DEEL Ⅰ: Effect van cistanche tubulosa-extracten op de mannelijke voortplantingsfunctie bij door streptozotocine-nicotinamide geïnduceerde diabetische ratten
Mar 04, 2022
Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He en Shu-Chun Cheng
Abstract:Diabetes is een chronische aandoening die wordt gekenmerkt door hyperglykemie als gevolg van verminderde insulinespiegels of de inefficiëntie van het weefsel om het effectief te gebruiken. Onvruchtbaarheid staat bekend als een belangrijke uitkomst van diabetes en beïnvloedt het mannelijke voortplantingssysteem door spermastoornissen en gonadale disfunctie te veroorzaken.Cistanche tubulosais een parasitaire plant die het vermogen heeft om het geheugen, de immuniteit en het seksuele vermogen te verbeteren, impotentie te verminderen en constipatie te minimaliseren. Deze studie was gericht op het onderzoek naar de ontstekingsremmende en beschermende effecten van echinacoside (ECH) bijCistanche tubulosa-extract(CTE) op het mannelijke voortplantingssysteem van diabetische ratten. De antioxiderende, ontstekingsremmende en beschermende effecten van CTE werden geëvalueerd met zowel in vitro als in vivo methoden. De in vitro resultaten laten zien dat de ECH de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) remde en de expressie van StAR-, CYP11A1-, CYP17A1- en HSD17p3-eiwitten verbeterde. De in vivo analyse werd uitgevoerd met drie doses echinacoside (ECH) (80, 160 en 320 mg/kg) in CTE. In totaal werd 0,571 mg/kg rosiglitazon (RSG) toegediend als positieve controle. Diabetes werd veroorzaakt door streptozotocine (STZ) (65 mg/kg) en nicotinamide (230 mg/kg) in combinatie met een vetrijk dieet (45 procent). De in vivo onderzoeken bevestigden dat de ECH de bloedsuikerspiegel, insulineresistentie, leptineresistentie en lipideperoxidatie verbeterde. Het kan de expressie van kisspeptine 1 (KiSS1), G-eiwit-gekoppelde receptor GPR 54, suppressor van cytokinesignalering 3 (SOCS-3), en sirtuin 1 (SIRT1) boodschapper-ribonucleïnezuur (mRNA) -expressie in de hypothalamus herstellen en seks herstellen hormoonspiegel. Deze studie bevestigde dus de antioxiderende, ontstekingsremmende en steroïdogenese-effecten van CTE.
trefwoorden:suikerziekte; onvruchtbaarheid;Cistanche tubulosa-extract (CTE); echinacoside (ECH); ontstekingsremmende activiteit; antioxidante werking; steroïdogenese effecten
Behandeling voor diabetes:Cistanche tubulosa-extract(CTE)
1. Inleiding
Diabetes mellitus (DM) is een aandoening waarbij er verhoogde glucosespiegels in het bloed zijn als gevolg van de inefficiëntie van de alvleesklier bij het produceren van voldoende insuline, of het onvermogen van het lichaam om het effectief te gebruiken. Volgens de WHO is het aantal mensen met diabetes gestegen van 108 miljoen in 1980 tot 422 miljoen in 2014 [1]. Er zijn vier hoofdcategorieën: pre-diabetes (een stadium voorafgaand aan diabetes), type 1 (waarbij de alvleesklier geen insuline aanmaakt), type 2 (het lichaam gebruikt geen insuline) en zwangerschapsdiabetes (die optreedt tijdens de zwangerschap). Oxidatieve stress treedt op als gevolg van de onbalans tussen de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en antioxidanten [2] die uiteindelijk leiden tot de diabetische aandoening. De complicaties van diabetes zijn nierfalen, zenuwbeschadiging, blindheid, beroerte, hartaanval, foetale dood en onvruchtbaarheid. [1]. Studies tonen aan dat spermakernen, deoxyribonucleïnezuur (DNA) en mitochondriën significant beschadigd waren bij mannelijke diabetespatiënten [3]. Oxidatieve stress tijdens het transport van sperma zal het proces van het mannelijke voortplantingssysteem veranderen [4,5].
Het proces van spermatogenese wordt gecontroleerd door de hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) as. Het gonadotropine-releasing hormoon (GnRH), geproduceerd door de hypothalamus, stimuleert de productie van luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH). Leydig-cellen worden gevonden naast de tubulus seminiferi en produceren testosteron onder controle van LH. FSH triggert de productie van antigeen-bindend eiwit (ABP) dat helpt om het mannelijke hormoon door te geven. Zo ontstaan onvruchtbaarheid en andere problemen vooral door de verstoringen die optreden in de HPG-as. Toediening van de combinatie van streptozotocine-nicotinamide induceert diabetes bij experimentele ratten. Streptozotocine is een chemische verbinding die giftig is voor insulineproducerende p-cellen in de pancreas en nicotinamide is een in water oplosbare vitamine die de p-cellen beschermt tegen volledige schade [6].
Cistanche tubulosa is een woestijnplantensoort die ook bekend staat als "Rou Cong-Rong" [7]. Het is een niet-chlorofylische parasitaire plant die voornamelijk groeit op de wortel van de Calotropis Procera-boom en wijdverbreid is in het droge land van Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolië, Iran en India. De algemene naam van Cistanche tubulosa is "Woestijnhyacint". Het wordt algemeen aanvaard in de Chinese traditionele geneeskunde en heeft de naam "Ginseng van de Woestijn" gekregen. Het wordt veel gebruikt op medicinaal gebied voor de behandeling van morbide leucorrhea, overvloedige metrorragie, chronische nierziekten, constipatie, impotentie en onvruchtbaarheid. Chemische bestanddelen vanCistanche tubulosabestaan uit niet-vluchtige fenylethanoïde glycosiden (PHG's), iridoïden, lignanen, vluchtige oliën, alditolen, oligosachariden en polysachariden [8]. Studies tonen aan dat echinacoside van dit kruid de beschadigde fibroblast beschermt door ROS-niveaus te reguleren [9]. Deze verbinding produceert antioxiderende, vasorelaxerende en ontstekingsremmende activiteiten samen met neuroprotectie en preventie van osteoporose [10,11].
Deze studie was gericht op het onderzoeken van deeffect van Cistanche tubulosa-extractmet ECH op de reproductieve disfunctie van de streptozotocine-nicotinamide-geïnduceerde diabetische rat.
Cistanche tubulosa
2. materialen en methoden
2.1.Materialen
ECH en CTE werden gekocht bij Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) werden gekocht bij Biovision (San Francisco, CA, VS). LC-540- en TM3-cellijnen werden gekocht bij het Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Vijf weken oude Sprague-Dawley (SD) mannelijke ratten werden gekocht bij het National Laboratory Animal Centre (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® werd gekocht bij PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) werd verkregen van Sigma (St. Louis, MO, VS). Methanol en 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) werden ook gekocht bij Sigma. Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium / F12 en trypsine-EDTA werden verkregen van GIBCO (New York, NY, VS). 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), dichloor-dihydro-fluoresceïnediacetaat (DCFH-DA), dimethylsulfoxide (DMSO) en nitroblauwtetrazolium (NBT) werden gekocht bij Sigma. Glucose-enzymatische kits werden verkregen van Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japan. Insuline ELISA-kits werden gekocht bij Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Zweden). T-PER weefselproteïne-extractiereagens werd verkregen van Thermo Scientific (Chicago, IL, VS). Anti-mens / muis / rat nucleaire factor-kappa B NF-kB polyklonale antilichamen werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, VS. Anti-muis/rat-receptor voor geavanceerde glycatie-eindproducten (RAGE) polyklonale antilichamen, anti-mens/muis/rat StAR polyklonale antilichamen en anti-mens/muis/rat cytochroom P450 17A1 monoklonale antilichamen werden gekocht bij Gene Tex (Irvine, CA, VS). Anti-mens / muis / rat CYP11A1-polyklonale antilichamen werden verkregen van Cell Signaling Technology (Beverly, PA, VS). Het easy-Blue-reagens werd gekocht bij Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, VS). Agarose en DNA-marker 100 bp werden verkregen van Promega, Corporation (Madison, WI, VS). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit werd gekocht bij QIAGEN, Hilden, Duitsland.
2.2.Methoden
2.2.1. In vitro analyse
LC{{0}} en TM3-celkweek: De LC-540-cellijnen werden bij 37 OC gekweekt in Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)-medium aangevuld met natriumbicarbonaat (1,5 g/L), L -glutamine (2 mM), niet-essentiële aminozuren (0.1 mM), natriumpyruvaat (1.0 mM) en foetaal runderserum (FBS) (10 procent) in een 5 procent CO2-incubator (CO2-incubator, Napco 5410, Taiwan). De TM3-cellijn werd gekweekt in Dulbecco/s gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) aangevuld met glucose (4,5 g/L), natriumpyruvaat (0,5 mM), L-glutamine (2,5 mM), natriumbicarbonaat (1,2 g/L), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES, 15 mM), en foetaal kalfsserum (FCS, 10 procent) of paardenserum (5 procent) bij 37 OC in een 5 procent CO2-incubator.
Bepaling van de levensvatbaarheid van echinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) reagens werd gebruikt voor cellevensvatbaarheidstest. De celconcentratie werd ingesteld op 2 x 105 cellen/ml in een 96-well-plaat. Vervolgens werd 20 L ECH (verdund in 2 procent medium) toegevoegd en gedurende 24 uur bij 37 OC in een 5 procent CO2-incubator geïncubeerd. Later werd 100 L MTT-reagens toegevoegd en geïncubeerd voor 4hat37 OC onder donkere omstandigheden. De absorptie werd gemeten bij 570 nm (ELISA-lezer, Dynatech MR5000, Kloten, Zwitserland).
Restive CeH viabiHiy ( procent )=[(Voorbeeld bij 570 nm — Ablank bij 570 nm)]/[(Acontrol bij 570 — Ablank bij 570)] x 100.
Nitroblauwtetrazolium (NBT)-reductietest en 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-test: het aantal cellen werd aangepast tot 1x 1{{10}}6 cellen/ml . Vervolgens werden 50 mg/ml ECH, resveratrol (RES) en geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) (controle) toegevoegd en gedurende 18 uur bij 37°C samen gekweekt. Vervolgens werd 0,3 ml NBT-oplossing (0,1 mg/ml NBT, 5 procent FBS en 3 procent dimethylsulfoxide (DMSO) opgelost in 10 ml DMEM) toegevoegd en gedurende 1 uur bij 37°C in 5 procent C02 geïncubeerd. Na centrifugatie (bij 800 xg gedurende 3 minuten) werd het supernatant verwijderd en werd 200 L DMSO toegevoegd en gedurende 5 minuten geschud in een ultrasone oscillator (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). De absorptie werd gemeten bij 630 nm. Voor de DPPH-radicaaltest werd Trolox (in 95 procent alcohol) als standaard genomen. Vervolgens werd 75 L 0,5 mM DPPH-oplossing gemengd met 25 卩L monsters en 30 minuten op kamertemperatuur op een donkere plaats laten reageren. Het mengsel werd geschud en de absorptie werd gemeten bij 517 nm.
Analyse van het gehalte aan reactieve zuurstofspecies (ROS): Het aantal cellen werd aangepast tot 2 x 105 cellen/ml in een 12-wells-plaat die 2 procent FBS bevatte. Vervolgens werd 50 L / ml ECH, RES en AGE's aan de plaat toegevoegd en 24 uur bij 37 OC geïncubeerd. Na 24 uur werd 2Z,7Z-dichloorfluoresceïne-diacetaat (DCFH-DA) toegevoegd en gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Na centrifugatie (400x g, 5 min) werd het supernatant verwijderd en werden de cellen tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Nadat cellen waren gesuspendeerd in 1 ml PBS en de niveaus van ROS werden bepaald met behulp van een flowcytometer (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, VS).
Identificatie en kwantitatieve analyse van eiwit: Eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van eiwitextractiereagens (T-PER). De celdichtheid werd ingesteld op 2 x 105 cellen/ml in een 12-well plate en 50 L/ml ECH, RES en een receptor voor de antagonist van het geavanceerde glycatie-eindproduct (RAGE), en er werden AGE's toegevoegd en geïncubeerd bij 37 OC in een 5 procent CO2-incubator gedurende 24 uur. Daarna werd 400 L T-PER toegevoegd, van de cellen geschraapt en 20 min (4 OC) bij 125,000xg gecentrifugeerd. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -80 OC (-80 OC vriezer, Nuaire, Plymouth, MN, VS) voor verdere analyse. Bicinchoninezuur (BCA) -kit werd gebruikt voor eiwitkwantificering. Vervolgens werden 10 L standaard celoplossing en 200 RL BCA-reagens toegevoegd aan 8-putjesplaten en gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een 5 procent CO2-incubator geïncubeerd. De absorptie werd gemeten bij 562 nm. Eiwitidentificatie-analyse werd uitgevoerd door natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamidegel (SDS-PAGE) elektroforese. Monsters werden bereid door eiwitlysaat toe te voegen aan eiwitbeladingsbuffer en Western-blot-analyse werd uitgevoerd om de specifieke eiwitten te detecteren.
2.2.2.In vivo-analyse
Ontwerp van diermodellen: Zestig {{0}} weken oude mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten werden gekocht bij het National Laboratory Animal Centre (Taipei, Taiwan). Elke rat werd afzonderlijk gehuisvest in desinfecterende roestvrijstalen kooien onder gecontroleerde temperatuur (23 1 graad) en vochtigheid (40-60 procent) met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker. Voedsel en water werden ad libitum verstrekt. Elke rat werd in de eerste week gedomesticeerd en kreeg laboratoriumknaagdierdieet 5001 als hoofddieet. Alle procedures volgden de norm van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-goedkeuringsnr. 101026) van de National Taiwan Ocean University, Taiwan. Na domesticatie werden ratten verdeeld in twee groepen: de controlegroep (Con) die werd gevoed met laboratoriumdieet 5001 en de diabetische groep die werd gevoed met een vetrijk dieet (HFD, 40 procent) voor het hele experiment. Na 4 weken met de HFD te zijn gevoerd, werden de ratten van de diabetische groep geïnjecteerd met streptozotocine (65 mg/kg) (STZ) om diabetes mellitus (DM) te induceren. Binnen 15 minuten na het injecteren van STZ werd nicotinamide (230 mg/kg lichaamsgewicht) geïnjecteerd. Een week na injectie werd een orale glucosetolerantietest (OGTT) uitgevoerd om de succesvolle inductie van diabetische mellitus (DM) te bepalen. Daarna werden de dieren in zes groepen verdeeld: de controle (gevoed met laboratoriumdieet 5001); DM-groep (DM plus 45 procent HFD); DMR-groep (DM plus rosiglitazon: 0,571 mg/kg LG) plus 45 procent HFD; DME1-groep (DM plus CTE: 80 mg/kg BW) plus 45 procent HFD; DME2-groep (DM plus CTE: 160 mg/kg BW) plus 45 procent HFD; en DME4-groep (DM plus CTE: 320 mg/kg BW) plus 45 procent HFD. Rosiglitazon (RSG) werd als positieve controle genomen. Drie doses CTE (80, 160 en 320 mg/kg) werden gebruikt volgens de aanbeveling van de Taiwan Food and Drug Administration (TFDA) functionele evaluatierichtlijnen voor gezondheidsvoeding. Behandelingen werden gegeven tot het einde van het experiment. Alle experimentele ratten werden na 6 weken opgeofferd. Het bloed dat van de ratten werd verzameld, werd 15 min bij 4 graden bij 3000 rpm gecentrifugeerd.
Mian effectieve ingrediënten van cistanche tubulosa
Het supernatant werd onderzocht voor de volgende analyse:
Bepaling van totale glucose, triglyceriden en cholesterol: De glucosebepaling werd uitgevoerd door middel van glucose-enzymatische kits. Vervolgens werden 20 bloedplasmamonsters aan de reagentia toegevoegd en gedurende 5 minuten op 37°C gehouden. De totale triglyceriden en de totale cholesterolconcentratie werden bepaald met behulp van triglyceride- en cholesterol-enzymatische kits. Vervolgens werd 10 ^L bloedplasma aan de reagentia toegevoegd en het experiment werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De absorptie werd gemeten bij 510 nm.
Plasma totaal glucose/triglyceride/cholesterol (mg/dL)=(-ABlank)/(Astandaard - ABlank) x 200.
A-monster: Absorptie van bloedmonsters, ABlank: Absorptiewaarde van kits zonder monster, A-norm: Absorptiewaarde van het standaardreagens, 200: standaardreagentia bij een concentratie van 200 mg/dL.
Bepaling van insuline, leptine en homeostatische modelbeoordeling-insulineresistentie (HOMA-IR): Het insulineniveau werd bepaald met insuline-ELISA-kits. Hier werd 25 bloedplasma aan de reagentia toegevoegd en werd de absorptie gemeten bij 450 nm. Het totale leptinegehalte werd bepaald met behulp van een leptine-enzym-immunometrische testkit. Vervolgens werden 100 plasma geanalyseerd en werd de absorptie gemeten bij 450 nm met behulp van een ELISA-lezer. Het hele experiment werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De HOMA-IR-waarde werd bepaald aan de hand van de vergelijking van het homeostasemodel=Nuchtere plasma-insulineconcentratie (mU/ml) x nuchtere plasmaglucoseconcentraties (mmol/L)/22,5.
Plasma-lipideperoxidatie: hier werd {{0}} 0,5 ml bloedplasma gemengd met 1 ml reagens (15 procent, w/v trichloorazijnzuur in 0,25 N zoutzuur (HCl ) en 0,375 procent, w/v thiobarbituurzuur in 0,25 N HC1) en gedurende 15 minuten in een waterbad (Water Bath, BUCHI461, Zürich, Zwitserland) bij 100°C geplaatst. Na afkoelen werd 1 ml n-butanol toegevoegd, krachtig geschud en 10 minuten bij 1500 x g gecentrifugeerd. Het supernatant werd verzameld en de absorptie werd gemeten bij 532 nm [12].
Malondialdehyde (MDA) concentratie (nM/mL)=[(ASample bij532 nm - Ablank at532 nm)/ (Astandard at 532 nm - Ablank at 532 nm)] x 5.
Bepaling van plasma testosteron en luteïniserend hormoon (LH) niveaus: De testosteron ELISA kit werd gebruikt om het niveau van testosteron in het bloedplasma te meten. RIA-kit werd gebruikt om de LH-concentratie te bepalen. Vervolgens werd 50 L plasma toegevoegd en werd er gerekend op de concentratie van het hormoon LH-RP-3 (standaard). De verdere stappen werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.
Bepaling van tumornecrosefactor (TNF)-a en interleukine-6 (IL-6)-concentratie: Het opgevangen antilichaam werd 250 keer verdund in coatingbuffer, toegevoegd aan een {{4} }well plate (100 L/well), en gedurende de nacht bewaard bij 4°C. Het supernatant werd afgezogen en vijf keer gewassen met wasbuffer (1 keer PBS, 0,05% Tween 20). Na incubatie (1 uur) met 200 ^g testverdunningsmiddel werden de cellen 5 keer gewassen met wasbuffer en 100 ^L TNF-a standaardoplossing of testmonsters werden aan elk putje toegevoegd en 2 uur geïncubeerd. Na het wassen werden 100 RL van met IL-6 gedetecteerde antilichamen toegevoegd en geïncubeerd op 1 ha kamertemperatuur. Het supernatant werd afgezogen en 5 keer gewassen. Vervolgens werd 480 RL enzym avidine-mierikswortelperoxidase (HRP) toegevoegd en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het supernatant werd afgezogen en vijf keer gewassen met wasbuffer. Vervolgens werd 100 RL substraatoplossing toegevoegd en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Later werd aan elk putje 50 RL stopoplossing (1M fosforzuur) toegevoegd en werd de absorptie gemeten bij 450 nm.
Het voordeel van Cistanche Echinacoside: Anti-oxidatie
Analyse van sperma- en testisparameters
Spermamonsterafname: Het afnemen van spermamonsters is uitgevoerd volgens de methode die eerder is beschreven in [13]. Het sperma werd verzameld uit het supernatant en gebruikt voor verdere analyse.
Het aantal sperma, de beweeglijkheid van het sperma en abnormaal sperma: het aantal sperma werd berekend met behulp van de hemocytometer en trypanblauwe oplossing. Vervolgens werd 100 RL spermavloeistof gemengd met trypanblauwe oplossing en het aantal sperma, motiliteit en abnormaal sperma werd berekend met behulp van een hemocytometer en microscoop [14].
Nitroblauwtetrazolium NBT-reductie en lipideperoxidatie van sperma en testis: De lipideperoxidatie en NBT-reductie werden geanalyseerd volgens dezelfde procedure van plasmaanalyse.
Bepaling van superoxide dismutase (SOD) en katalase activiteit: Superoxide dismutase (SOD) activiteit werd geanalyseerd met behulp van de RANSEL kit. Hier werd {{0}}.05 ml testiculaire homogenaten toegevoegd aan 1,7 ml reactieoplossing (0,05 mM xanthine, 0,025 mM 2-({ {9}}joodfenyl)- 3-(4-nitrofenol)-5-fenyltetrazoliumchloride (INT)). Na mengen werd 0,25 ml xanthine-oxidase (80 U/L) toegevoegd en gedurende 30 s bij kamertemperatuur bij kamertemperatuur gereageerd. De absorptie werd gemeten bij 505 nm. De eiwitconcentratie van het testiculaire homogenaat werd bepaald met een Bio-Rad DC-eiwittestkit en de specifieke activiteit ervan (E/mg eiwit) werd berekend. De catalase (CAT)-activiteit werd bepaald volgens een eerder gerapporteerde methode [15].
H&E (hematoxyline en eosine) kleuring
De testis werd 24 uur geweekt in 10 procent formaline en bewaard bij 4°C. Snijd de weefsels in microformaat en bevestigd aan het glaasje. Na fixatie (95 procent methanol plus 5 procent azijnzuur) werden de objectglaasjes 3 minuten ondergedompeld in hematoxyline, 5 minuten gewassen met stromend water en vervolgens een minuut geweekt in 50 procent, 70 procent en 90 procent alcohol. Daarna werden de glaasjes 10 seconden gekleurd met eosine en een minuut geweekt in 100 procent alcohol totdat het vervaagde. Tenslotte werd het objectglaasje gedurende één minuut in xyleen geweekt. Later werd het objectglaasje aan de lucht gedroogd en verzegeld. De gekleurde buis werd in een omgekeerde fasecontrastmicroscoop (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK -2, Tokyo, Japan) geplaatst om de morfologie te observeren.
Analyse van de hypothalamus
De muis KISS1, G-proteïne gekoppelde receptor (GPR) 54, suppressor van cytokine signalering 3 (SOCS -3), en sirtuin 1 (SIRT1) gensequenties werden geïdentificeerd uit de NCBI (National Center for Biotechnology Information) gendatabase en een specifieke primer werd ontworpen met Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, VS.). De in het experiment gebruikte primers staan vermeld in tabel 1.
Extractie van ribonucleïnezuur (RNA) uit de hypothalamus. De extractie van RNA uit de hypothalamus van de hersenen werd uitgevoerd met behulp van de RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. De verkregen mRNA's werden kwantitatief gemeten door middel van reverse transcriptie (RT) en polymerasekettingreactie (PCR). Het compliment-DNA verkregen uit RT-analyse werd bewaard bij -20 graden voor later gebruik. Het geëxtraheerde DNA werd onderworpen aan analyse van de polymerasekettingreactie (PCR) met behulp van Taq-polymerase. Vervolgens werd 5 ~ 10 ^L van het PCR-product genomen en geanalyseerd door elektroforese op een agar-colloïde van 1,5%. De afbeelding is gemaakt in een UVP BioDoc-It-beeldvormingssysteem. Omgekeerd getranscribeerd complementair deoxyribonucleïnezuur (cDNA) werd genomen en PCR werd uitgevoerd met behulp van de IQ SYBR Green Supermix Kit. Later werd het geanalyseerd met iQTM 5 Optical System Software. Eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van een eiwitextractiereagens (T-PER). Vervolgens werd 20 mg testiculaire homogenaat toegevoegd aan 400 ^L T-PER en gecentrifugeerd (High Speed Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Duitsland) bij 4 graden (125,000 xg) voor 20 minuten. De volgende methode was vergelijkbaar met "identificatie- en kwantificeringsanalyse van eiwit" in vitro-analyse.
2.3.Statistische analyse
De experimentele resultaten werden uitgedrukt als de gemiddelde 土 standaarddeviatie (gemiddelde 土 SD) en de gegevens werden geanalyseerd met Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0-software, IBM, Armonk, New York, NY, VS. De verschillen tussen de groepen werden geanalyseerd door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA). Meerdere vergelijkingen van verschillende groepen werden geanalyseerd door Duncan's test op de waarde van p < 0.05="" als="" het="" significante="">
