Effect van Cistanche Tubulosa-extracten op de mannelijke voortplantingsfunctie bij door streptozotocine-nicotinamide geïnduceerde diabetische ratten-Ⅱ

3.2. In vivo analyse

3.2.1. Effecten van CTE op lichaamsgewicht en calorie-inname

Na zes weken experimenteren vertoonde de diabetesgroep (HFD-DM) een hoger lichaamsgewicht dan de controlegroep. De HFD-DME4-groep vertoonde een lager lichaamsgewicht dan de HFD-DM- en HFD-DMER-groepen (Figuur 7a). De calorie-inname van de controlegroep was significant lager dan die van de andere groepen. Er was geen significant verschil tussen de calorie-inname van de andere vijf groepen (Figuur 7b).

3.2.2. Orale glucosetolerantietest (OGTT) om de succesvolle inductie van diabetes te bepalen

De orale glucosetolerantietest (OGTT) wordt gebruikt als een veelbelovend hulpmiddel voor het opsporen van diabetes mellitus. Verhoogde glucosewaarden in het bloed duiden op een diabetestoestand. Zoals weergegeven in Figuur 8a was het plasmaglucoseniveau lager in de CTE-groepen dan in de DM-groep na 0, 30, 90 en 120 minuten. Verder toonde het gebied onder de curve (AUC) van de plasmaglucoseconcentratie aan dat in de CTE- en RSG-groepen de opnamesnelheid van bloedglucose was verhoogd (Figuur 8b).

3.2.3. Totaal plasmaglucose-, cholesterol- en triglyceridengehalte

De plasma-nuchtere bloedglucosespiegel was hoger in de DM-groep en lager in de DME2-groep (behalve de controlegroep) dan in de anderen. Er was geen significant verschil in het totale cholesterol tussen de groepen, behalve voor de DME4-groep. In de DME4-groep was het cholesterolgehalte lager dan bij de anderen. Het niveau van triglyceriden was hoger in de DM-groep en lager in de DME4-groep en het triglyceridengehalte was verlaagd met een toename van de concentratie CTE (Tabel 2). De resultaten laten zien dat het niveau van plasmaglucose, cholesterol en triglyceriden hoger was in de DM-groep en dat het niveau significant daalde bij behandeling met CTE.

3.2.4. Plasma-insulineniveaus, plasmaleptineniveau en homeostasemodelbeoordeling – waarden voor insulineresistentie (HOMA-IR)

De niveaus van plasma-insuline, leptine en HOMA-IR-waarden worden weergegeven in Tabel 3. De DM-groep had hogere plasma-insuline- en plasmaleptine-niveaus dan de controlegroep. De HOMA-IR-index was ook significant hoger in de DM-groep. De plasma-insuline-, leptine- en HOMA-IR-waarden namen af ​​met een toename van de CTE-concentratie. Plasmaleptine was significant verminderd in CTE-groepen, maar de RSG-geneesmiddelengroep (DMR) vertoonde geen significant verschil met de DM-groep.

3.2.5. Effect van CTE op plasma-LH- en testosteronniveaus bij diabetische ratten

Zoals weergegeven in Tabel 4 waren de concentraties testosteron bij diabetische ratten significant verlaagdde concentraties testosteron waren aanzienlijk verhoogdbij verschillende doses CTE. Verder toonden de resultaten een lichte afname van het LH-niveau in de DM-groep in vergelijking met DMR, DME1, DME2 en DME4. De LH-productie was hoger in de DME4-groep.

3.2.6. Effect van CTE op de spermaparameters van diabetische ratten

De experimentele resultaten toonden aan dat de DM-groep een significante afname van het aantal spermacellen en de beweeglijkheid had dan de controlegroep, terwijl het percentage sperma-afwijkingen significant was toegenomen in de DM-groep. Interessant is dat het aantal zaadcellen, de beweeglijkheid van de zaadcellen en de mate van spermaafwijkingen van de DMR-groep verbeterden, maar de beweeglijkheid van het sperma bereikt geen significant niveau in vergelijking met DME4. DME2 vertoonde een beter aantal zaadcellen dan alle andere en de beweeglijkheid was significant verhoogd in de DME4-groep. Er was geen significant verschil tussen de aantallen abnormaal sperma tussen de met RSG en CTE behandelde groepen (Tabel 5).

3.2.7. Effect van CTE op de morfologie van tubuli seminiferi bij diabetische ratten

Figuur 9 toont de H&E-kleuring van het testisgedeelte. De zwarte pijl geeft de Leydig-cel aan en de witte pijl geeft de Sertoli-cel aan. Zowel de Leydig-cel als de Sertoli-cel in de DM-groep vertoonden significante atrofie en er werd een holte in het lumen gezien. De structuur van Leydig-cellen en Sertoli werd hersteld in CTE- en RSG-behandelde groepen. De dikte van de tubulus seminiferi was hoger in de CTE- en RSG-groepen dan in de DM-groep.

3.2.8. Effect van CTE op KiSS1-, GPR54-, SOCS-3- en SIRT1-MRNA's in de hypothalamus van diabetische ratten

De expressie van KiSS1 (Figuur 10a), GPR54 (Figuur 10b), SOCS-3 (Figuur 10d) en SIRT1 (Figuur 10c) werden getoond in Figuur 10. De mRNA-expressie van KiSS1 en receptor GPR54 bij diabetische ratten was aanzienlijk lager dan in de controlegroep. De mRNA-expressieniveaus van KiSS1 en GPR 54 in DMR, DME1, DME2 en DME4 waren significant verhoogd. In het bijzonder was de GPR54-mRNA-expressie significant verhoogd in DME4 en was vrijwel vergelijkbaar met de controlegroep.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR BESCHERMING VAN DE PRODUCTIE VAN TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Dit experiment onderzocht verder de hoeveelheid SOCS-3- en SIRT1-mRNA's in de hypothalamus van ratten. De expressie van SOCS-3 mRNA bij diabetische ratten was significant verhoogd, wat aangeeft dat de leptine-impedantie ernstiger was. De DMR-, DME1-, DME2- en DME4-groepen vertoonden significante verbeteringen in vergelijking met de diabetesgroep. De SIRT1-mRNA-expressie in de DM-groep was significant afgenomen en was significant verhoogd in de DME1- en DME4-groepen.

3.2.9. Effect van CTE op antioxidante enzymen in plasma en testis van diabetische ratten

Tabel 6 laat zien dat de plasma-SOD-activiteit, GPx-activiteit en katalase-activiteit van diabetische ratten significant waren afgenomen en dat de activiteiten waren toegenomen in met CTE en RSG behandelde groepen. Daarnaast vertoonde DME4 significante verbeteringen in GPx-activiteit dan andere. De resultaten toonden aan dat de SOD- en catalase-activiteiten bij ratten met diabetes na zes weken significant waren afgenomen. De SOD- en katalase-activiteit van de DMR-groep bereikt geen significant niveau. De met CTE behandelde groepen vertoonden significante verbeteringen in de SOD- en catalase-activiteit. De verhoogde activiteiten van catalase en SOD in CTE-groepen werden ook waargenomen in testis (Tabel 7). De hoogste activiteit van SOD en catalase werd waargenomen in respectievelijk de DME1-groep en de DME2-groepen.

3.2.10. Effecten van CTE op oxidatieve stress en ontstekingen in het plasma en de testis van diabetische ratten

De productie van stikstofmonoxide (NO) in plasma (Figuur 11a) en testis (Figuur 11b) werd getoond in Figuur 11. De productie van NO in de DM-groep was significant verhoogd, zowel in de testis als in het plasma, vergeleken met de controlegroep. Een geleidelijke vermindering van de NO-productie werd waargenomen in de DME1-, DME2- en DME4-groepen (in plasma). De DMR-groep vertoonde ook een significante vermindering van de NO-productie. In het geval van de testis werd er een lichte vermindering van de NO-productie waargenomen bij CTE-groepen, terwijl de DMR-groep de NO-productie niet significant verminderde.

Zoals getoond in Figuren 12 en 13 waren de niveaus van TNF- en IL-6 significant verhoogd bij ratten met diabetes (zowel in plasma als testis), wat aangeeft dat de ontsteking ernstiger is. In plasma is het niveau van TNF- vergelijkbaar in de met CTE en RSG behandelde groepen (Figuur 12a). De CTE-groepen (vooral DME2) verminderden het niveau van TNF- in de testis aanzienlijk (Figuur 12b). Het niveau van IL-6 was significant verlaagd in het plasma van CTE- en RSG-groepen (Figuur 13a). In de testis was er een trend naar een verlaging van het niveau van IL-6, maar dit bereikte geen significant niveau (Figuur 13b).

3.2.1.1. Effecten van CTE op oxidatieve stress en ontstekingen bij spermatozoa van diabetische ratten veroorzaakt door een vetrijk dieet

Figuur 14 toont het superoxide-aniongehalte in rattensperma. Uit de resultaten bleek dat de productie van superoxide-anionen in het sperma van ratten met diabetes significant toenam en dat er geen significante verbetering werd waargenomen in de DMR-groep. DME1- en DME4-groepen vertoonden een significant verminderde productie van superoxide-anion.

3.2.12. Effecten van CTE op lipidenperoxidatie bij spermatozoa van diabetische ratten veroorzaakt door een vetrijk dieet

Uit onderzoek is gebleken dat de lipidenperoxidatie verhoogd was bij zowel type 1- als type 2-diabetespatiënten [19]. Het malondialdehyde (MDA)-gehalte in plasma, sperma en testis wordt weergegeven in Tabel 8. Het MDA-gehalte in plasma, testis en sperma van de DM-groep was significant hoger en de behandeling met CTE en RSG verminderde de productie van MDA. Er werd een significante reductie waargenomen in de DME4- en DMEI-groepen in plasma. Uit deze studie bleek dat ratten met diabetes niet alleen de mate van lipidenperoxidatie in plasma verhoogden, maar ook in testis en sperma. Er werd een significante verbetering waargenomen bij verschillende doses CTE.

4. Discussie

Diabetes is een chronische ziekte die gepaard gaat met een hoog suikergehalte in het bloed. De onbalans tussen antioxidant- en ROS-niveaus zal leiden tot de aandoening die oxidatieve stress wordt genoemd. Superoxide, hydroxylradicaal, waterstofperoxide, stikstofmonoxide en singletzuurstof zijn enkele voorbeelden van ROS die via oxidatieve stress zullen bijdragen aan diabetesaandoeningen [20].Cistanche tubulosais een woestijnplant die actieve componenten bevat zoalspolysachariden, oligosachariden, fenylethanoïdeglycosiden (echinacoside, verbascoside), palmitinezuur, linolzuur, iridoïden, alditolen en lignanen. Deze plant is in staat ontstekingsremmende, neuroprotectieve, antibacteriële, antivirale, antioxidatieve, antitumorale en immuunmodulerende effecten te veroorzaken [21]. Uit literatuurstudies blijkt dat de fenylethanoïdeglycosiden uit Cistanche tubulosa de belangrijkste reden zijn voor de antioxiderende werking [22]. Resveratrol (RES) en rosiglitazon (RSG) werden gebruikt als positieve controle voor respectievelijk in vitro- en in vivo-onderzoeken. RSG is een krachtige insulinesensibilisator en heeft affiniteit voor de isovorm van de peroxisoomproliferator-geactiveerde receptor (PPARc). Het regelt hyperglykemie bij diabetespatiënten [23]. RES heeft een natuurlijke antioxiderende werking en werkt als een vasodilatator, reguleert het lipoproteïnemetabolisme, remt de aggregatie van bloedplaatjes en voorkomt kanker [24,25]. Uit ons onderzoek bleek dat de ECH een betere radicale wegvangende activiteit vertoont dan CTE en RES (Figuur 1). Het is ook duidelijk dat de ECH geen enkele significante toxiciteit veroorzaakt voor LC-540- en TM3 Leydig-cellen (Figuur 2).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR MANNELIJKE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE's werden gebruikt om stressomstandigheden in Leydig-cellen te induceren. De productie van AGE’s, ontstekingen, oxidatieve stress en diabetes zijn met elkaar verbonden. De hyperglycemische toestand van diabetes bevordert celbeschadiging door de productie van AGE’s en oxidatieve stress. AGE's veroorzaken celtoxiciteit, wat de rekrutering en celdood van immuuncellen verder bevordert. Een verhoogd niveau van AGE’s bevordert de expressie van twee soorten receptoren, RAGE en AGER1 genaamd [26]. Het druppelen en de daaropvolgende overdracht van een elektron van de mitochondriale ademhalingsketen naar moleculaire zuurstof tijdens oxidatieve stress resulteert in de vorming van een superoxide-anion. Onze resultaten laten zien dat de productie van superoxide-anion geïnduceerd door AGEs was toegenomen in de controlegroep en dat verdere verbeteringen werden waargenomen met zowel ECH- als RES-behandelingen. Volgens onze studie was het duidelijk dat de productie van superoxide (Figuur 3) en H2O2 (Figuur 4) geïnduceerd door AGEs daalde in de aanwezigheid van ECH en RES.

NF-KB staat bekend als de belangrijke mediator van ontstekingen geassocieerd met diabetes [27]. De expressie van NF-KB leidt tot celdisfunctie en celdood. De activering van NF-KB door oxidatieve stress stimuleert de pro-inflammatoire respons, opregulatie van endotheline en apoptose [28]. De expressie van RAGE en NF-KB was verhoogd in door AGE gestimuleerde groepen en de daaropvolgende reductie werd waargenomen in met ECH en RES behandelde cellen (Figuur 5).

Testosteronis een anabole steroïde en primairmannelijk geslachtshormoongesynthetiseerd uit cholesterol. Het proces begint met de oxidatieve splitsing van de zijketen van cholesterol door het gen voor splitsing van de zijketen van cholesterol (CYP11A). Dit gen bevindt zich in het mitochondriale membraan en zet het cholesterol om in pregnenolon. Vervolgens verwijdert het CYP17A1-gen uit het endoplasmatisch reticulum twee extra koolstofatomen en produceert het meerdere C19-steroïden. Daarnaast wordt het pregnenolon geoxideerd tot androsteendion/progesteron door hydroxysteroïddehydrogenase (3- -HSD). Ten slotte wordt testosteron geproduceerd door de reductie van de ketogroep op de 17e koolstofpositie van androsteendion door 17-bèta-hydroxysteroïde-dehydrogenase (17- -HSD). Leydig-cellen zijn betrokken bij de belangrijkste productie van testosteron. De overdracht van cholesterol naar het binnenste mitochondriale membraan vereist de werking van steroïdogeen acuut regulerend eiwit (StAR). Uit huidige onderzoeken blijkt dat de expressie van StAR, CYP11A1, CYP17A1 en HSD17 3 was afgenomen in met AGE behandelde cellen (controle) en dat er een enorme toename werd aangetoond in met ECH en RES behandelde cellen (Figuur 6). . De resultaten laten dus zien dat de productie vantestosteron was verhoogd in de met ECH en RES behandelde groepen. 

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN SEKSKRACHT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tijdens een diabetische aandoening is het transport van glucose naar de organen beperkt en als gevolg daarvan stijgen de glucosespiegels [29]. Daarom is de hyperglykemische toestand een van de belangrijke markers voor de detectie van diabetes. Uit onze onderzoeken blijkt dat de plasmaglucosespiegel verhoogd was bij diabetesgroepen en dat de AUC van de DM-groep significant hoger was dan bij de andere groepen (Figuur 8). Samen met plasmaglucose was het totale cholesterol- en triglyceridengehalte significant verhoogd in de DM-groep (Tabel 2). Atherosclerose wordt vergemakkelijkt door een verhoogd niveau van cholesterol en triglyceriden [30]. Het niveau van cholesterol en triglyceriden was echter verlaagd in de met CTE en RSG behandelde groepen. Het triglyceridengehalte van de DME4-groep bereikte bijna vergelijkbare waarden als die van de controlegroep.

Insuline is een hormoon dat wordt geproduceerd door de cellen van de alvleesklier en is gefunctionaliseerd om de bloedsuikerspiegel in het lichaam onder controle te houden, terwijl leptine een hormoon is dat wordt geproduceerd door de adipocyten en die in staat zijn de voedselinname en het energieverbruik te reguleren. Studies hebben aangetoond dat leptine betrokken is bij de pathofysiologie van obesitas en dat er een positieve interactie bestaat tussen leptine en insuline [31]. Uit onze onderzoeken blijkt dat de niveaus van plasma-inuline en leptine hoger waren in de DM-groep en dat de insulinespiegel daalde bij een toename van de CTE-concentratie. De RSG-groep vertoont geen significant verschil met de DM-groep. De insulineresistentie en celfunctie werden beoordeeld met de HOMA-IR-methode. De HOMA-IR-waarde nam toe in de DM-groep en was significant verschillend van andere groepen (Tabel 3).

DM beïnvloedt de voortplantingsfunctie via de hormonale afwisseling in de HPG-as en uit onderzoek is gebleken dat de insuline-expressie in de testis ook wordt beïnvloed door diabetes. Het wordt gekenmerkt door vacuolisatie van Sertoli-cellen, verhoogde DNA-fragmentatie, verminderde spermatogenese en verhoogde uitputting van kiemcellen. Oxidatieve stress draagt ​​ook bij aan afwijkingen in de voortplantingsfunctie [32]. Het proces van spermavorming in het mannelijke voortplantingsorgaan (teelballen) wordt spermatogenese genoemd. De testis bestaat uit strak opgerolde tubuli die tubuli seminiferi worden genoemd. Sertoli-cellen worden gezien in de wanden van de tubulus seminiferi en voeden het onrijpe sperma. Het onderzoek naar spermaparameters gaf aan dat het aantal spermacellen en de beweeglijkheid afnam en dat de afwijkingen toenamen in de DM-groep (Tabel 5). Een tegengesteld effect werd waargenomen in de CTE- en RSG-behandelde groepen. Zowel de Leydig-cel als de Sertoli-cellen in de DM-groep vertoonden significante atrofie en de holte werd in het lumen gezien. De dikte van de tubulus seminiferi nam ook af in de DM-groep. Er werd een verbeterd resultaat waargenomen bij met CTE en RSG behandelde groepen (Figuur 9). Daarnaast daalde het niveau van LH en testosteron in de DM-groep en stegen de niveaus in de met CTE behandelde groepen (Tabel 4). Bij mannen werden een laag serumtestosteron en een lagere LH-pulsfrequentie vaak geassocieerd met obesitas en diabetes mellitus type 2 [33].

Kisspeptines gecodeerd door het KiSS1-gen staan ​​bekend als de krachtige stimulator van de HPG-as en elke mutatie in het kisspeptine-gen zal leiden tot lage niveaus van geslachtssteroïden en gonadotropine. Studies tonen aan dat bij STZ-geïnduceerde diabetische ratten de Kiss1-mRNA-niveaus verlaagd waren [33]. Het initiëren en in stand houden van onvruchtbaarheid bij zoogdieren houdt verband met G-eiwit-gekoppelde receptor 54 (GPR54). De mutatie in GPR 54 wordt gekenmerkt door de afwezigheid van seksuele rijping en lage niveaus van gonadotrope hormonen (LH en FSH). Pro-inflammatoire cytokines zoals IL-6 en TNF-reguleren de expressie van de suppressor van cytokinesignalering 3 (SOCS3) die betrokken is bij ontstekingsgemedieerde insulineresistentie in de lever en adipocyten [34]. SIRT 1 is een gen dat betrokken is bij de regulatie van verschillende verouderingsziekten. Dit gen komt prominent tot expressie in de cellen van de pancreas en reguleert de insulinesecretie en voorkomt apoptose. Uit huidige onderzoeken bleek dat de expressie van KiSS1, GPR54 en SIRT1 afnam in de DM-groep, maar dat de expressie toenam in de met CTE behandelde groepen (Figuur 10). Een toename van de SOCS-3-expressies in de DM-groep duidt op de ontstekingsaandoening. De eerste moleculaire link die werd geïdentificeerd tussen obesitas en ontstekingen was TNF-. Daarom is een verhoogd niveau van TNF- een indicator van ontsteking. Het verlaagde niveau van pro-inflammatoire cytokines zoals TNF- en IL-6 werd waargenomen in met CTE behandelde groepen (figuren 12 en 13).

De onbalans tussen ROS en antioxidanten leidt tot de diabetische aandoening. Superoxide-dismutase (SOD), catalase (CAT) en glutathionperoxidase (GPX) staan ​​bekend als de belangrijkste antioxidanten die verantwoordelijk zijn voor het handhaven van het optimale ROS-niveau [35]. Uit de resultaten bleek dat de activiteit van antioxidanten significant lager was in de DM-groep. CT-behandelde groepen vertoonden verbeteringen in de productie van antioxidanten. De met RSG behandelde groep vertoonde geen significante verbeteringen in de antioxidantactiviteit (tabellen 6 en 7).

Stikstofmonoxide (NO) staat bekend als een belangrijke ROS die bijdraagt ​​aan ontstekingen. Uit onze onderzoeken blijkt dat het niveau van NO verlaagd was in de met CTE behandelde groepen (Figuur 11). Uit de resultaten bleek dat het gehalte aan superoxide-anionen in het sperma van ratten met diabetes significant toenam en dat er geen significante verbetering was na toediening van RSG. De productie van superoxide was verminderd in CTE-groepen.

De bepaling van MDA is zeer nuttig voor het evalueren van lipideperoxidatie. Lipidenperoxidatie is het proces van oxidatie in lipiden en resulteert uiteindelijk in celbeschadiging. MDA wordt geproduceerd als resultaat van lipideperoxidatie van meervoudig onverzadigde vetzuren. Studies tonen aan dat het MDA-niveau gecorreleerd is met de leeftijd en het nuchtere bloedglucoseniveau [36]. Uit het huidige onderzoek blijkt dat de CTE de lipidenperoxidatie in plasma, testis en sperma verbetert (Tabel 8).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Conclusies

De oxidatieve stress tijdens diabetische aandoeningen verstoort het mannelijke voortplantingssysteem door beschadiging van het sperma en gonadale disfunctie. Cistanche tubulosa is een woestijnplant die algemeen aanvaard wordt in de Chinese geneeskunde vanwege zijn farmacologische effecten.Echinacoside (ECH)is het hoofdbestanddeel van CTE, verantwoordelijk voor zijn antioxiderende en ontstekingsremmende activiteiten. Onze in vitro resultaten gaven aan dat de ECH de testosteronsyntheseroute herstelde en het niveau van NF-KB- en RAGE-eiwitexpressie verlaagde. ECH remde effectief de productie van superoxide-anion en H2O2 in Leydig-cellen. Uit de in vivo onderzoeken bleek dat de ECH de niveaus van cholesterol, triglyceriden, TNF- en IL-6 verlaagde. Bovendien waren de mRNA-expressies in de hypothalamus van de diabetische ratten aanzienlijk verbeterd. Het is ook opmerkelijk dat de ECH de lipidenperoxidatie verminderde en de insulineresistentie verbeterde bij mannelijke ratten met diabetes. De antioxiderende activiteiten namen zowel in het plasma als in de testis toe. Daarom suggereerden onze onderzoeken dat de ECH effectieve bescherming bood tegen reproductieve dysfunctie bij STZ-geïnduceerde diabetische mannelijke ratten.