Expressie van neuronaal stikstofoxidesynthase en renine in dysplastische nieren van jonge honden

ABSTRACT.

Renine enneuronale stikstofoxidesynthasein de nieren controleren derenine-angiotensineEntubuloglomerulaire feedbacksystemen. De huidige studie onderzocht de expressie van renine en neuronalestikstofoxidesynthasein dedysplastische nierenvan drie jonge honden. De renine-immuunreactiviteit, die voorkomt in de juxtaglomerulaire en tubulaire cellen van dysplastische nieren, verschilde niet van die in de normale nieren van jonge honden. Cellen met een hoge maculadichtheid in de normale nieren vertoonden neuronale stikstofoxidesynthase-immunoreactiviteit, maar die in de dysplastische nieren vertoonden geen duidelijke signalen. Deze observatie kan gecorreleerd zijn met de pathologische mechanismen van nierfalen bij jonge honden.

SLEUTELWOORDEN: chronische nierziekte, dysplastische nier, immunohistochemie, neuronale stikstofoxidesynthase, renine

Nierfalenkomt af en toe voor bij jonge honden. In dergelijke gevallen toont histologisch onderzoek vaak dysplastische nierlaesies aan. De pathofysiologische mechanismen die optreden in de dysplastische nieren van honden blijven echter onduidelijk. Onlangs hebben we de verzwakking van cyclo-oxygenase (COX)-2 aangetoond bij chronische nierziekten bij jonge honden met dysplastische nieren met behulp van immunohistochemische analyse [19].

Ondersteuning voor Cistanche-supplementenNierfunctiesupplement

COX-2 is een induceerbaar ontstekingsenzym dat essentieel is voor de normale nierontwikkeling in de foetale en neonatale stadia [12, 15]. Na de geboorte wordt COX-2 constitutief tot expressie gebracht in de nier en geconcentreerd in het beperkte gebied van de macula densa (MD) van de dikke opgaande ledematen [1, 4, 22]. De MD is een gespecialiseerd gebied grenzend aan de vasculaire pool van de glomerulus. Het controleert de reninesecretie en het tubuloglomerulaire feedbacksysteem (TGF). COX-2, tot expressie gebracht in MD-cellen, reguleert deze mechanismen [6, 8]. Naast COX-2 is bekend dat neuronale stikstofoxidesynthase (nNOS), dat ook tot expressie komt in MD-cellen, de belangrijkste regulator van het TGF-systeem is [3, 18]. Het is bekend dat deze twee moleculen, die tot co-expressie komen in MD, met elkaar interageren [2, 5, 9]. In de huidige studie onderzochten we de expressie van renine en nNOS in dysplastische nieren door middel van immunohistochemie om te bepalen of de verzwakking van COX-2 in dysplastische nieren de verstoring van het renine-angiotensinesysteem en TGF-systeem bij jonge honden induceert.

De in formaline gefixeerde paraffineblokken van dysplastische nieren van jonge honden (n=3), normale nieren van jonge honden (n=3) en normale nieren van volwassen honden (n=4) waren dezelfde als die gebruikt in onze vorige studie, waarin de klinische geschiedenis en weefselpreparatie eerder zijn beschreven [19]. Het onderzoek werd goedgekeurd door de Commissie voor Dierproeven van de Universiteit van Kagoshima, Japan (VM15020). Er werden coupes gemaakt met een dikte van 3- µm, en immunohistochemische analyse voor renine en nNOS werd uitgevoerd volgens de volgende protocollen: (1) deparaffinisatie; (2) antigeenwinning door microgolfverwarming in 10 mM citraatbuffer (pH 6,0) voor nNOS; (3) incubatie met 3% H2O2 gedurende 30 minuten; (4) blokkeren met 3% runderserumalbumine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) voor renine of 0,25% caseïne (Sigma-Aldrich) voor nNOS, verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing, gedurende 30 minuten; (5) incubatie gedurende de nacht bij 4 graden met een 1:3,000 verdunning van anti-recombinant renine polyklonaal antiserum van konijn (geleverd door Dr. Murakami, Universiteit van Tsukuba, Japan) of een 1:3,{{32 }} verdunning van konijnen-anti-nNOS polyklonaal antiserum (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, VS), in een blokkerende oplossing; (6) incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met een peroxidase-polymeer-geconjugeerd universeel antilichaam (anti-muis immunoglobuline (Ig) G en anti-konijn IgG; eenvoudige vlek MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) ; en (7) immunosignaaldetectie met behulp van het 3,3ʹ-diaminobenzidinesysteem (3,3ʹ-diaminobenzidinebuffertablet; Merck, Darmstadt, Duitsland). Voor de negatieve controlesecties werd normaal konijnen-IgG (Lab Vision, Fremont, CA, VS) gebruikt in plaats van het primaire antilichaam.

Fig. 1. Immunohistochemie voor renine in een dysplastische hondennier. A: Renine-positieve signalen werden waargenomen in de juxtaglomerulaire cellen nabij de vasculaire polen en enkele glomerulaire cellen (pijlen). Staf: 50 µm. B: Een ander gebied van de sectie wordt getoond in paneel A. Tubuli in het niet-geïdentificeerde nefronsegment vertonen renine-immunoreactiviteit. Staf: 50 µm.

Gerandomiseerde morfometrische analyse voor renine-immunoreactiviteit werd uitgevoerd volgens een eerder beschreven methode [20]. In het kort werd de renine-index gedefinieerd als de verhouding van het totale aantal renine-positieve arteriolen tot het totale aantal glomeruli en uitgedrukt per 100 glomeruli. Verschillen tussen de groepen werden geanalyseerd met behulp van Bonferroni's meervoudige vergelijkingsmethode met SPSS versie 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, VS).

Histopathologische diagnose werd uitgevoerd volgens de microscopische criteria van nierdysplasie bij honden door Picut en Lewis [14]. De histologiesecties van alle drie de gevallen vertoonden asynchrone differentiatie, wat duidt op de aanwezigheid van laesies met foetale/onvolgroeide glomeruli. Secundaire veranderingen van variabele ernst, zoals tubulaire schade, interstitiële fibrose en sclerotische glomeruli, werden waargenomen in de volwassen nierweefsels.

In de dysplastische nieren werden renine-immunoreactiviteitssignalen waargenomen in de juxtaglomerulaire cellen (JGC's) (Fig. 1A), en tubulaire cellen bevonden zich in de distale nefronen (Fig. 1B). In sommige glomeruli vertoonden enkele cellen renine-positieve signalen nabij de vasculaire polen (Fig. 1A). In de jonge controlenieren werden ook reninesignalen gedetecteerd in zowel JGC's als distale tubuli, inclusief de MD-cellen. In de volwassen controlenieren bleven renine-positieve signalen beperkt tot de JGC's. Statistisch gezien vertoonde het aantal renine-positieve gebieden in de dysplastische nieren geen significante verschillen met die in jonge en volwassen nieren.

Het is bekend dat stimulering van de renineproductie een rol speelt bij COX-2-signalering, en eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat de plasma-renineactiviteit en -concentratie afnamen na toediening van de COX-2-remmer of bij het uitschakelen van de COX. -2 gen [10, 11]. Omdat de dysplastische nieren die in de huidige studie werden onderzocht geen expressie van nier-COX-2 [19] vertoonden, werd aanvankelijk vermoed dat een vermindering van de immuunsignalen van renine in JGC's een mogelijke fysiologische afwijking in de dysplastische nieren was. De huidige immunohistochemische analyse kon deze hypothese echter niet bevestigen en er werd geen duidelijke vermindering van renine gesuggereerd in JGC's. Hoewel de fysiologische rol van het tubulaire renine niet eerder is opgehelderd, zou de renale verwerking van het natrium een ​​mogelijke rol van het tubulaire renine kunnen zijn, aangezien de versterking van de renine-expressie werd geïnduceerd in het distale nefron na het geven van een zoutarm dieet aan ratten. [16], en de dysplastische nieren van honden die in de huidige studie zijn onderzocht, zouden deze tubulaire functie kunnen hebben behouden.

COX-2 is ook belangrijk bij de regulatie van het TGF-systeem, wat belangrijk is voor het handhaven van de glomerulaire filtratiesnelheid. Een onderzoek bij ratten met behulp van de micropunctiemethode toonde de onderdrukking van de TGF-respons aan na behandeling met een COX-2-remmer [2]. De TGF-respons in dysplastische nieren kan worden verzwakt als gevolg van het ontbreken van renale COX-2-expressie. Er zijn echter eerder geen relevante bevindingen gerapporteerd. In de nieren komt nNOS tot expressie in de MD-cellen en helpt het TGF-systeem te reguleren [18].

In de huidige nNOS-analyse werden in alle gevallen geen duidelijke signalen gedetecteerd in de MD-regio's (Fig. 2). Deze vermindering van nNOS werd beschouwd als een etiopathogene gebeurtenis in de dysplastische nieren en niet als een verworven gebeurtenis na het nierfalen van de gevallen. Onze vorige studie met OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) ratten, als model voor diabetes type 2, toonde aan dat nNOS tot overexpressie kwam in de MD en rond tubulaire cellen in het latere stadium van diabetische nefropathie [21]. Bij de regulatie van het TGF-systeem is de functie van nNOS vergelijkbaar met en interactief met die van COX-2. Sommige onderzoeken hebben gesuggereerd dat nNOS zich stroomopwaarts van de signaalroute bevindt en de expressie van COX-2 stimuleert [5, 9]. Aan de andere kant hebben andere onderzoeken het tegenovergestelde gesuggereerd: COX-2 bevindt zich stroomopwaarts van de NOS [2, 13]. Ongeacht het verschil in de signaalroute kan een gebrek aan nNOS-immunosignalen in de MD-cellen de downregulatie van de renale COX-2-expressie in dysplastische nieren veroorzaken.