Effecten van glyosiden van Cistanche op het leren van cognitie en synaptische plasticiteit bij ratten met slaapgebrek

ABSTRACT

Objectief:Onderzoeken of de glycosiden van cistanche de leer- en cognitieve functie van slaapgebrekmodelratten kunnen verbeteren door de synaptische plasticiteit te reguleren.

Methoden: Vijftig mannelijke Wistar-ratten werden willekeurig verdeeld in een blanco controlegroep (Control), platformcontrolegroep (PC), modelgroep (Model),glycosiden van cistanche-groep (GC's)en estazolamgroep (Est). Het slaaptekortmodel van ratten werd opgesteld met behulp van een gemodificeerde multi-platform wateromgevingsmethode. Morris-waterdoolhof en open veldtest werden gebruikt om de ruimtelijke cognitieve functie en emotionele veranderingen van ratten te detecteren. Nissl-kleuring werd gebruikt om de veranderingen in de morfologie en de hoeveelheid zenuwcellen in het zenuwstelsel waar te nemenhippocampus CAl-gebied van ratten. Western blot en R'T-PCR werden gebruikt om de expressieniveaus van synaptophysine (SY'N), postsynaptische membraandichte substantie 95 (PSD -95) te detecteren, envan de hersenen afkomstige neurotrofe factor (BDNF). 

Resultaten;De resultaten van het Morris-waterdoolhof toonden aan dat, vergeleken met de controlegroep, deleer- en cognitieve vaardigheden van rattenin de Modelgroep was aanzienlijk afgenomen (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasverbeterde GC-behandeling ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the eiwit- en genexpressieniveaus van BDNF, SYN en PSD -95in de Mlodel-groep waren significant afgenomen (P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

KRUIDEN CISTANCHE FORMULERING SUPPLEMENTEN VOORVERBETERING VAN LEER- EN COGNITIEVE FUNCTIE

SLEUTELWOORDENGlycosiden van cistanche; Hippocampus; Slaapgebrek; Leren en geheugen; Spanning; Synaptische plasticiteit

Slaapstoornis (SD)is eenfunctionele stoornis van abnormale slaapveroorzaakt door een reeks complexe factoren, zoalsslapeloosheid, dromerigheid, Engemakkelijk ontwaken. In de afgelopen jarende incidentie van SDis geleidelijk toegenomen. Gerelateerde onderzoeken hebben gemeld dat SD kan veroorzakenhart- en vaatziekten,metabolische disfunctie,immuunziekten, Encentraal zenuwstelseldegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer [1]. SD kan oxidatieve schade aan hippocampale neuronen veroorzaken, cognitieve stoornissen veroorzaken en stemmingsveranderingen zoals angst en depressie veroorzaken [2]. Cistanche deserticola is een kostbaar medicinaal materiaal dat in China zowel als medicijn als als voedsel kan worden gebruikt. Het heeft als effect dat het de nieren versterkt en Qi aanvult, de darmen bevochtigt, de stoelgang bevordert en Yang versterkt. Het belangrijkste extract van Cistanche deserticola, glycosiden van cistanche (GC’s), heeft antioxiderende, anti-apoptotische, leverbeschermende en neuroprotectieve effecten [3]. Uit ons eerdere onderzoek is gebleken dat GC’s de leer- en cognitieve functie van SAMP8-muizen kunnen verbeteren door een antioxiderende en anti-apoptotische rol te spelen [4].

Gerelateerde onderzoeken hebben aangetoond dat cognitieve disfunctie veroorzaakt door SD nauw verwant is aan synaptische plasticiteit [5]. Er zijn echter weinig rapporten over het mechanisme waarmee GC's de synaptische plasticiteit reguleren en leer- en geheugenstoornissen en cognitieve achteruitgang bij ratten, veroorzaakt door slaapgebrek, verbeteren. Daarom heeft deze studie tot doel te onderzoeken of GCs de synaptische plasticiteit beïnvloeden door de expressie van synaptische markers te reguleren, waardoor de leer- en cognitieve functie van ratten met slaapgebrekmodellen wordt verbeterd, en nieuwe behandelingsideeën en plannen voor GCs te bieden om leer- en cognitieve problemen te behandelen. stoornis veroorzaakt door slaapstoornissen.

1 Materialen en methoden

1.1 Proefdieren

Mannelijke Wistar-ratten van 6 tot 8 weken oud, met een gewicht van 280 tot 300 g, werden gekocht bij Beijing Sibeifu, met een vergunning voor dierlijke productie [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Alle dieren werden in het Animal Experiment Center van Baotou Medical College gehouden onder de volgende omstandigheden: temperatuur (24 ± 1) graden, vochtigheid 50% tot 55%, 12 uur licht en 12 uur donker, en geen beperkingen op voedsel en water. Dit experiment werd goedgekeurd door de ethische commissie van de school [Baoyi Lunshen 2022 nr. (63)].

1. 2 Belangrijkste reagentia en instrumenten

De totale glycosiden van Cistanche deserticola werden gekocht bij Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (batchnummer: KSM20220609011); Estazolam-tabletten werden gekocht bij CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (batchnummer: 044220343); eiwitlaadbuffer (P1015), RIPA-lysebuffer (R0010), chemiluminescerende oplossing (PE0010), enz. werden allemaal gekocht bij Beijing Solebao; postsynaptische dichtheidssubstantie in 95 (PSD-95) antilichaam (AB192757) en synaptophysine (SYN) antilichaam (ab32127) werden gekocht bij Abcam, USA Company; van de hersenen afkomstige neurotrofe factor (BDNF) (48503-2) en -actine (52901) werden gekocht bij SAB Company, VS; geit-anti-konijn IgG secundair antilichaam (SA00001-20) werd gekocht bij Proteintech Company, VS; rattenmelatonine (MT) en ELISA Scientific Research Kit (MM-0657R1) werden gekocht bij Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Paraffin slicer (Leica, Duitsland); optische microscoop (Leica, Duitsland);

Morris waterdoolhof, open veldtestbox (Shanghai Xinruan); verticale elektroforese-apparatuur (Beijing Liuyi Company); ontkleuringsschudder (Beijing Liuyi Company); analysesysteem voor eiwitbeeldvorming (Shanghai Tanon Technology); fluorescentie kwantitatief PCR-instrument (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Experimentele methoden

1.3.1 Groepering van dieren en toediening van geneesmiddelen

50 mannelijke Wistar-ratten werden willekeurig verdeeld in blanco controlegroep (controlegroep), platformcontrolegroep (platformcontrole, pc-groep), modelgroep (modelgroep), totale glycosiden van Cistanche deserticola-groep (GCs-groep 50 mg/kg) en de estazolinegroep (Est-groep, 0,54 mg/kg), met 10 ratten in elke groep. De controlegroep en de PC-groep kregen via een maagsonde 0,9% zoutoplossing toegediend. Alle groepen kregen elke dag om 7.00 uur een maagsonde nadat het modelleren was begonnen, en de maagsonde duurde 21 dagen.

1.3. 2. Voorbereiding van een diermodel voor slaapgebrek

Het slaaptekortmodel werd opgesteld met behulp van de gemodificeerde multi-platform wateromgevingsmethode [6]. De experimentele uitrusting was een rechthoekige watertank van polyethyleenhars van 130 cm x 50 cm x 45 cm. In de watertank werd een klein platform geplaatst met een diameter van 5 cm en een hoogte van 20 cm. Het platform van de PC-groep had een diameter van 10 cm en een hoogte van 20 cm. De watertank werd gevuld met water tot een diepte van ongeveer 18 cm en de watertemperatuur werd op (20 ± 1) graden gehouden. Een week voor aanvang van het experiment werden de ratten elke dag gedurende 60 minuten in de slaaponthoudingsbox geplaatst om vertrouwd te raken met de omgeving. Nadat het model was vastgesteld, werden de ratten van elke groep, met uitzondering van de controlegroep, elke dag op tijd van 8.00 uur tot 20.00 uur op het kleine platform geplaatst voor slaapgebrek gedurende 21 opeenvolgende dagen.

Alle ratten hadden vrije toegang tot voedsel en water en bewogen zich vrij op het platform. De licht-donkercyclus bedroeg elke dag 12 uur.

1. 3. 3 Morris-waterdoolhofexperiment

Het Morris-waterdoolhof was verdeeld in 4 gebieden, gevuld met water, en het platform werd in het 4e kwadrant geplaatst. Het wateroppervlak bevond zich ongeveer 2 cm boven het platform. Eetbare melanine van voedselkwaliteit werd aan het water toegevoegd en de watertemperatuur werd op (25 ± 1) graden gehouden. (1) Positioneringsnavigatie-experiment: Het midden van elk gebied werd geselecteerd en de ratten werden voorzichtig in het water geplaatst. Ze mochten vrij rondlopen. De tijd die de ratten nodig hadden om het doelplatform binnen 60 seconden te vinden, werd geregistreerd. Ratten die het platform niet vonden, werden naar het platform geleid en bleven daar 20 seconden. De training werd gedurende 5 dagen voortgezet. (2) Ruimtelijke verkenningstest: Op de zesde dag werd het platform verwijderd en werden de ratten vanuit het midden van het tweede kwadrant tegen de muur in het water geplaatst. Het aantal keren dat de ratten het platform binnen 120 seconden passeerden en de tijd dat ze in het 4e kwadrant bleven, werden geregistreerd.

1. 3. 4 Openveldexperiment

Er werd een experimentele doos van 100 cm x 100 cm x 50 cm gebruikt en de bodem van de doos was verdeeld in 9 roosters. Elke groep ratten werd vooraf in de experimentele ruimte in het open veld geplaatst om zich gedurende 60 minuten aan te passen aan de binnenomgeving. Aan het begin van het experiment werden de testratten achtereenvolgens in vaste hoeken van de experimentele box in het open veld geplaatst en het aantal statijden, bewegingsafstand en statische tijd van de ratten binnen 5 minuten werd geregistreerd met behulp van gedragsanalysesoftware. Tijdens het experiment moest de omgeving stil zijn en tussen twee experimenten werd het experimentele apparaat respectievelijk met water en alcohol afgeveegd om te voorkomen dat de geur van de eerste rat het gedragsoordeel van de volgende rat zou beïnvloeden.

1. 3. 5 Enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)

Detectie van serum-MT-niveaus bij ratten. Ratten werden verdoofd door middel van intraperitoneale injectie en 5 ml bloed werd verzameld uit de abdominale aorta. Na 30 minuten wachten bij kamertemperatuur werd het bloed gecentrifugeerd om serum te verkrijgen. Aan elk putje werd 40 μl monsterverdunningsmiddel toegevoegd, en vervolgens werd 10 μl van het te testen monster toegevoegd. Na afdichting met een afdichtingsfilm werd de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden geïncubeerd. Vijf keer gewassen, werd 50 μl enzymlabelingsoplossing toegevoegd en de plaat werd afgesloten met een afdichtingsfilm en gedurende 30 minuten bij 37 graden geïncubeerd. Vijfmaal gewassen en vervolgens werden de kleurontwikkelende oplossing en de oplossing voor het beëindigen van de reactie achtereenvolgens toegevoegd. De OD-waarde van elk putje werd gemeten met een enzymlabeler bij een golflengte van 450 nm.

1. 3. 6 Nissl-kleuring

Uit elke groep werden drie ratten geselecteerd en hersenweefsel werd verwijderd door onthoofding en gefixeerd met een 4% polyoxyethyleenoplossing. Het weefsel werd gedehydrateerd, ondergedompeld in wasoplossing, ingebed en volgens conventionele methoden in plakjes gesneden. De plakjes werden bewaard met een dikte van 5 μm, gespoeld met PBS, gekleurd met 0.1% toluïdineblauw gedurende 0.5 uur, gedifferentieerd met 95% alcohol, gedehydrateerd met 100% alcohol, transparant gemaakt met xyleen en verzegeld met neutrale gom. De veranderingen in de morfologie en het aantal neuronen in het CA1-gebied van de hippocampus van de rat werden onder een microscoop waargenomen en er werden beelden verzameld.

1. 3. 7 Western blot-experiment

Uit elke groep werden vier ratten geselecteerd en de hippocampus werd geïsoleerd door onthoofding. Het hippocampusweefsel werd gemengd met RIP A-lysebuffer in een ijsbadomgeving en het weefsel werd gecentrifugeerd om het supernatant te verkrijgen. De eiwitconcentratie werd gedetecteerd met de BCA-methode. 20 µg eiwit werd toegevoegd met eiwitlaadbuffer voor elektroforese. Nadat de eiwitelektroforese was voltooid, werd het membraan overgebracht bij een constante stroom van 300 mA, geblokkeerd met 5% magere melkpoeder, het primaire antilichaam werd een nacht bij 4 graden geïncubeerd en het secundaire antilichaam werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Nadat de kleurontwikkelingsoplossing was gebruikt, werden de eiwitbanden statistisch geanalyseerd met behulp van een chemiluminescentie-beeldvormingsanalysesysteem.

1. 3. 8 RT-PCR-experiment

Uit elke groep werden drie ratten geselecteerd om hippocampusweefselhomogenaat te bereiden. Het totale RNA in de weefselvloeistof werd geëxtraheerd met de Trizol-methode en de concentratie werd gemeten. Een fastking cDNA-synthesekit werd gebruikt voor omgekeerde transcriptie, en een kwantitatieve fluorescentieamplificatiereactie werd uitgevoerd met behulp van een kwantitatieve fluorescentiekit om het relatieve expressieniveau van synaptisch-gerelateerd eiwit-mRNA te detecteren. De resultaten zijn geanalyseerd met behulp van 2-ΔΔCt. De primersequenties worden getoond in Tabel 1.

Tabel 1 RT-PCR-primersequenties

1.4 Statistische methoden

De gegevensresultaten die voldeden aan de normale verdeling werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (x ± s), en statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 9.5-software. Voor de vergelijking tussen meerdere steekproeven werd eenzijdige variantieanalyse gebruikt, en P < 0.05 gaf aan dat het verschil statistisch significant was.