Bepaling van vijf componenten in Rehmannia Glutinosa en oprichting van HPLC-vingerafdruk

Abstract:De bepalingsmethode van de inhoud van vijf componenten inRehmannia glutinosa, namelijk,rehmannoside D, leonurine,echinacoside,cistancheside AEnverbascoside, werd opgericht, en de hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)-vingerafdruk van Rehmannia glutinosa werd opgericht om een ​​wetenschappelijke basis te bieden voor de kwaliteitscontrole van Rehmannia glutinosa. De Shiseido CAPCELL PAK C18-kolom werd gebruikt, met acetonitril-0,1% mierenzuuroplossing als de mobiele fase, gradiëntelutie, kolomtemperatuur van 30 graad, bepaling van variabele golflengte en stroomsnelheid van 1,0 ml/min. De HPLC-vingerafdruk van Rehmannia glutinosa werd geanalyseerd door de "Chinese geneeskunde chromatografisch vingerafdruk-gelijkenisevaluatiesysteem (2012 Edition)" software to evaluate its quality consistency. The results showed that according to the established content determination method, the five components had a good linear relationship within their respective concentration ranges (R2>{{0}}.999 0), de RSD van precisietest, herhaalbaarheidstest en stabiliteitstest was 0.12%~1.58%, en het gemiddelde monsterherstelpercentage was 96,5% ~98,6%; de gevestigde Rehmannia glutinosa HPLC-vingerafdruk identificeerde 23 gemeenschappelijke pieken, en de gelijkenis tussen het Rehmannia glutinosa-monster en de controle-vingerafdruk was 0.904~0,950. De resultaten suggereren dat de gevestigde methode voor het bepalen van het gehalte en de HPLC-vingerafdruk geschikt zijn voor de evaluatie van de kwaliteit van Rehmannia glutinosa en de identificatie van rauwe Rehmannia glutinosa en gekookte Rehmannia glutinosa, met hoge nauwkeurigheid en goede reproduceerbaarheid, en technische ondersteuning kunnen bieden voor de kwaliteitscontrole van Geneeskrachtige materialen voor Rehmannia glutinosa.

Trefwoorden:Rehmannia glutinosa; inhoudsbepaling; vingerafdruk; kwaliteitsevaluatie

NIEUWE KRUIDCISTACHE METECHINACOSIDE,CISTANCHESIDE AENVERBASCOSIDE

Rehmannia glutinosais de verse of gedroogde wortelknol van de Scrophulariaceae-plant Rehmannia glutinosa Libosch. Vanwege verschillende verwerkingsmethoden wordt het voornamelijk verdeeld in verse rehmannia, rauwe rehmannia en gekookte rehmannia [1-2]. De belangrijkste productiegebieden zijn Henan, Shanxi, Shaanxi, enz. Land. Onder hen heeft rauwe rehmannia glutinosa de effecten van het opruimen van hitte en het afkoelen van bloed, het voeden van yin en het bevorderen van de vochtproductie, en wordt voornamelijk gebruikt om hitte in het bloed, warme gifstoffen en vlekken, enz. te behandelen; gekookte rehmannia glutinosa heeft de effecten van het voeden van bloed en yin, het aanvullen van essentie en het aanvullen van merg, en wordt voornamelijk gebruikt om bloedtekorten, chlorose, enz. te behandelen. Hartkloppingen, rusteloosheid, enz.[1-2]. De twee hebben verschillende eigenschappen en smaken, maar behoren beide tot de lever- en niermeridianen. Rehmannia glutinosa bevat complexe chemische componenten, waaronder voornamelijk iridoïden, iononen, fenylethanolglycosiden, flavonoïden, enz. [3-5].

Nadat Rehmannia glutinosa via verschillende verwerkingsmethoden is verwerkt, variëren de soorten, inhoud en verhoudingen van de chemische componenten in elk verwerkt product sterk, wat resulteert in aanzienlijke verschillen in de farmacologische activiteit ervan [6-10]. volgens

Gerelateerde onderzoeken [11-12] laten zien dat tijdens het proces waarin Rehmannia glutinosa verandert van "rauw" naar "gekookt", de inhoud van chemische componenten zoals catalpol, moederkruid, stachyose en aminozuren allemaal aanzienlijk daalde, en dat de inhoud van fructose, 5-hydroxymethylfurfural, enz. De gehalten aan isorebascoside, enz. waren aanzienlijk verhoogd. Momenteel wordt bij de kwaliteitscontrole van rauwe en gekookte rehmannia glutinosa voornamelijk gebruik gemaakt van de inhoud van catalpol en rehmanniaside D als evaluatie-indicatoren. De indicatoren van het evaluatiesysteem zijn relatief enkelvoudig, waardoor het moeilijk is om de kwaliteit van rehmannia glutinosa volledig te controleren. Bovendien hebben onderzoeken aangetoond dat de inhoud van rehmannia glutinosa D vóór en na verwerking verandert. Het is klein en heeft een slechte specificiteit bij het karakteriseren van de samenstellingsveranderingen na verwerking en de mate van verwerking [12-13].

Om de kwaliteit van Rehmannia glutinosa uitgebreider te kunnen beoordelen, werd in dit onderzoek daarom de relatie tussen rehmanniaside D en Yimu in Rehmannia glutinosa vastgesteld.

Bepalingsmethoden voor het gehalte van vijf veel voorkomende componenten, waaronder glucoside, echinaceaside, cistancheoside A en verbascoside, en een HPLC-vingerafdruk van Rehmannia glutinosa opgesteld om het gehalte van de belangrijkste componenten in Rehmannia glutinosa uit verschillende productiegebieden en voor en na verwerking te analyseren. om informatie te verstrekken voor de kwaliteitscontrole van Rehmannia glutinosa. Technische ondersteuning.

Instrumenten, reagentia en testmedicijnen

Agilent 1260 hoogwaardige vloeistofchromatograaf (detector is diode-array); elektronische analytische balans met variabel bereik (METTLER TOLEDO); digitale ultrasone reiniger (Shanghai Ultrasonic Instrument Factory, KH-500DE). Methanol (Sinopharm Group) is van analytische kwaliteit; acetonitril (Merck) is van chromatografische kwaliteit; water is Watsons-flessenwater. Rehmannia glutinosa D referentiestof (partijnummer RFSD8401909016, zuiverheid 98,0%), leonurus glycoside referentiestof (partijnummer RFS-Y22002208010, zuiverheid 98,0%) en cistancheside A referentiestof (partij nummer RFS-R05002009014, zuiverheid 96,0%) werden allemaal gekocht bij Chengdu Ruifensidedan Biotechnology Co., Ltd.; De referentiestof echinacoside (partijnummer 111670-201907, zuiverheid 91,8%) en de referentiestof verbascoside (partijnummer 11530-201914, zuiverheid 95,2%) werden allemaal gekocht bij de Chinese Food and Drug Inspection Institutes. Rehmannia-monsters (SX1~SX4, HN1 en HN2) werden verzameld uit verschillende productiegebieden (zie Tabel 1), waarvan SX4 en HN2 werden gestoomd door respectievelijk SX1 en HN1, en SX2 en SX3 werden verzameld uit hetzelfde productiegebied. Alle monsters werden als authentiek geïdentificeerd door Song Pingshun, hoofdbeoefenaar van de Chinese geneeskunde van het Gansu Provincial Institute of Drug Control.

Tabel 1 Informatie over sperma Rehmanniae-monsters

2.1 Chromatografische omstandigheden

De Shiseido CAPCELL PAK C18-kolom (250.0 mm x 4,6 mm, 5 μm) werd gebruikt, acetonitril werd gebruikt als mobiele fase A en 0,1% mierenzuuroplossing werd gebruikt als mobiele fase B gradiënt-elutieomstandigheden waren: 0-3 min, 1%A; 3-9 min, 1%A→5%A; 9-24 min, 5%A→35%A; 24-35 min, 35%A→65%A; 35-40 min, 65%A→90%A. Detectie met variabele golflengte (0-24 min, 203 nm; 24-40 min, 330 nm). Het injectievolume was 15 μl van de referentieoplossing en 20 μl van de monsteroplossing.

2.2 Voorbereiding van de oplossing

2.2.1 Bereiding van referentieoplossing

Neem de juiste hoeveelheden van de bovenstaande vijf referentiestoffen en voeg 70% methanol toe om een ​​gemengde referentieoplossing te bereiden met een massaconcentratie van 0,4 mg/ml.

2.2.2 Bereiding van de testoplossing

Weeg ongeveer 1,0 g Rehmannia-poeder (door zeef nr. 2 gevoerd), weeg nauwkeurig, plaats het in een erlenmeyer met stop, voeg nauwkeurig 25 ml 70% methanol toe, sluit af, weeg, behandel ultrasoon (power 300 W, frequentie 50 kHz) gedurende 30 minuten, laat het afkoelen tot kamertemperatuur, weeg opnieuw, vul de verloren massa aan met 70% methanol, filtreer en neem het filtraat.

2.3 Methodologisch onderzoek

2.3.1 Specificiteitsonderzoek

Neem de gemengde referentieoplossing onder "2.2.1" en de testoplossing (monster SX1) onder "2.2.2", injecteer en meet volgens de chromatografische omstandigheden onder "2.1". De resultaten laten zien dat het chromatogram van het Rehmannia-monster een chromatografische piek vertoont met dezelfde retentietijd als de referentiestandaarden van Rehmannia glutinosa D, Leonurin, Echinacoside, Cistanche deserticola A en Verbascoside (zie figuur 1), wat aangeeft dat deze methode sterke specificiteit.

2.3.2 Lineair relatieonderzoek

Voeg 70% methanol toe aan de gemengde referentieoplossing, verdun respectievelijk 5 keer, 10 keer, 25 keer, 50 keer, 100 keer en 250 keer, en injecteer en meet volgens de chromatografische omstandigheden onder "2.1". De standaardcurven werden getekend met de massaconcentratie van elke referentie als de horizontale as (x) en het overeenkomstige chromatografische piekgebied als de verticale as (y). De resultaten worden weergegeven in Tabel 2, wat aangeeft dat elke component een goed lineair verband heeft binnen het overeenkomstige massaconcentratiebereik.

1.rehmannioside D; 2. leonuride; 3. echinacoside; 4. castanoside A;5. acteoside

Figuur 1 Chromatogrammen van specificiteitsonderzoek

Tabel 2 Lineair verband tussen 5 componenten in sperma Rehmanniae

2.3.3 Precisieonderzoek

Neem de testoplossing (monster SX1) onder "2.2.2" en voer de injectietest uit volgens de chromatografische omstandigheden onder "2.1". Injecteer het monster zes keer continu, noteer het piekoppervlak van elke component en bereken het piekoppervlak RSD van rehmannia glutinosa D, moederkruidglycoside, echinacea-glycoside, cistanche-glycoside A en verbascoside in het testmonster als 0. 46%, 0.12%, 0.85%, 0.48% en 0.82%, respectievelijk, wat aangeeft dat het instrument een goede precisie heeft.

2.3.4 Herhaalbaarheidsonderzoek

Zes monsters van hetzelfde Rehmannia-wortelmonster (SX1) werden parallel bereid volgens de methode in "2.2.2" en geïnjecteerd en bepaald volgens de chromatografische omstandigheden in "2.1". De RSD's van de inhoud van rehmannia-wortelglycoside D, motherwort-glycoside, echinacea-glycoside, cistanche-glycoside A en verbascoside in de zes monsters waren 0,46%, 0,69%, 1,42%, {{ 12}},48% en 1,58% respectievelijk, wat aangeeft dat de methode een goede herhaalbaarheid heeft.

2.3.5 Stabiliteitsstudie

Neem de testoplossing (monster SX1) onder "2.2.2" en injecteer en meet volgens de chromatografische omstandigheden onder "2.1" om 0 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur, 8 uur, 1{{ 15}} uur, 12 uur, 18 uur en 24 uur, respectievelijk. De RSD van de piekgebieden van rehmannia glutinosa D, motherwort-glycoside, echinacoside, cistanche-glycoside A en verbascoside waren 0,94%, 1.04%, 0,73% respectievelijk 0,83% en 0,71%, wat aangeeft dat de testoplossing binnen 24 uur een goede stabiliteit heeft.

2.3.6 Herstelpercentage monster

{{0}},5 g Rehmannia-wortelmonster (SX1) met een bekende inhoud van 5 componenten werd nauwkeurig afgewogen in een erlenmeyer met stop, en 6 parallelle porties werden toegevoegd, en 5 referentieoplossingen van bepaalde concentraties werden toegevoegd respectievelijk. De monsters werden bereid volgens de methode onder "2.2.2", en de monsters werden geïnjecteerd en gemeten volgens de chromatografische omstandigheden onder "2.1". Het herstelpercentage werd berekend en de resultaten worden weergegeven in Tabel 3. Het gemiddelde monsterherstelpercentage van elke component was 96,5% ~ 98,6%, en de RSD was 0,73% ~ 1,52%, wat aangeeft dat de methode een goede nauwkeurigheid heeft.