Fisetin verzwakt door lipopolysaccharide geïnduceerde ontstekingsreacties in macrofagen

Voor verdere informatie contacteertina.xiang@wecistanche.com

Verschillende onderzoeken hebben de werkzaamheid en veiligheid van polyfenolen voor de menselijke gezondheid gerapporteerd; de verificatie van hun werkzaamheid blijft echter onvoldoende. Het doel van deze studie was om te onderzoeken of fisetin, een van de flavonoïden die veel voorkomt in groenten en fruit, lipopolysaccharide-(LPS-)geïnduceerdeopruiendreacties in macrofagen. LPS verhoogde pro-inflammatoire mRNA-abundantie （MCP 1, IL-1ß en iNOS-maar werden onderdrukt door fisetin. De toename van stikstofmonoxide door LPS, een oxidatieve stressfactor, werd verzwakt door fisetine. Bovendien was LPS-versterkte fosforylering van door mitogeen geactiveerde proteïnekinase (ERK en JNK) verminderd. Ten slotte verzwakte fisetin de expressie of activiteit van uPA, uP AR, MMP-2 en MMP-9, die bekend staan ​​als geassocieerde factoren van rekrutering of infiltratie van macrofagen. Tot slot,fisetinis een veelbelovend therapeutisch middel voor macrofaag-gerelateerde ontstekingsziekten, zoals sepsis en atherosclerose.

Klik hier voor meer informatie.

1. Inleiding

Het therapeutische gebruik van natuurlijke componenten heeft de laatste 2 decennia meer aandacht gekregen. Op basis van hun grote werkzaamheid en lage toxiciteit zijn 40 procent van de door de FDA goedgekeurde therapeutische middelen natuurlijke componenten of hun derivaten [1]. Toxiciteit geassocieerd met andere medicijnen is met succes voorkomen door verschillende natuurlijke producten [2]. Het is dus erg belangrijk en belangrijk om van planten afkomstige natuurlijke verbindingen verder te onderzoeken.

Polyfenolenzijn de secundaire metabolieten van planten en zijn wijdverbreid aanwezig in voedingsmiddelen en dranken van plantaardige oorsprong, fruit, groenten, kruiden, thee en wijn. Hoewel ze niet als essentiële micronutriënten worden beschouwd, bewijzen verschillende soorten literatuur hun gunstige effecten op de menselijke gezondheid, vooral in diëten die gepaard gaan met een hoge consumptie van fruit en groenten [3-5]. Er zijn gedurende tientallen jaren talloze onderzoeken uitgevoerd naar de farmacologische effecten van polyfenolen, wat wijst op voordelen voor de gezondheid. Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat een paar polyfenolenontstekingsremmendeigendommen

[6-8].Bovendien hebben recente studies aangetoond dat verschillende soorten polyfenolen regulerende enzymen of transcriptiefactoren die betrokken zijn bij ontstekingen kunnen remmen [9].

Dieet beïnvloedt verschillende stadia van ontsteking en heeft een belangrijke invloed op verschillende ontstekingsziekten [10,11]. Ontsteking speelt een sleutelrol bij het ontstaan ​​van ziekten zoals diabetes, astma, hart- en vaatziekten en kanker [12]. Daarom kan het beheersen van ontstekingen deze ziekten voorkomen. Omdat macrofagen belangrijke ontstekingsmediatoren zijn, hebben ze verschillende functies bij weefselhomeostase en ontsteking. Middelen die hun functies effectief moduleren, zijn dus van grote klinische waarde, aangezien afwijkende activering van macrofagen schadelijke immuunresponsen kan veroorzaken. De huidige onderzoekstendens geeft duidelijk aan dat natuurlijke producten een van de belangrijkste bronnen van nieuwe medicijnen zijn [13].

Eén polyfenol, isetine (3,3',4',7-tetrahydroxyflavone), zit rijkelijk in aardbei, appel, tomaat, ui, sinaasappel, perzik, druif, kiwi, persimmon, thee en wijn [14] . Tot nu toe heeft fisetin sterke ontstekingsremmende [15-17],

antioxidant [18], antitumorigene [19,20, antiangiogene [21], antidiabetische [22], neuroprotectieve [23] en cardioprotectieve effecten [24] zowel in celcultuur als in diermodellen die relevant zijn voor menselijke ziekten. Hoewel fisetin veel fysiologische effecten heeft, wordt het effect ervan op macrofagen niet veel gerapporteerd.

In de huidige studie onderzochten we de gunstige effecten van fisetin op de ontstekingsreactie van macrofagen geactiveerd doorlipopolysacharide(LPS).

2. materialen en methoden

2.1. Isolatie van residente peritoneale macrofagen.

BALB/c-muizen werden verkregen van het Institute of Medical Science van de Universiteit van Tokyo en werden onderhouden in het Animal Resource Center van de Okayama University. Alle dierproeven werden uitgevoerd om te voldoen aan de NIH-richtlijnen (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals). Het experimentele protocol is goedgekeurd door de Ethics Review Committees for Animal Experimentation van de Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry, and Pharmaceutical Sciences (OKU-2018449). Alle muizen werden in een barrière gehouden en kregen een normaal laboratoriumdieet. Mannelijke en vrouwelijke BALB/c-muizen, 16 ± 4 weken oud, werden verdoofd met isofluraan en geëuthanaseerd via cervicale dislocatie. Macrofagen werden geoogst via peritoneale lavage met behulp van zoutoplossing (5 ml). De peritoneale lavage-oplossing werd 5 minuten bij 1500 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd gesuspendeerd in een beetje DMEM (SIGMA, Cat. No. D6046). Rode bloedcellen werden gelyseerd met behulp van een oplossing van ammoniumchloride. Het aantal macrofagen werd berekend met behulp van een hemocytometer, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in DMEM dat door warmte geïnactiveerd FBS (10 procent vv), penicilline (10 U/ml) en streptomycine (10 mg/ml) bevat, en uitgeplaat in 6-putjes platen (Corning Incorporated, Cat. No.3516) [25,26].

2.2. Celkweekomstandigheden.

Na nachtelijke serum-uithongering werden macrofagen geïncubeerd met geselecteerde concentraties van fisetin （10, 30 en 100 M; SIGMA, kat. nr. F4043) of drager gedurende 3 uur en gedurende een geschikte tijd geïncubeerd in de aanwezigheid of afwezigheid van LPS (10 ng/ml; SIGMA, Cat. nr. L4391). Vervolgens werden het medium en de cellen verzameld. Het medium werd gebruikt voor de stikstofoxide (NO)-test en gelatine-zymografie. Cellysaten werden gebruikt voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en western blotting.

2.3. Realtime polymerasekettingreactie.

mRNA's werden geëxtraheerd uit macrofagen met behulp van RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Cat. No.74104). Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd met behulp van een iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Cat. No. 1708891). qPCR werd uitgevoerd met een ABI Step One Real-Time PCR-systeem (Applied Biosystems, QuantStudio 3) met behulp van een Fast SYBR Green Real-time PCRMixture (Applied Biosystems, Cat. No.4385612) [27). Primers voor monocyt chemotactisch eiwit 1(MCP-1)(Takara Bio Inc, Cat. Nr. MA066003), interleukine 1 beta(IL-1)(Takara Bio Inc., Cat. Nr. MA025939), induceerbaar stikstofoxidesynthase (iNOS) (Takara Bio Inc, Cat. Nr. MA083369), matrix metalloproteïnase-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., Cat. Nr. MA127110), MMP-9 (Takara Bio Inc ., Cat. nr. MA031311) en 18S ribosomaal RNA (18S) (Takara Bio Inc., Cat. nr. MA050364) waren in de handel verkrijgbaar. Elk monster werd genormaliseerd naar waarden voor 18S-mRNA-expressie (AACT-methode) [27].

2.4. Stikstofoxidetest.

De afzonderlijke supernatanten van de celcultuur werden verzameld en 10 minuten gecentrifugeerd bij 14,000rpm bij 4 graden. Vervolgens werd het supernatant gebruikt voor de stikstofoxide (NO)-test. De NO-assay werd uitgevoerd zoals beschreven in de in de handel verkrijgbare kits (BioAssay Systems, Cat. No. D2NO-100). De QuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit van BioAssay Systems is een colorimetrische test voor de bepaling van de NO-productie na reductie van nitraat tot nitriet met behulp van de verbeterde Griess-methode.

2.5. Western-blotting.

Hele celeiwitten werden geëxtraheerd uit macrofagen met behulp van een lysisbuffer (Cell Signaling, Cat. No.9803). Elk monster werd op 10 procent SDS-PAGE aangebracht en overgebracht naar een polyvinylideenfluoridemembraan, onderworpen aan immunoblotting met primaire antilichamen (de fosforylering van het extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (p-ERK); Cell Signaling, Cat. No.9101, de fosforylering van c-Jun N-terminaal kinase (p-JINK); Cell Signaling, Cat. Nr. 9251, de urokinase plasminogeenactivator (uPA); Abcam, Cat. Nr.

ab20789, de urokinase plasminogeen activator en receptor (uPAR); R&D, Cat.No.AF534, en -actine; Sigma kat. nr. A5441)[28]. Membranen werden vervolgens geïncubeerd met geschikte secundaire antilichamen en immuuncomplexen werden gevisualiseerd op chemiluminescentie (Merck Millipore, Cat. nr. WBLUF0100, Cat. nr. WBLUC0100) en gekwantificeerd met behulp van een General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini) [29].

2.6. Gelatine zymografie.

Supernatanten van celculturen werden gescheiden onder niet-reducerende omstandigheden door SDS-PAGE (10 procent wt/vol) gepolymeriseerd in aanwezigheid van gelatine (0,1 procent wt/wt) om de activiteiten van MMP te evalueren. {4}}. Gels werden 60 min gewassen met Triton X-100 (2,5% vol/vo) en tweemaal 15 min met gedestilleerd water. Gels werden vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 37 graden Cin 50 mM Tris-buffer die calciumchloride (5 mM) pH 8,0 bevat. Na incubatie werden gels gekleurd met Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, Cat. No.{ {18}}) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door ontkleuren met Coomassie Brilliant Blue R-250 Ontkleuringsoplossing (Bio-Rad, Cat. No.161-0438) totdat er heldere banden verschenen. Gelbeelden werden gekwantificeerd met behulp van een General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); de ongekleurde, doorschijnende verteerde gebieden vertegenwoordigden gebieden van MMP-activiteit [30].

2.7. Statistieken.

Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, Californië, VS). Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. Statistische significantie tussen meerdere groepen werd beoordeeld door een- of tweerichtingsanalyse van variantie gevolgd door Holm-Sidak post hoc test of Student-Newman-Keuls post hoc test. pwaarde<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Resultaten

3.1. Fisetin verzwakte ontstekingsmediatoren in macrofagen gestimuleerd met LPS.

Omdat geactiveerde macrofagen pro-inflammatoire cytokines en inflammatoire mediatoren zoals NO[8] produceren, onderzochten we de effecten van fisetine op inflammatoire mediatoren in macrofagen gestimuleerd met LPS. Ten eerste, om te onderzoeken of fisetin het ontstekingsremmende effect op transcriptioneel niveau uitoefent, hebben we mRNA A-expressieniveaus bepaald van inflammatoire genen zoals MCP-1, IL-1 en iNOS (Figuur 1(a) ). Zoals verwacht werden de expressies van deze ontstekingsgenen op een dosisafhankelijke manier onderdrukt door fisetin. Om vervolgens te bevestigen of fisetin de ontstekingsreactie in macrofagen onderdrukt, evalueerden we het vermogen ervan om NO-productie in met LPS behandelde macrofagen te onderdrukken (Figuur 1 (b)). Zoals verwacht verminderde fisetin de productie van NO op een dosisafhankelijke manier.

3.2. Fisetin verminderde door mitogeen geactiveerde proteïnekinase in macrofagen gestimuleerd met LPS.

Omdat van fisetin werd gemeld dat het door mitogeen geactiveerde proteïnekinase (MAPK)-paden in verschillende celtypen remt [31, 32], onderzochten we de effecten van fisetin op MAPK's in macrofagen. Ten eerste werd activering van MAPK's geïnduceerd door LPS in macrofagen waargenomen (Figuur 2 (a)). De toename van p-ERK door LPS piekte 15 minuten na stimulatie, terwijl de toename van p-JNK door LPS een piek bereikte na 30 minuten. Zo werden in de daaropvolgende experimenten macrofagen gedurende 30 minuten gestimuleerd met LPS. Gelijktijdige behandeling met fisetine verminderde significant de door LPS geïnduceerde versterking van p-ERK en p-JNK (Figuur 2(b) en 2(c)).

3.3. Fisetin verminderde uPA en uPAR in macrofagen gestimuleerd met LPS.

Activering van macrofagen hangt nauw samen met de invasiviteit van cellen. Bovendien dragen uPA en uPAR in macrofagen bij aan de infiltratie van cellen. Zo werd het effect van fisetin op de expressie van uPA en uPAR onderzocht. LPS induceerde de eiwitovervloed van uPA (Figuur 3(a)) en uPAR (Figuur 3(b)). Gelijktijdige behandeling van fisetine verminderde de toename van uPA (Figuur 3(a)) en uPAR door LPS (Figuur 3(b)).

3.4. Fisetin verminderde MMP-2 en MMP-9 in macrofagen gestimuleerd met LPS.

Om het effect van fise-tin op MMP's op te helderen, hebben we bovendien MMP-2- en MMP-9-expressies onderzocht, de stroomafwaartse mediatoren van uPA/uPAR. Met betrekking tot het mRNA-niveau verhoogde LPS de expressie van MMP-2 en MMP-9 mRNA aanzienlijk, vergeleken met de vehikelbehandeling (Figuur 4(a)). Fisetin verminderde de versterking van deze genexpressies van MMP-2 of MMP9 geïnduceerd door LPS op een dosisafhankelijke manier (Figuur 4(a)). Bovendien werden de eiwitactiviteiten van MMP-9 geëvalueerd door middel van zymografie (Figuur 4(b)). De eiwitactiviteiten van MMP-9(92kDa) werden verhoogd door LPS-stimulatie, die werd verminderd door fisetine (Figuur 4(b)).

4. Discussie

We vonden een belangrijk effect van fisetin tegen ontstekingen in macrofagen. De huidige studie toonde aan dat fisetine de inductie van ontstekingscomponenten zoals MCP-1, IL-1, iNOS en NO, veroorzaakt door LPS in macrofagen, verzwakte. Bovendien onderdrukte fisetine de activering van MAPK en verzwakte het de door LPS geïnduceerde toename van uPA- en uPAR-expressie. Bovendien verzwakte fisetin de toename van de hoeveelheid mRNA van MMP-2 en MMP-9 en de activiteit van MMP-9.

Bij sepsis veroorzaakt door gramnegatieve infectie wordt LPS algemeen erkend als de veroorzaker van sepsis. In veel onderzoeken is LPS gebruikt als een model voor sepsis en ontsteking. Bovendien induceert chronische ontsteking vroege kanker door activering van ontstekingscellen en onjuiste productie van een pro-inflammatoire mediator zoals iNOS en transcriptiefactoren zoals de nucleaire transcriptiefactor kappa B (NF-xB) [33]. Daarnaast is ook gemeld dat oxidatieve stress wordt verminderd door de expressie van iNOS te verminderen [34]. Onze studie toonde aan dat fisetin effectief kan zijn bij de preventie en behandeling van sepsis en septische shock, vanwege het onderdrukkende effect op de overvloed aan pro-inflammatoire genen in mRNA en de productie van NO. In deze studie onderdrukte fisetin de NO-productie door de expressie van mRNA van het pro-inflammatoire gen (iNOS) te verminderen; daarom was het waarschijnlijk dat fisetin oxidatieve stress verzwakte. Bijgevolg ondersteunden deze resultaten de ontstekingsremmende, antitumorigene en antioxiderende effecten van fisetin.

Verschillende onderzoeken hebben gemeld dat LPS de fosforylering van MAPK's induceerde, waaronder ERK en JNK [35]. Bovendien is gemeld dat fisetine de migratie en invasie van menselijke cervicale cellen remt door de uPA-expressie te verlagen door MAPK te onderdrukken [36]. In macro -fagen zijn er weinig rapporten beschikbaar over het effect van fisetine op de expressie en activiteit van uPA en uPAR. Onze studie toonde voor het eerst aan dat fisetine de expressie van uPA en uPAR, geïnduceerd door LPS, onderdrukte door MAPK-signalering in macrofagen te onderdrukken, zoals eerder gerapporteerd in kankercellen.

MMP's zijn een familie van proteasen waarvan de expressie verband houdt met bepaalde processen, zoals ontwikkeling, fysiologie en pathologie. In het algemeen is MMP-9 erkend als een marker van verschillende ontstekingsziekten, zoals atherosclerose, artritis en systemische lupus erythematosus [37]. Bovendien was MMP-9 nauw geassocieerd met celmigratie [38,39]. Verschillende onderzoeken hebben in het bijzonder gerapporteerd dat MMP-2 en MMP-9 betrokken zijn bij atherogenese en een belangrijke rol spelen bij de stabilisatie van atherosclerotische plaques 40-42]. Op dit punt suggereren onze resultaten dat remmers van MMP-9 kan veelbelovend zijn als therapeutische benadering voor de stabilisatie van kwetsbare plaques. Bovendien hebben recente onderzoeken aangetoond dat wondgenezing in de huid wordt belemmerd door overmatige activering van MMP-9 [43]. Daarom werd gesuggereerd dat fisetin ook potentieel heeft als therapeutische benadering voor genezing in de huid. Toekomstige studies zullen nodig zijn om de details van de moleculaire mechanismen op te helderen.

Een recente trend in de farmaceutische industrie is het ontdekken van strategieën om de natuurlijke plant zelf als het nieuwe medicijn te ontwikkelen. Twee recente dierstudies hebben inderdaad aangetoond dat LPS-geïnduceerde acute longontsteking en collageen-geïnduceerde artritis werden verbeterd door fisetin behandeling |32,44. Een ander ex vivo onderzoek toonde ook aan dat fisetin in staat was om LPS-geïnduceerde cytokine-afgifte door leukocyten van patiënten met chronische obstructieve longziekte of type 2 diabetes te verminderen [45]. Er zijn veel immunosuppressiva ontwikkeld om ontstekings- en auto-immuunziekten te verminderen[46-50]; niettemin vertonen de meeste verbindingen significante bijwerkingen. Omdat polyfenolen vaak aanwezig zijn in fruit en groenten in de voeding, zijn ze vermoedelijk veiliger immunosuppressiva [51, 52]. Groenten en fruit bevatten een breed scala aan fytochemicaliën, waaronder sesquiterpeenlactonen, terpenoïden, polysachariden en fenolverbindingen. Onze resultaten, die de ontstekingsremmende, antitumorigene en antioxiderende effecten van fisetin aantonen, geven sterk aan dat het als een nieuw medicijn kan worden ontwikkeld. Hoewel fisetin een veelbelovende kandidaat is voor immunotherapie, moet het potentieel van natuurlijke producten die fisetin bevatten als therapeutisch middel voor een bepaalde ziekte verder worden geverifieerd in de klinische setting.

5. Conclusies

De huidige studie toonde aan dat fisetin de toename vanopruiendgenen (MCP-1, IL-1b en iNOS), de productie van NO en de fosforylering van MAPK, uPA, uPAR en MMP's, geïnduceerd door LPS in macrofagen. Deze resultaten suggereerden dat fisetin een therapeutisch middel kan zijn voor verschillende macrofaaggerelateerde ziekten.