anti-apoptose en neuroprotectieve activiteiten bezit. in de huidige studie werden de functie van HBX en de relatie tussen HBX en ecH in menselijke niertubulaire epitheelcellen (rTecs; HK-2 cellijn) onderzocht. reverse transcriptie-kwantitatieve Pcr- en western-blot-analyses werden gebruikt om respectievelijk de mRNA- en eiwitexpressieniveaus van HBX in HK-2-cellen te kwantificeren. De celtellingskit-8-assay werd uitgevoerd om celproliferatie te analyseren. Flowcytometrie-analyse werd gebruikt om de snelheid van apoptose te bepalen. HBX vertoonde antiproliferatieve en pro-apoptotische effecten in HK-2-cellen en was positief geassocieerd met het activeren van de receptor die tot expressie werd gebracht op myeloïde cel 2 (TreM2) expressie. Bovendien verstoorde ECH de functie van HBX in HK-2-cellen, functionerend als een HBX-onderdrukker. Bovendien werd een specifieke NF‑KB-remmer, PdTc, gebruikt om de relatie tussen HBX en nF-KB verder te onderzoeken. De resultaten suggereerden dat nF-KB betrokken was bij de HBX / TreM2-signaleringsroute en negatief gereguleerde TreM2-expressie in RTECS. De huidige studie verschafte nieuwe inzichten in de functie van HBX en gaf ook de potentiële waarde van ECH als therapeutisch middel voor HBV-Gn aan.

Invoering

Hepatitis B-virus (HBV) is een Hepadnaviridae-virus, dat bij mensen leidt tot acute en chronische hepatitis (1). HBV veroorzaakt niet alleen aanhoudende of voorbijgaande infectie in de lever, maar infecteert ook extrahepatisch weefsel, waaronder de pancreas, galwegen, lymfoïde systeem en nieren (2). Bovendien is HBV-infectie nauw geassocieerd met chronische glomerulonefritis (HBV-Gn); de moleculaire mechanismen van HBV tijdens HBV-Gn worden echter niet volledig begrepen (3,4).

HBV-regulerend hepatitis B-virus X (HBX)-eiwit is vereist voor HBV-replicatie (5,6). een aantal onderzoeken hebben gemeld dat HBX celproliferatie bevordert tijdens met HBV-infectie geassocieerd hepatocarcinoom (7-9). Menselijke niertubulaire epitheelcellen (rTecs) vormen een belangrijk onderdeel van het renale tubulaire interstitium en spelen een actieve rol bij nierontsteking (10). rTec-apoptose is nauw verbonden met de disfunctie van het tubulaire interstitium, wat vervolgens leidt tot de progressie van HBV-Gn (10). HBX komt voornamelijk tot expressie in rTec-cellen en veroorzaakt rTec-apoptose en nierbuislaesies bij patiënten met HBV-Gn (11,12). Verder is gemeld dat HBX de proliferatie van rTecs bij ratten (13) onderdrukt, en overexpressie van HBX versnelt de celcyclusprogressie van G1 naar S-fase in primaire rTecs, wat leidt tot stopzetting van de celcyclus in de S-fase (14). Daarom kan het identificeren van een HBX-remmer een nieuw therapeutisch middel voor HBV-Gn opleveren. Het precieze moleculaire netwerk van HBX in menselijke rTecs is echter niet volledig begrepen.(echinacoside uit cistanche)(ecH) is een natuurlijke verbinding die wordt gewonnen uitCistancheplanten, die anti-apoptotische en ontstekingsremmende effecten vertonen (15,16). Een eerdere studie meldde dat ecH de proliferatie induceert en de apoptose van darmepitheelcellen voorkomt (17). Bovendien is gemeld dat ecH de botregeneratie versnelt door de proliferatie van osteoblastcellen te verhogen (18). ecH kan ook HBV-replicatie, antigeenexpressie en ontsteking in darmepitheelcellen van ratten verminderen (16,19). Het biologische effect van ecH op rTecs is echter niet volledig opgehelderd.

Overexpressie van TreM2 bevorderde de proliferatie van glioomcellen (22). Daarentegen vermindert TreM2-knockdown de translocatie van nF-KB naar de kern in degeneratieve humane nucleus pulposus-cellen (23). Bovendien is TreM2 geïdentificeerd als een nieuw therapeutisch doelwit voor degeneratie van menselijke tussenwervelschijven (23). De biologische functie van TreM2 in humane rTecs is echter niet gerapporteerd. in de huidige studie werd HBX-overexpressie (oeHBX) geïnduceerd in humane rTecs (HK-2 cellijn) en vervolgens het effect van ecH(echinacoside uit cistanche) op getransfecteerde oeHBX-cellen werd onderzocht. Het doel van de huidige studie was om de functies van HBX en de potentiële waarde van ecH als een effectief therapeutisch middel voor HBV-Gn te onderzoeken.

Materialen en methoden

Cel cultuur.De menselijke rTec-cellijn HK-2 werd gekocht bij Shanghai Yaji Biotechnology co., ltd. HK-2-cellen werden gekweekt in DME/F12-media (cat.nr. SH30023.01B; Hyclone; cytiva) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum (cat.nr. 16000‑044; Gibco; Thermo Fisher Scientific, inc. .), 2 mM l-glutamine en 1 procent penicilline/streptomycine (cat.nr. P1400-100; Beijing Solarbio Science & Technology co., Ltd.) bij 37˚C met 5 procent CO2.

RNA isolatie en achteruit transcriptie-kwantitatief PCR (RT‑qPCR).Totaal rna werd geëxtraheerd uit HK-2-cellen met behulp van Trizol® (cat.nr. 1596 -026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, inc.), volgens het protocol van de fabrikant. Totaal RNA werd omgekeerd in cDNA getranscribeerd met behulp van de First-Strand cDNA-synthesekit volgens het protocol van de fabrikant (cat.nr. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). qPCR werd uitgevoerd met behulp van SYBr-Green premix volgens het protocol van de fabrikant (cat.nr. K0223; Thermo Fisher Scientific, Inc.) op een ABI-7300 realtime detector (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). De PCR-omstandigheden waren: 95 °C gedurende 10 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 seconden, 60 °C gedurende 45 seconden. Voor elke reactie waren drie herhalingen nodig. De volgende primerparen werden gebruikt voor de qPCR: HBX forward, 5'-GGcTGcTaGGTTGTacTG-3' en reverse, 5'-caGaGGTGaaGcGaaGTG -3'; TreM2 vooruit, 5'-TGGcacTcTcaccaTTacG-3' en achteruit, 5'-ccTccc aTcaTcTTccTTcac-3'; en GaPdH vooruit, 5'-AAT cccaTcaccaTcTTc-3' en omgekeerd, 5'-aGGcTGTTG TcaTacTTc-3'. mRNA-niveaus werden gekwantificeerd met behulp van de 2-ΔΔCq-methode en genormaliseerd naar het interne referentiegenGAPDH (24).

overexpressie en omver gooien.Om de overexpressie van HBX en TreM2 te induceren, werden de cDNA-sequenties van HBX of TreM2 van volledige lengte ingevoegd in de plVX-puro-vector (cleantech laboratoria, inc.) door dubbele digestie (Hindoeiii enEcoRI). Vervolgens werd het gerecombineerde plasmide (1,5 µg) getransfecteerd in HK-2-cellen (2x105). Het schijnplasmide (een lege vector, 1 µg) werd tijdelijk getransfecteerd in HK-2-cellen (2x105) als een negatieve controle (oenc) met lipofectamine® 2000 (cat.nr. 11668-027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, inc.). ecH(echinacoside uit cistanche)(cat.nr. 82854-37-3; Biopurify Phytochemicals, ltd.) werd opgelost in DMSO (cat.nr. d2650; Sigma-Aldrich; Merck KGaa) in een concentratie van 1, 2,5, 5, 10, 20 en

respectievelijk 50 mg/l; en toegevoegd aan de kweek van getransfecteerde oeHBX- of oeTreM2-cellen. De daaropvolgende experimenten begonnen 48 uur later.

Om TreM2-expressie te elimineren, werden drie kleine interfererende (si)RNA's (siTreM2-1, siTreM2-2 en siTreM2-3; 20 µM) die gericht zijn op TreM2 gesynthetiseerd (Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology co ltd.) en vervolgens getransfecteerd in HK-2-cellen (2x105) met behulp van lipofectamine® 2000 volgens het protocol van de fabrikant (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Een niet-specifieke gecodeerde siRNA-sequentie (5'uucuccGaacGuGucacGu3, 25 nM) si-negatieve controle (nc) werd gebruikt als de negatieve controle. De gerichte locus en sequenties van de TreM2-sirna's worden gegeven in tabel Si. De daaropvolgende experimenten werden 48 uur later uitgevoerd.

Westers blotten.Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit HK-2-cellen

gebruikmakend van RIPA-lysisbuffer (cat. nr. BYl40825; Jrdun Biotech Co., Ltd.). Het totale eiwit werd gekwantificeerd met behulp van de bicinchoninezuur-assaykit (cat.nr. PICPI23223; Thermo Fisher Scientific, inc.) volgens het protocol van de fabrikant en 20 µg eiwit/laan werd gescheiden via SDS-PaGe op een gel van 15%. De densitometrie van monsters werd bepaald met behulp van een microplaatlezer (dnM-9602, Pulangxin). Vervolgens werden de gescheiden eiwitten overgebracht op een PVDF-membraan. Na blokkering met 5 procent magere melkpoeder gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, werd het membraan een nacht bij 4 C geïncubeerd met primaire antilichamen (Tabel SII) en opnieuw geïncubeerd met het secundaire antilichaam anti-muis igG (1:1, 000, cat.nr. a0216, Beyotime Institute of Biotechnology) gedurende 1 uur bij 37˚C. De immunoreactieve eiwitbanden werden zichtbaar gemaakt met behulp van een ecl-systeem (cytiva). Blots werden in drievoud uitgevoerd.GAPDHen H3 werden gebruikt als de laadcontroles voor respectievelijk cytoplasmatische en nucleaire eiwitten.

Resultaten

ECH (echinacoside uit cistanche)onderdrukt de functie van HBX in HK-2 cellen.Beoordelen

de functie van HBX, HBX-overexpressie werd geïnduceerd in HK-2-cellen. De relatieve mrna- en eiwitniveaus van HBX waren significant opgereguleerd in oeHBX-cellen in vergelijking met oenc-cellen (Fig. 1a en B). Vervolgens werden oeHBX-cellen gekweekt met verschillende concentraties ecH (respectievelijk 1, 2,5, 5, 10, 20 en 50 mg/l; e1, e2.5, e5, e10, e20 en e50). HBX-overexpressie verminderde de proliferatie van HK -2-cellen aanzienlijk en deze afname werd op een dosisafhankelijke manier door ecH na 24 en 48 uur ongedaan gemaakt (figuur 1c).

Bovendien vertoonde de proliferatiesnelheid van oeHBX-cellen geen significant verschil in vergelijking met met E1-behandelde cellen (figuur 1c). Daarentegen verhoogde de e10-behandeling de proliferatiesnelheid van oeHBX-cellen aanzienlijk in vergelijking met de E20- en E50-behandeling die geen significant verschil vertoonde (figuur 1c). Daarom werd het effect van ecH op apoptose onderzocht in met e2.5, e5 en e10-behandelde cellen. HBX-overexpressie verhoogde de apoptose van HK-2-cellen significant en de apoptosesnelheid van oeHBX-cellen nam op een dosisafhankelijke manier af met ecH-behandeling (figuur 1d). over het algemeen suggereerden de resultaten dat ecH de functie van HBX in HK-2-cellen op een dosisafhankelijke manier remde.

TREM2 uitdrukking is geremd door ECH(echinacoside uit cistanche) in getransfecteerd oeHBX

cellen.rT-qPcr en western blotting werden gebruikt om respectievelijk de relatieve mrna- en eiwitexpressieniveaus van TreM2 in oeHBX-cellen te onderzoeken. TreM2 mrna- en eiwitexpressieniveaus waren significant opgereguleerd in oeHBX-cellen in vergelijking met oenc-cellen (Fig. 2a en B). ecH verlaagde echter de expressieniveaus van TreM2 in getransfecteerde oeHBX-cellen op een dosisafhankelijke manier (Fig. 2a en B). Daarom suggereerden de resultaten dat HBX-expressie positief geassocieerd was met TreM2-expressie, en wezen ze verder op het onderdrukkende effect van ecH op HBX in HK-2-cellen.

Omver gooien en overexpressie van TREM2 in HK-2 cellen.Om de functie van TreM2 verder te beoordelen, werden TreM2-knockdown en overexpressie geïnduceerd in HK-2-cellen met behulp van respectievelijk RNA-interferentie en een lentivirale vector. Voor de knock-down-assay zijn drie siRNA's gericht op het menselijke genTREM2(siTreM2-1, siTreM2-2 en siTreM2-3) werden getransfecteerd in HK-2-cellen en een niet-specifiek siRNA werd gebruikt als een negatieve controle (sinc). alle drie TreM2-sirna's hebben met succes de endogene expressie van TreM2 in HK -2-cellen uitgeschakeld (Fig. 3a en B). De laagste relatieve TreM2 mrna- en eiwitexpressieniveaus werden echter waargenomen in siTreM2-1 en siTreM2-2-getransfecteerde cellen (Fig. 3a en B), daarom siTreM2-1 en siTreM{{13 }}getransfecteerde cellen werden gekozen voor daaropvolgende experimenten. Voor de overexpressie-experimenten werd een plasmide met de volledige menselijke TreM2cdna-sequentie geconstrueerd en vervolgens getransfecteerd in HK-2-cellen (oeTreM2). a

schijnplasmide diende als een negatieve controle (oenc). Het niveau van TREM2-expressie was significant verhoogd in oeTREM2-cellen in vergelijking met oenc-cellen (Fig. 3c en d). Daarom werden oeTreM2-cellen gebruikt voor daaropvolgende experimenten.

TREM2 tot zwijgen brengen neemt af de apoptose van oeHBX cellen.Het apoptoseprofiel van oeHBX-cellen getransfecteerd met siTREM2 of sinc werd beoordeeld. De apoptosesnelheid van oeHBX plus sinc-cellen was significant hoger in vergelijking met open cellen. De apoptosesnelheid was echter significant verlaagd in oeHBX plus siTreM2-1- of siTreM2-2-cellen vergeleken met oeHBX plus sinc-cellen (Fig. 4a). De resultaten suggereerden dat TreM2 knockdown de functie van HBX remde tijdens HK-2 celapoptose.

Survivin behoort tot de remmer van een apoptose-eiwitfamilie, die apoptotische activiteit remt en celdood onderdrukt (25). Targeting Survivin is geïdentificeerd als een nieuwe benadering voor de behandeling van niercelcarcinoom (26). nF-KB is ook een apoptose-remmer die een rol speelt bij anti-apoptotische tumorprocessen (27). Bovendien is caspase3-activering nauw geassocieerd met apoptose (28). in de huidige studie werd het eiwitgehalte van TreM2, Survivin en gesplitst caspase3 in HK-2-cellen gekwantificeerd. Het niveau van TREM2-expressie was significant verlaagd in oeHBX plus siTreM 2-1/2-cellen vergeleken met oeHBX plus sinc-cellen (Fig. 4B). Het niveau van Survivin-expressie was significant verhoogd in oeHBX plus siTreM2-1/2-cellen in vergelijking met oeHBX-cellen. bovendien was het niveau van gesplitste caspase3-expressie significant verlaagd in oeHBX plus siTreM 2-1/2-cellen vergeleken met oeHBX plus sinc-cellen (Fig. 4B). Bovendien verminderde oeHBX de translocatie van NF-KB naar de kern aanzienlijk, en siTREM2-1/2-transfectie verhoogde de nucleaire translocatie van nF-KB significant (figuur 4B). Alles bij elkaar genomen suggereerden de resultaten dat TreM2 een stroomafwaartse factor van HBX in HK-2-cellen was, daarom zou HBX apoptose kunnen bevorderen door TreM2-expressie in menselijke rTecs te reguleren.

TREM2 overexpressie onderdrukt de translocatie vanNF‑κB tot de kern in HK-2 cellen.Het effect van ecH(echinacoside uit cistanche)op oeTreM2-getransfecteerde cellen werd geanalyseerd. Overexpressie van TreM2 bevorderde de apoptose van HK-2-cellen (Fig. 5a). De apoptose van oeTREM2-cellen was significant verminderd door ECH-behandeling (E10; Fig. 5A). Bovendien verminderde ECH de expressie van TreM2 in oeTreM2-cellen significant. Overexpressie van TREM2 verlaagde de expressieniveaus van Survivin significant, maar deze afname in expressie werd teruggedraaid door ecH. bovendien waren de eiwitexpressieniveaus van gesplitst caspase3 significant verhoogd in oeTreM2-cellen in vergelijking met oenc-cellen; een effect dat significant werd verminderd door ECH-behandeling. Verder bevorderde ecH de translocatie van nF-KB naar de kern in oeTreM2-cellen (Fig. 5B). Alles bij elkaar genomen gaven de resultaten aan dat ecH ook de functie van TreM2 in menselijke rTec-cellen onderdrukte.

HBX-functies zijn onderdrukt door de NF‑κB remmer PDTCin menselijk RTEC's.Om de relatie tussen

HBX- en nF-KB-, HK-2-cellen werden gekweekt met een specifieke nF-KB-remmer, PdTc (10 µmol/l; P10). De celapoptosesnelheid van oeHBX-cellen was significant verhoogd in vergelijking met oenc-cellen (Fig. 6a). oeHBX plus PdTc-cellen vertoonden echter een significant verhoogde apoptosesnelheid in vergelijking met oeHBX-cellen. Verder zijn de relatieve mRNA- en eiwitexpressieniveaus van TreM2 afgenomen in oeHBX plus PdTc-cellen in vergelijking met oeHBX-cellen (Fig. 6B). Daarom zijn de resultaten

suggereerde dat nF-KB de TreM2-expressie in met oeHBX getransfecteerde cellen negatief reguleerde.

NF‑κB remmer PDTC onderdrukt TREM2 promotor werkzaamheid in oeHBX cellen.een luciferasereporter (pGl3-enhancer-luc2) die de wildtype promotorsequentie van TreM2 (pGl3-enhancer-luc2-pTreM2) bevat, werd geconstrueerd en vervolgens getransfecteerd in oenc, oeHBX en oeHBX plus P10 gekweekte cellen.

De luciferase-activiteit van de reportervector die de wildtype TREM2-promotor bevat, was significant verhoogd in oeHBX-cellen in vergelijking met oenc-cellen. PdTc onderdrukte echter significant de luciferase-activiteit van de reporter in oeHBX-cellen (Fig. 7). over het algemeen gaven de resultaten aan dat PdTc de transcriptie van TreM2 remde door de promotoractiviteit van TreM2 in oeHBX-cellen te onderdrukken.

Discussie

HBX komt voornamelijk tot expressie in rTecs van patiënten met HBV-Gn en fungeert als determinant van virale pathogenese (11,29). Daarom is het vergroten van de kennis van de functie van het HBX-molecuulnetwerk een cruciale stap in het ontwikkelen van een nieuwe benadering voor de behandeling van HBV-Gn. Het doel van de huidige studie was om de functie van HBX verder te onderzoeken en om het potentiële moleculaire netwerk in menselijke rTecs te verkennen.

HBX remt de proliferatie van rTecs (11). in de huidige studie werden antiproliferatie- en pro-apoptosefuncties van HBX in menselijke RTEC's geïdentificeerd, wat suggereert dat HBX de ontwikkeling van menselijke rTecs onderdrukte. Een eerdere studie gaf aan dat ecH(echinacoside uit cistanche)remt HBV-replicatie en antigeenexpressie (19). in de huidige studie, ecH(echinacoside uit cistanche)behandeling verstoorde de functie van HBX in HK-2-cellen, daarom kan HBX worden beïnvloed door ecH in HK-2-cellen.

Moleculaire geneeskunde rapporten 22: 1137-1144, 2020 1143

Bovendien suggereerden de resultaten dat ecH(echinacoside uit cistanche)kan dienen als een potentieel therapeutisch middel voor HBV-Gn.

TreM2 is een aangeboren immuunreceptor die een rol speelt bij de ontstekingsreactie (30). In de huidige studie was HBX-expressie positief geassocieerd met TreM2-expressie in menselijke RTECS. Bovendien verminderde TREM2-knockdown de apoptosesnelheid van oeHBX-cellen aanzienlijk, en ecH(echinacoside uit cistanche)behandeling verminderde het effect van oeTreM2 op celapoptose. Alles bij elkaar genomen suggereerden deze resultaten dat TreM2 het doelwit was van HBX in HK-2-cellen. Daarom, ecH(echinacoside uit cistanche)kan de apoptose van menselijke rTecs remmen door de activiteit van de HBX/TreM2-signaleringsroute te blokkeren.

Een eerder rapport toonde aan dat nF-KB niet alleen een rol speelt bij celapoptose, maar ook betrokken is bij de regulatie van immuunresponsen en ontstekingen (31). Bovendien wordt TreM2 gemedieerd door het nF-KB-gevoelige microRNA-34a tijdens de ziekte van Alzheimer en maculaire degeneratie (32,33). in de huidige studie was de apoptotische snelheid van oeHBX-cellen significant verhoogd in aanwezigheid van PdTc. Voor zover wij weten, suggereerde de huidige studie voor de eerste keer dat de NF-KB-remmer PdTc de promotoractiviteit van TreM2 onderdrukte. Bovendien suggereerden de resultaten dat TreM2 de translocatie van nF-KB naar de kern in HK-2-cellen negatief reguleerde, maar positief geassocieerd was met gesplitste caspase3-expressieniveaus. TreM2 speelde een tegengestelde rol in HK-2-cellen ten opzichte van zijn rol in humane degeneratieve nucleus pulposus- en glioomcellen (22,23). Daarom suggereerde de huidige studie dat TreM2 verschillende functies zou kunnen hebben in verschillende soorten menselijke cellen.

Alles bij elkaar genomen, gaf de huidige studie niet alleen aan dat nF-KB een nieuwe component was van de HBX/TreM2-signaleringsroute, maar suggereerde ook dat nF-KB de TreM2-expressie in menselijke rTecs negatief reguleert. De belangrijkste beperkingen van de huidige studie waren echter het ontbreken vanin levendexperimenten en klinische gegevens. Daarom, verderin levenden klinische studies zijn nodig om de bevindingen van de huidige studie te bevestigen.

in de huidige studie, de functie van ecH(echinacoside uit cistanche)werd onderzocht en de resultaten suggereerden de mogelijke effecten van ecH(echinacoside uit cistanche)op de signaalroutes in menselijke rTecs. Bovendien verbeterde de huidige studie de bestaande kennis van de biologische functie van ecH in menselijke rTec-cellen en suggereerde ook het potentieel ervan als een nieuw therapeutisch middel voor HBV-Gn.

Referenties

1. Karayiannis P: Hepatitis B-virus: virologie, moleculaire biologie, levenscyclus en intrahepatische verspreiding. Hepatologie internationaal 11: 1-9, 2017.

2. Seeger c en Mason WS: Biologie van het hepatitis B-virus. Microbiol Mol Biol rev 64: 51-68, 2000.

3. Usama e, ana Maria S, W ray K en Fervenza Fc: behandeling van met hepatitis B-virus geassocieerde nefropathie. nephron clin Praktijk 119: c41-c49, 2011.

4. Zhang Y, li J, Peng W, Yu G, Wang l, chen J en Zheng F: HBV-geassocieerde postinfectieuze acute glomerulonefritis: een rapport van 10 gevallen. PloS een 11: e0160626, 2016.

5. Slagle Bl en Bouchard MJ: Hepatitis B Virus X en regulatie van virale genexpressie. koude Lente Harb Perspect Med 6: a021402, 2016.

6. Guerrieri F, Belloni l, d'andrea d, Pediconi n, le Peral, Testoni B, Scisciani c, Floriot o, Zoulim F, Tramontano a,et al: Genoombrede identificatie van directe HBx-genomische doelen. BMc genomics 18: 184, 2017.

7. Shi T, Hua Q, Ma Z en lv Q: downregulatie van mir-200a-3p geïnduceerd door hepatitis B-virus X (HBx)-eiwit bevordert celproliferatie en invasie in HBV-infectie-geassocieerde hepato-carcinoom. Pathol res Pract 213: 1464-1469, 2017.

8. Tian Y, Xiao X, Gong X, Peng F, Xu Y, Jiang Y en Gong G: HBx bevordert celproliferatie door de overspraak tussen mir-181a en PTen te verstoren. Wetenschappelijke rep 7: 40089, 2017.

9. Idris Me, Hachem H, Koering c, Merle P, Thénoz M, Montreux F en Wattel e: HBx veroorzaakt ofwel cellulaire senescentie of celproliferatie, afhankelijk van het cellulaire fenotype. J Virale Hepat 23: 130-138, 2016.

10. Wang X, Wang l, Zhu n, Zhou Y, Gu lJ en Yuan WJ: Hepatitis B-virus X-eiwit moduleert door niertubulaire epitheelcellen geïnduceerde T-cel- en macrofaagreacties. Immunolcel Biol 94: 266-273, 2016.

11. He P, Zhang d, li H, Yang X, li d, Zhai Y, Mal en Feng G: Hepatitis B-virus X-eiwit moduleert apoptose in menselijke renale proximale tubulaire epitheelcellen door de JaK2 / STaT3-signaleringsroute te activeren. int J Mol Med 31: 1017-1029, 2013.

12. Yang Y, Wang X, Zhang Y en Yuan W: Hepatitis B-virus X-eiwit en pro-inflammatoire cytokinen werken samen om Trail-geïnduceerde apoptose van niertubulaire cellen te verbeteren door opregulatie van dr4. int J Biochem cel Biol 97: 62-72, 2018.

13. He P, Zhou G, Qu d, Zhang B, Wang Y en li d: HBx remt proliferatie en induceert apoptose via Fas / Fasl-upregulatie in niertubulaire epitheelcellen van ratten. J nephrol 26: 1033, 2013.

14. Han W, luo M, He M, Zhu Y, Zhong Y, ding H, Hu G, liul, chen Q en lu Y: HBx-gentransfectie beïnvloedt de cyclus van primaire niertubulaire epitheelcellen door cycline-expressie te reguleren. Mol Med rep 18: 1947-1954, 2018.