Gossypitrine, een natuurlijk voorkomende flavonoïde, verzwakt ijzer-geïnduceerde neuronale en mitochondriale schade deel 3

Neem dan contact op metoscar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

4. Materialen en methoden 4.1.Reagentia

Alle reagentia werden verkregen van Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA). Stamoplossingen van Gos werden bereid in DMSO en toegevoegd aan de celculturen of mitochondriale preparaten bij 1/1000 (o/o) verdunningen.

Klik hier voor meer informatie

4.2.Plantaardig materiaal

Plantaardig materiaal (bloemen) van Talipariti elatum (Sw.)(Syn. Hisbiscus elatus Sw.) (Malvaceae) werden in maart 2020 verzameld uit de omliggende gebieden van het Center for Research and Biological Evaluation, Institute of Pharmaceutical and Food Sciences, La Lisa, Havana, Cuba. Ze werden geauthenticeerd door specialisten van de herbaria van de Universiteit van Camagüey "Ignacio Agramonte Loynaz", waar voucherspecimens werden gedeponeerd: G. Pardo., HPC-12 520 (HIPC).

Cistanche kan de immuniteit verbeteren

4.3. Extract en monstervoorbereiding

Deethanolischextracten werden bereid uit de rode bloemen van Telatum zoals eerder gemeld [29]. Na rotoevaporatie werden vaste stoffen gezuiverd door middel van herkristallisatieprocedures[29]. De geïsoleerde verbindingen werden gekenmerkt door middel van 1D 'H(400 MHz) en 13C (100 MHz) NMR. NMR-gegevensverwerking werd uitgevoerd met de MestReNova-softwareversie 6.1.0-6224 voor Windows (aanvullende materialen, figuren S1-S3). NMR-gegevens verzameld van Gos werden vergeleken met eerdere resultaten [56].

4.4. UV/Vis- en IR-spectroscopisch onderzoek

UV/Vis spectra werden uitgevoerd in kwarts cuvetten van 10 mm optische padlengte en absorptie werd geregistreerd in een UV-VisspectrofotometerUltrospec 2100 Pro van Amersham BioSci (Little Chalfont, UK) gekoppeld aan een computer met Wave Scan Software (SWIFT I, 1.2) bij kamertemperatuur. De interactie tussen Gos en ferro-ionen werd gemeten door de veranderingen in het UV/Vis-spectrum te monitoren. Job's methode werd gebruikt om de stoichiometrische verhouding tussen Gos en het Fe(II) ion te bepalen. De stamoplossingen van Gos en Fe(lI) werden dagelijks bereid in respectievelijk methanol- en fosfaatbuffer. De IR-spectra werden geregistreerd op een JASCO FI /IR-440-spectrometer over het bereik van 4000-400 cm-I, met behulp van kaliumbromidekorrels om de monsters voor te bereiden.

4.5. Celculturen

MuishippocampusHT-22-cellen (ATCC) werden gekweekt in een DMEM-medium aangevuld met 10% FCS, L-glutamine (1 mM) en penicilline / streptomycine (1%), en gehandhaafd op 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2-incubator. De cellen (2×104 cel/put) werden gezaaid in 96-putplaten (Nunc, Roskilde, Denemarken), in 200 μL kweekmedium gedurende 24 uur bij 37C.

4.6.Inductie van celoxidatieschade en behandeling met Gos

De neuroprotectieve werking van Gos (0,001-100 μM) werd getest op HT-22 door middel van co-incubatie gedurende 24 uur met Gos of Trolox (500 μM), FeCl2 (100μM) en citraat (1 mM). Na 24 uur werd het celsupernatant verwijderd en werd de levensvatbaarheid van de cel gemeten met de [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide] (MTT)colorimetrische assay.

4.7. Bepaling van de levensvatbaarheid van cellen

Na de behandelingen werden cellen (2× 104) geïncubeerd met 10 uM MTT gedurende 3 uur bij 37C. Het gekleurde MTT-derivaat werd vervolgens opgelost in 50μL DMSO en de absorptie werd geteld bij 570 nm op een microplaatlezer (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Duitsland). De levensvatbaarheid van cellen wordt uitgedrukt als een percentage tegen controle van onbehandelde cellen.

4.8.Mitochondriaal membraanpotentiaal (△Y)Test in HT-22-cellen

Mitochondrialemembraanpotentiaal werd beoordeeld op basis van celretentie van de fluorescerende kationische sonde rhodamine 123 [57,58]. Na 2 uur ijzer/ascorbaatletsel bij afwezigheid (controle) of aanwezigheid van Gos (0,001-100 μM) of Trolox(500 μM) werden de neuronale cellen (2×10*) 10 min geïncubeerd met 1 μM rhodamine 123. Na centrifugeren en resuspensie in 1 ml van 0,1% Triton X-100 werd de probeconcentratie in het supernatant bepaald met behulp van een microplaatlezer (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Duitsland) bij het 505/535 nm excitatie/emissie golflengtepaar. Gegevens worden uitgedrukt in percentages ten opzichte van de controle van onbehandelde cellen.

4.9.ATP-test

Cellulaire ATP werd bepaald door het firefly luciferin/luciferase assay systeem [59] onder dezelfde omstandigheden als AY. Bioluminescentie werd gemeten met een Sigma-Aldrich-testkit volgens de instructies van de fabrikant, met behulp van de luminescentie-optie van de microplaatlezer (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Duitsland).

4.10.Dieren

Mannelijke Wistar-ratten (200 g) werden verkregen van het Centrum voor de Productie van Laboratoriumdieren (CENPALAB volgens het Spaanse acroniem Havana, Cuba) en werden gedurende 1 week in de dierenverzorgingsfaciliteit gehuisvest voorafgaand aan experimenten in een temperatuurgecontroleerde omgeving (22-24 ° C), met een 12-uurs licht / donkercyclus en met toegang tot voedsel en water ad libitum.

4.11.Mitochondriale isolatie

De mitochondriën van de voorhersenen van ratten werden geïsoleerd door differentiële centrifugatie zoals eerder beschreven [60]. Digitonine 10%, werd gebruikt om synaptosomen te verstoren en een mengsel van niet-synaptosomale plus synaptosomale mitochondriën te produceren. De hele procedure werd uitgevoerd bij 4°C. De ademhalingscontroleverhouding (toestand 3/toestand 4 ademhalingsfrequentie) lag altijd in het bereik van 4,5 tot 6,0, gemeten met 5 mM succinaat als substraat.

4.12. Mitochondriale assays voor continue monitoring

De mitochondriale membraanpotentiaal werd spectrofluorimetrisch bepaald met behulp van 10 μM safranine O als sonde 【58,61】 in een microplaatlezer (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Duitsland) bij 495/586 nm excitatie/emissiegolflengten; deze testen werden uitgevoerd in aanwezigheid van 0,1 mM EGTA en 2 mM K, HPOA. Mitochondriale zwelling werd spectrofotometrisch geschat op basis van de afname van de schijnbare absorptie bij 540 nm. Voor de testen werden mitochondriën geactiveerd met 5 mM kaliumsuccinaat (plus 2,5 uM rotenon) in een standaardmedium bestaande uit 125 mM sucrose, 65 mM KC en 10 mM HEPES-KOH, pH 7,4, bij 30 °C.

4.13.Lipide peroxidatie assays

Lipideperoxidatie werd geschat op basis van malondialdehyde (MDA) generatie [28,62]. Mitochondriën (1 mg / ml) werden blootgesteld aan 4 mM tert-butylhydroperoxide of 50uM Fe (II) plus 1 mM natriumcitraat bij 37 °CC.MDA-concentratie werd berekend met behulp van de extinc-tie coëfficiënt (c = 1,56×105 M-1.cm-1).

4.14. Bepaling van de Fe(II)-concentratie

De concentratie van Fe(II.I) werd bepaald in 10 mM fosfaatbuffer pH 6,5(2 ml)door de vorming van een rood complex met 1,10-fenanthroline (5 mM), zoals eerder beschreven [24,28].

4.15.Bewaking van het zuurstofverbruik

Het verbruik van O, gerelateerd aan Fe(II.I)-oxidatie werd gemeten met een Clark-type elektrode (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, UK) in een glazen kamer van 1,3 ml uitgerust met een magneetroerder, bij 30°C. De snelheid van zuurstofverbruik (ROC) werd uitgedrukt als nmol O2/ml per minuut.

4.16.2-Deoxyribose oxidatie Assaly

De vorming van hydroxyl("OH") radicalen werd geschat door de 2-deoxyribose afbraak tot MDA te volgen, die werd berekend op basis van de extinctiecoëfficiënt (e=1,56×10° M-1·cm-) zoals eerder gemeld [26,27].

4.17. Gos-Fe(II) Complexen Detectie

Fe(II.I)(FeCl,0,4-1,6 μM)werd toegevoegd aan 2 ml(10 mM)fosfaatbuffer(pH 6,5)met 2 mM citraat en 1,6 μM Gos. Een golflengtescan van 200-600 nm werd uitgevoerd in een Hitachi 2001 spectrofotometer (Hitachi, Tokyo), bij 28°C.

4.18. Statistische analyse

GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) werd gebruikt. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een eenrichtings-ANOVA, gevolgd door een Student-Newman-Keuls posthoc-test voor paargewijze vergelijkingen. Resultaten met p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Aanvullende materialen: Het volgende is online beschikbaar. Figuur S1:lH-NMR(400 MHz)spectrum van gossypitrine in DMSO-do, Figuur S2:13C-NMR(101 MHz)spectrum van gossypitrine in DMSO-d, Figuur S3: HSQCspectrum van gossypitrine in DMSO-dg. Tabel S1:'H (400 MHz) en 13C (100 MHz) gegevens van gossypitrine ten opzichte van het vorige rapport.

Bijdragen van de auteur:Conceptualisatie, G.LP.-A.; methodologie, M.A.B.-V., R.F.D., Y.M.-P.en G.L.P.-A.; validatie, M.A.B.-V., J.M.-P., Y.M.-P, en R.F.D.; formele analyse, Y.M-P, J.M.-P, R.F.-A. en G.L.P-A.; onderzoek, M.A.B.-V, A.A.-L., D.A.-A., Y.M.-P., R.F.D.en G.L.P-A.; Data curation, M.A.B.-V.YM.-P.J.M.-P.en R.F-A.; schrijven—originele conceptvoorbereiding, M.A.B.-V.; schrijven— review en redactie, IM.-P, R.F-A., Y.M.-P en G.L.P.-A.; visualisatie, Y.M.-P., en G.L.P-A.; supervisie, G.L.P.-A.; financieringsverwerving, G.L.P.-A.Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.

Financiering: Dit onderzoek werd gefinancierd door VLIR (België); subsidienummer CU2018TEA457A103, en door Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Cuba); subsidienummer PN223LH010-035. De APC werd gefinancierd door VLIR (België); subsidienummer CU2018TEA457A103.

Verklaring van de Institutionele Toetsingscommissie:De studie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Institutionele Ethische Commissie van het Institute of Pharmaceutical and Foods Sciences, Universiteit van Havana, Cuba (Protocolcode IFAL-CEI 087-2019, oktober 2019).

Verklaring van geïnformeerde toestemming: Niet van toepassing. Verklaring inzake gegevensbeschikbaarheid: Niet van toepassing.

Bevestigingen:Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR)-Belgium/Ministerio de Educacion Superior (MES)-Cuba Project CU2018TEA457A103, dat ook de artikelverwerkingskosten dekte, en door het project PN223LH010-035 van "Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Cuba), Programa de Ciencias Basicas y Naturales". Belangenconflicten: De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Beschikbaarheid van monsters: Monsters van de verbindingen zijn verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.