Abrus Precatorius-bladextract keert door alloxan/nicotinamide geïnduceerde diabetes mellitus bij ratten om via hormonale (insuline, GLP-1 en glucagon) en enzymatische (-amylase/-glucosidase) modulatie Deel 1

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

Achtergrond

Abrus precatorius wordt gebruikt in de volksgeneeskunde in Afro-Aziatische regio's van de wereld. Eerder werden glucoseverlagende en pancreasbeschermende effecten van Abrus precatorius-bladextract (APLE) experimenteel bevestigd bij STZ/nicotinamide-geïnduceerde diabetische ratten; het onderliggende mechanisme van het antidiabetische effect en de pancreasbescherming bleef echter onbekend. Doelstelling. Deze studie verhelderde antidiabetische mechanismen en pancreasbeschermende effecten van APLE bij diabetische ratten. Materialen en methodes. APLE werd bereid met de ethanol/Soxhlet-extractiemethode. Het totaal aan fenolen en flavonoïden werd calorimetrisch gekwantificeerd na de initiële fytochemische screening. Diabetes mellitus (DM) werd vastgesteld bij volwassen Sprague-Dawley-ratten (met een gewicht van 120-180 g) van beide geslachten door dagelijkse opeenvolgende injectie van nicotinamide (48 mg/kg; ip) enAlloxaan(120 mg/kg; ip) over een periode van 7 dagen. Behalve voor controleratten die een nuchtere bloedglucose (FBG) van 4,60 mmol/L hadden, ratten met een stabiele VBG (16-21 mmol/L) 7 dagenpost-nicotinamide/Alloxaaninjectie werden als diabetisch beschouwd en werden willekeurig opnieuw toegewezen aan een van de volgende groepen (model, APLE (respectievelijk 100, 200 en 400 mg/kg; PO) en metformine (300 mg/kg; PO)) en werden gedurende 18 dagen dagelijks behandeld . Lichaamsgewicht en FBG werden gedurende 18 dagen elke 72 uur gemeten. Op dag 18 hebben ratten onder diep geofferdanesthesie; organen (nier, lever, pancreas en milt) werden geïsoleerd en gewogen. Bloed werd verzameld voor schatting van seruminsuline, glucagon en (LP-1 met behulp van een rat-specifieke ELSA-kit.' De pancreas werd bewerkt, in coupes gesneden en H&E-gekleurd voor histologisch onderzoek. Effect van APLE op deenzymatischactiviteit van alfa (a)-amylase en -glucosidase werd beoordeeld. Antioxidant en vrije radicalen wegvangende eigenschappen van APLE werden beoordeeld met behulp van standaardmethoden. Resultaten. APLE verlaagde dosisafhankelijk de initiële FBG met 68,67 procent, 31,07 procent en 4,39 procent vergeleken met model (4,34 procent) en metformine (43,63 procent). Behandeling met APLE (100 mg/kg) herstelde het gewichtsverlies ten opzichte van het model. APLE verhoogde seruminsuline en GLP-1 maar verlaagde serumglucagon ten opzichte van het model. APLE verhoogde zowel het aantal als de mediane dwarsdoorsnede (×10 graden um') van pancreaseilandjes in vergelijking met dat van het model. APLE produceerde een concentratieafhankelijke remming van -amylase en -glucosidase ten opzichte van acarbose. APLE-concentratie-afhankelijke wegvangen DPPH- en stikstofmonoxide (NO)-radicalen en toonden een verhoogde ferri-reducerende antioxidantcapaciteit (FRAC) aan ten opzichte van de normen. Conclusie. Het antidiabetische effect van APLE wordt gemedieerd door modulatie van insuline en GLP-1 omgekeerd met glucagon, niet-competitieve remming van c-amylase en -glucosidase, opruiming van vrije radicalen en herstel van beschadigde/necro-apoptose pancreascellen.

Klik hier om meer te weten

1. Inleiding

Diabetes mellitus (DM) is een van de metabole syndromen die worden gekenmerkt door chronische hyperglykemie die culmineert in een ontregeld glucosemetabolisme secundair aan defecten in de pancreascelfunctie [1]. Pathologisch gezien is DM een product van fouten in het glucosemetabolisme als gevolg van defecten in de pancreascelfunctie die ofwel insuline-insufficiëntie (type 1 DM) of insulineresistentie (type 2 DM) veroorzaken. Veelvoorkomende symptomen van DM zijn polyfagie, polydipsie, wazig zien, chronisch verlies van lichaamsgewicht, gastroparese en polyurie [2]. Na verloop van tijd verhoogt onopgeloste hyperglykemie het risico op microvasculaire complicaties van DM, zoals diabetische nefropathie, diabetische retinopathie en diabetische neuropathie [2]. Deze complicaties treden op als gevolg van uitgebreide oxidatieve stress en lipidenperoxidatiedie de bijproducten zijn van reacties tussen glucose en biologische moleculen [3]. Uitgebreide glycosylering van biologische moleculen zoals DNA, eiwitten en lipiden leidt tot het genereren van onstabiele biochemische tussenproducten die dienen als bronnen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en stikstofsoorten (RNS). ROS en RNS zijn de belangrijkste aanjagers van oxidatieve en peroxidatieve reacties in verschillende cellen en weefsels [3].

Epidemiologisch is gemeld dat DM meer dan 387 miljoen mensen wereldwijd treft [4]. Deze voorlopige schatting zal naar verwachting toenemen tot 592 miljoen in het jaar 2035 [5]. Aanvankelijk werd gedacht dat DM op volwassen leeftijd begon, maar nu blijkt DM onafhankelijk te zijn van leeftijd, wat duidelijk de enorme omvang van de dreiging aantoont per DM naar wereldwijde gezondheid.

Cistanche kan de immuniteit verbeteren

Conventioneel omvat de behandeling van DM (type 1 en 2) het gebruik van antidiabetica, die zijn gegroepeerd als niet-insuline (inclusief de biguaniden (bijv. metformine), sulfonylureumderivaten (bijv. glyburide), SGLT-2-remmers (bijv. dapagliflozine), galzuurbindende harsen (bijv. colesevelam), amylinemimetica (bijv. pramlintide), dopamine-2-agonist (bijv. bromocriptine), DPP-4-remmers (bijv. sitagliptine), GLP{{5 }}RA's (bijv. exenatide), thiazolidinedion (bijv. rosiglitazon), en -glucosidaseremmers (bijv. Acarbose en voglibose)) en insuline (bijv. humane insuline en analogen) therapieën [6]. De conventionele antidiabetische therapieën zijn effectief gebleken ondanks het feit dat het gebruik van sommige ervan kostbaar is en gepaard kan gaan met ernstige bijwerkingen[7]. De kosten, bijwerkingen en de algemene overtuiging dat conventionele medicijnen synthetisch zijn en trouwens onveilig in vergelijking met kruidengeneesmiddelen, die als "natuurlijk" en relatief veilig worden beschouwd, hebben bijgedragen aan de hernieuwde belangstelling voor het gebruik van kruiden en van kruiden afgeleide geneesmiddelen. producten voor de behandeling en beheersing van ziekten bij de mens, waaronder DM[8,9]. Dit paradigma is vrij gebruikelijk in armere tropische landen van de wereld, waar de meeste mensen afhankelijk zijn van kruidengeneesmiddelen om aan hun primaire gezondheidszorgbehoeften te voldoen [8]. Dit kan waarschijnlijk ook de gebruikelijke bewering bevestigen dat het gebruik van kruiden ouder is dan de moderne geneeskunde en dat natuurlijke producten blijven dienen als sjablonen voor de farmaceutische synthese van nieuwe geneesmiddelen [10], waaronder antidiabetica. Belangrijk is dat deze kruiden en van kruiden afgeleide therapieën worden gebruikt als aanvullende therapie op een manier die de geloofssystemen en het etnobotanische erfgoed van de meeste lokale gemeenschappen in Afro-Aziatische regio's van de wereld weerspiegelt. Zo hebben veel medicinale planten met etnobotanische claims voor de behandeling van diabetes mellitus, zoals Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin en Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13] en Bryophyllum pinnatum [14] allemaal aangetoond -amylase en -glucosidaseremmende effecten die van vitaal belang worden geacht voor de glykemische controle. Het is als reactie op deze hernieuwde belangstelling voor het gebruik van kruiden en van kruiden afgeleide producten als aanvullende of alternatieve therapie, dat de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) samen met andere belangengroepen heeft aanbevolen om inheemse geneeswijzen, met name kruidengeneeskunde, op te nemen in gezondheidszorgstelsels van armere landen [15]. Deze aanbeveling maakte het noodzakelijk om gezondheidsclaims te verifiëren op geneeskrachtige kruiden die vaak door lokale mensen worden gebruikt om menselijke ziekten te behandelen [16,17]. Interessant is dat Abrus pre-catorius, gewoonlijk "jequirity erwt" genoemd, een geneeskrachtig kruid is dat op grote schaal wordt gebruikt in de volksgeneeskunde van vele culturen in Afro-Aziatische regio's van de wereld voor de behandeling van menselijke ziekten[18-20]. Verschillende rapporten hebben gewezen op het traditionele gebruik van Abrus precatorius-bladeren bij de behandeling en behandeling van diabetes mellitus[21-23]. Merk op dat extracten van bladeren van Abrus precatorius werkzaamheid hebben aangetoond tegen diabetes mellitus [1] en borstkanker [24], twee menselijke ziekten die aanzienlijk hebben bijgedragen aan de wereldwijde ziektelast [25]. Veel studies hebben het etnofarmacologische gebruik en andere medicinale claims van Abrus precatorius gerechtvaardigd door de biologische eigenschappen ervan experimenteel aan te tonen, waaronder het opruimen van vrije radicalen [26], reno-bescherming [27], neurobescherming [28], immunomodulerend [19], ontstekingsremmend [29], anti-lipotoxiciteit [30] en antibloedplaatjesaggregatie [31] om maar een staaltje te noemen.

Eerder werden de glucoseverlagende en pancreasbeschermende effecten van APLE experimenteel aangetoond in STZ/nicotinamide-geïnduceerde diabetische ratten om het gebruik ervan als antidiabetisch volksgeneesmiddel door lokale mensen in de westelijke regio van Ghana te bevestigen [1]. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de glucoseverlagende en pancreasbeschermende effecten van APLE bleef echter slecht opgehelderd. Momenteel zijn er mechanismen die ten grondslag liggen aan de glucoseverlagende en pancreasbeschermende effecten van APLE, zoals modulatie van insuline, glucagon en GLP-1, remming van de enzymatische activiteit van -amylase en -glucosidase, opruiming van vrije radicalen en herstel van pancreascelbeschadiging en necro-apoptose werden in vivo en in vitro aangetoond.

2. materialen en methoden

2.1. Geneesmiddelen en chemicaliën. Alloxanmonohydraat (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, VS), nicotinamide (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, VS), acarbose (LGM Pharma, VS), metformine (Bristol laboratories Ltd.) , galluszuur (Merck KGaA, VS), rutine (Acros organics, VS), ascorbinezuur (Carl Roth, Duitsland), quercetine (Alfa Aesar, VK), p-nitrofenylglupyranoside (pNPG) (BBI Biotech, China), Rat Insuline ELISA-kit, Rat Glucagon-ELISA-kit en Rat GLP-1 ELSA-kit (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, China) werden in het onderzoek gebruikt. Alle andere oplosmiddelen en chemicaliën die in het onderzoek werden gebruikt, waren van analytische kwaliteit.

2.2. Verzameling, identificatie en authenticatie van Abrus precatorius-bladeren. Verse bladeren van A. precatorius werden verzameld van niet-gecultiveerde landbouwgrond in Sefwi Asawinso'A' (Bibiani-Ahwiaso-Bekwai District, Western Region, Ghana). De bladeren werden geïdentificeerd en geverifieerd door een gekwalificeerde botanicus van de herbariumeenheid, School of Biological Sciences, de Universiteit van Cape Coast, waar een voucher-exemplaar (CC3366) werd gedeponeerd zoals eerder gemeld [1].

2.3. Bereiding van Abrus precatorius Leaf Extract (APLE). APLE werd bereid volgens een eerdere methode [1]. In het kort werden schaduwgedroogde bladeren van A. precatorius mechanisch vermalen tot fijn poeder. De poedervormige bladeren werden vóór gebruik bewaard in luchtdichte plastic containers. Een hoeveelheid van 120 g van de verpoederde bladeren werd 48 uur in 700 ml ethanol geweekt en bedekt met kaasdoek. Het mengsel werd ten minste 3 keer per dag geroerd. Op de tweede dag werd het mengsel gefiltreerd door een filtreerpapier dat in een Buchner-trechter was geplaatst. Het filtraat werd gescheiden met behulp van een roterende verdamper die op een waterbad was gemonteerd. Na het winnen van ethanol met behulp van de roterende verdamper, werd de resulterende donkergroene stroperige vloeistof enkele weken in een exsiccator gedroogd, waardoor een donkergroen vast extract achterbleef. Het extract werd voor gebruik gelabeld en bewaard in een exsiccator. APLE werd continu bereid om voldoende hoeveelheden voor alle experimenten te verkrijgen.

2.4.Fytochemische screening van APLE.APLE werd gescreend op de aanwezigheid van fytoverbindingen zoals eerder gerapporteerd [1]. 2.5.Bepaling van het totale fenolgehalte (TPC) in APLE. Het totale fenolgehalte in APLE werd bepaald met behulp van de Folin Ciocalteu-reagensmethode zoals eerder beschreven [32] met kleine aanpassingen. Een verdunde concentratie van APLE 250μL van 1 mg/ml）werd gemengd met 750μL Folin Ciocalteu reagens（1 in 10 verdunningen met water） en 750μL van 7 procent Na, CO. De mengsels werden vervolgens aangevuld tot 5 ml met gedestilleerd water en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 2 uur voor kleurontwikkeling. Absorptie werd vervolgens gemeten bij 765 nm met behulp van een spectrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments). Na bereiding van een standaard galluszuurcurve (0-300ug/mL) werd de TPC in APLE geëxtrapoleerd uit de galluszuurkalibratiecurve en uitgedrukt in galluszuurequivalent (GAE). Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

2.6. Bepaling van het totale flavonoïdegehalte (TFC) in APLE. Het totale flavonoïdegehalte in APLE werd gemeten volgens een eerder beschreven methode [33] met enkele aanpassingen. In het kort, 500 L Abrus precatorius-plantenextract （1 mg/ml, bereid in 50 procent ethanol, werd gemengd met 500 μL 10 procent aluminiumchloride-AlCl,.6H,O en 1500 μL 10 procent natriumacetaat (NAC,H,O ,.3H,O). Het reactiemengsel werd gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en de absorptie werd gemeten bij 415 nm met behulp van een spectrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments). Na voorbereiding van de standaard rutine-kalibratiecurve (0-250ug/mL), werd TFC in APLE geëxtrapoleerd uit de rutine-kalibratiecurve en uitgedrukt in rutine-equivalent (RE). Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

2.7. Ethische goedkeuring. Alle protocollen waarbij dieren betrokken waren, werden aanvankelijk beoordeeld en goedgekeurd door de Kwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST) Institutional Review Board on Animal Experimentation (FPPS/PCOL/006/2019). Ook werden experimenten met ratten uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie (2010/63/EU) betreffende het gebruik en de verzorging van dieren in wetenschappelijke experimenten. Het dierenleed en het aantal dieren zijn zoveel mogelijk teruggebracht om te voldoen aan de eisen in de 3R-aanbevelingen (Verfijning, Vervanging en Vermindering) [34].

2.8. Verwerving en verzorging van proefdieren. Gezonde volwassen Sprague-Dawley-ratten van een week oud van beide geslachten (met een gewicht tussen 120 en 180 g) werden gekocht bij het Noguchi Medical Research Institute (NMRI), Universiteit van Ghana. Ratten werden later vervoerd naar het Animal House van het Department of Biomedical Sciences, University of Cape Coast, Cape Coast, Ghana. Ratten werden gehuisvest in roestvrijstalen kooien (34 cm x 47 cm x 18 cm) met droge houtkrullen als bodembedekking, gevoed met normaal knaagdiervoer (GAFCO, TEMA) en hadden onbeperkte toegang tot water. Ratten werden gehouden onder omgevingsomstandigheden van temperatuur, vochtigheid en normale donker/lichtcyclus. Deze omstandigheden werden echter gevarieerd om te voldoen aan de specifieke vereisten van sommige experimenten. Ratten mochten gedurende meer dan twee weken wennen aan deze omgevings- en laboratoriumomstandigheden voordat ze in experimenten werden gebruikt.

2.9. Vaststelling van door Alloxan/Nicotinamide geïnduceerde diabetes mellitus bij ratten. Experimentele diabetes mellitus werd vastgesteld bij normoglycemische volwassen Sprague-Dawley-ratten die 's nachts gevast hadden volgens een eerder beschreven methode [1, 35] met enige aanpassing. In het kort werden ratten achtereenvolgens geïnjecteerd met nicotinamide (48 mg/kg; IP) opgelost in normale zoutoplossing en op ijs gehouden; vervolgens, 15 minuten later, werd Alloxan (120 mg/kg; ip) gereconstitueerd in 100 mM citraatbuffer (pH 4,5) oplossing en werd dagelijks gedurende 7 dagen aan ratten toegediend. Vervolgens kregen ratten gedurende 7 dagen dagelijks 5 procent glucose (5 ml/kg; PO)-oplossing. Om het ontstaan ​​van hyperglykemie bij ratten te bevestigen, werd bloed afgenomen bij ratten die een nacht hadden gevast 3-7 dagen na alloxan/nicotinamide en 5 procent glucosebehandelingen met behulp van de staartpuntamputatiemethode. Staarten van ratten werden eerst schoongeveegd met steriel katoen gedrenkt in 10 procent ethanol. Nuchtere bloedglucose (FBG) werd gemeten met behulp van URIT G26 glucometer (URIT Medical Electronic Co., Ltd.).

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250 mg / dL) bij meerdere metingen werd beschouwd als diabetes mellitus (hyperglykemie) [1,35].Bevestigde diabetische ratten werden willekeurig ingedeeld in vijf groepen. Controleratten werden niet blootgesteld aan Alloxan; in plaats daarvan kregen ze een normale zoutoplossing. Alle groepen werden gedurende een periode van 18 dagen behandeld, zoals hieronder weergegeven:

Controle: normale zoutoplossing (5 ml / rat / dag; po) plus knaagdiervoer plus water

Model: nicotinamide (48 mg/kg ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus knaagdiervoer plus water

Metformine: nicotinamide (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus metformine (300 mg/kg; po) plus knaagdiervoer plus water

APLE (100 mg/kg): nicotinamide (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (100 mg/kg; po) plus knaagdiervoer plus water

APLE (200 mg/kg): nicotinamide (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (200 mg/kg; po) plus knaagdiervoer plus water

APLE (400 mg/kg):nicotinamide (48 mg/kg; ip) plus Aloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (400 mg/kg po) plus knaagdiervoer plus water

2.11. Meting van het lichaamsgewicht.Voorafgaand aan de aanvang van alle dierproeven werd het lichaamsgewicht van ratten gemeten. Vervolgens werd het lichaamsgewicht van ratten in alle groepen gedurende 18 dagen elke 3 dagen gemeten. Doses werden om de 3 dagen aangepast om veranderingen in lichaamsgewicht weer te geven. Ten slotte werd het lichaamsgewicht van ratten in alle groepen gemeten voorafgaand aan hun opoffering.

2.12. Bloedafname, bereiding van sera en isolatie van organen.Na het wegen van ratten op dag 18 werden de ratten opgeofferd onder diepe chloroformanesthesie. Bloedmonsters werden verzameld via een hartpunctie en vervolgens in gelabelde lege vacutainerbuizen gedaan. Representatieve bloedmonsters voor elke groep werden gedurende 5 minuten bij 3000 rpm (Eppendorf-centrifuge 5702.4 graden) gecentrifugeerd. Om sera te verkrijgen, werd het supernatant verzameld in respectievelijk gelabelde monsterbuizen. De lever, niermilt en pancreas werden geoogst, vers gewogen en gefixeerd in 10% formaline.

2.13.Meting van seruminsuline, glucagon en GLP-1.Seruminsuline-, glucagon- en GLP-1-spiegels werden respectievelijk gemeten met behulp van ratteninsuline ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co. Ltd, China), rat glucagon ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd. , China) en rat GLP-1 ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., China) strikt volgens de instructies van de fabrikant.

2.14. Bepaling van het mediane gebied van pancreaseilandjes van Langerhans.Na histologische verwerking van representatieve pancreas, werden de resulterende microfoto's voor respectieve groepen gescand met behulp van de Amscope MD35-oculaircamera zoals eerder beschreven [1]. Elke microfoto werd geüpload naar Adobe photoshop CS6 en vervolgens gesuperponeerd op een stereologisch raster. Het aantal snijpunten boven het stroma van pancreaseilandjes werd geteld. Het dwarsdoorsnede-oppervlak van pancreaseilandjes van Langerhans van de representatieve pancreas werd bepaald met behulp van de Cavalieri-methode en puntentelling [36]. Het dwarsdoorsnede-oppervlak werd bepaald met de formule:

waar

A staat voor dwarsdoorsnede van pancreaseilandjes van Langerhans

XP vertegenwoordigt het totale aantal snijpunten dat over het stroma van pancreaseilandjes ligt

a/p vertegenwoordigt het gebied per punt van het stereologische raster M vertegenwoordigt de lineaire vergroting.

2.15. Extractie van -Amylase uit de pancreas van cavia's.Na 20 uur hongersnood werd een cavia onder diepe verdoving opgeofferd en werd de pancreas operatief verwijderd. De pancreas werd ontdaan van vet en ander weefsel en onmiddellijk gewassen in natriumfosfaatbuffer (pH 7,4). Na het wegen van de pancreas werd deze bewaard in een vriezer op 4 graden. De bevroren pancreas werd vervolgens gehomogeniseerd (1 g van de pancreas: 5 ml buffer) met ijskoude 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH van 7,4) met behulp van een homogenisator (WiseTis HG-15D-homogenisator) en vervolgens gecentrifugeerd bij 4400rpm gedurende 30 minuten bij 4 graden. Het supernatant werd in afzonderlijke microfugebuisjes gepipetteerd en bij -20 graden in een vriezer bewaard. Om het geëxtraheerde enzym (-amylase) te bevestigen, werd een commercieel verkrijgbaar -amylase vergeleken met het geëxtraheerde enzym (-amylase) met behulp van zetmeel en jodium. Vage of verdwijning van de blauwzwarte verkleuring die als een indicatie van -amylase-activiteit werd beschouwd, werd vergeleken met een controleopstelling (geen enzym plus zetmeel plus jodium) waar er een diep blauwzwarte verkleuring was.

2.16.Effect van APLE op -amylase enzymatische activiteit.Remming van alfa ( ) -amylase enzymatische activiteit werd getest volgens een eerdere methode [37] met enkele modificaties. In het kort werd APLE (125 µl) of acarbose in toenemende concentraties (100-1500 ug/ml) toegevoegd aan een set gelabelde reageerbuisjes die 125 µl amylase-oplossing in 20 mM natriumfosfaatbuffer (pH 6,9) bevatten. Het APLE- of acarbose/-amylasemengsel werd gedurende 10 minuten bij 25°C voorgeïncubeerd. Vervolgens werd 125 µl van 1 procent zetmeel (bereid in 20 mM fosfaatbuffer, pH =6,9) met geselecteerde tijdsintervallen toegevoegd. Het reactiemengsel werd in elk geval 10 minuten bij 25°C geïncubeerd. Elke reactie werd met tijdsintervallen beëindigd door 250 ul 3,5-dinitrosalicylzuur(DNSA)-reagens toe te voegen en gedurende 5 minuten verder te verwarmen in een waterbad op 100°C, waarna men het liet afkoelen tot kamertemperatuur. Elke reactie werd aangevuld tot 2,5 ml met gedestilleerd water en de absorptie werd gemeten bij 540 nm met behulp van een spectrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments). Een controleopstelling werd bereid met dezelfde procedure, behalve dat -amylase werd voorgeïncubeerd met gedestilleerd water in plaats van APLE. De alfa()-amylaseremmende activiteit werd als volgt berekend:

2.17. Wijze van remming van -amylase enzymatische activiteit door APLE.De wijze van remming van -amylase enzymatische activiteit door APLE werd gedaan volgens een eerdere methode [38] met enige modificatie. In het kort werd 125 L APLE （5 mg/ml） eerst 10 minuten voorgeïncubeerd met 125 uL -amylase-oplossing in 20mM fosfaat bij 25 graden in een set gelabelde reageerbuisjes. Daarna werd 125 µl zetmeeloplossing in verschillende concentraties (0.3-5 mg/ml) aan de reactiemengsels toegevoegd om

de reactie starten. Het reactiemengsel werd vervolgens gedurende 10 minuten bij 25°C geïncubeerd voordat 250 µl 3,5-dinitrosalicylzuur (DNSA)-reagens werd toegevoegd om de reactie te stoppen. De hoeveelheid gevormd product werd bepaald door de absorptie te meten bij een golflengte van 540 nm met behulp van een spectrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments). De procedure werd herhaald voor het opzetten van een controle door pre-incubatie van -amylase met een buffer in plaats van APLE. Lineweaver-Burk-plot van de plot van Michaeles-Menten werd gedaan met behulp van Graph-Pad-prismaversie 8 (Graph Pad Software, San Diego, CA, VS) voor de schatting van Km en Vmax. De wijze van remming van -amylase enzymatische activiteit door APLE werd afgeleid uit de geschatte Km en Vmax.

2.18. Extractie van -Glucosidase uit de dunne darm van cavia's.Extractie van -glucosidase uit de darmen van cavia's werd uitgevoerd volgens een eerdere methode [39] met enkele aanpassingen. Kort samengevat werden cavia's eerst 20 uur uitgehongerd en daarna onder diepe verdoving opgeofferd. De dunne darm die zich direct boven de blindedarm en direct onder de twaalfvingerige darm bevond, werd operatief verwijderd en grondig gespoeld in ijskoude 0,02 M natriumfosfaatbuffer (pH 6,9) voordat deze in verse bufferoplossing werd gedompeld. Bij een verhouding van 1 g darm-ne:5 ml buffer, werd de geïsoleerde darm gehomogeniseerd (WiseTis HG-15D homogenisator, Duitsland) bij 4400 rpm gedurende 10 minuten met 2 minuten intermitterende onderbrekingen op ijs. Het homogenaat werd 30 minuten bij 4°C gecentrifugeerd (Eppendorf 5430R centrifuge) en het supernatant werd voorzichtig geoogst. Porties werden in cryobuisjes van 2 ml gedaan en op -20 graad bewaard voor onmiddellijk gebruik in experimenten. Om het geëxtraheerde enzym (-glucosidase) te bevestigen, werd een in de handel verkrijgbare -glucosidase gebenchmarkt met het geëxtraheerde enzym (a-glucosidase） door 50 L 3 mM p-nitrofenylglucopyranoside (pNPG) te incuberen met 25 μL in de handel verkrijgbare -glucosidase of 25 μL van het geëxtraheerde enzym （a-glucosidase) bij 25 graden. Waarneming van een geel p-nitrofenolproduct na telkens 5 minuten werd beschouwd als een bevestiging van de activiteit van -glucosidase.

2.19. Effect van APLE op -glucosidase enzymatische activiteit.De remmende effecten van APLE en acarbose (een standaard-glucosidaseremmer) werden beoordeeld volgens een eerdere methode [40]met enkele aanpassingen. In het kort werd fosfaatbuffer (20 mM; pH=6,9) gebruikt om p-nitrofenylglupyranose (pNPG) (substraat voor -glucosidase) te bereiden. In afzonderlijke experimenten werd a-glucosidase（50 L） voorgeïncubeerd met toenemende concentraties van APLE（25μL in elk geval）, acarbose of buffer gedurende 10 minuten in elk geval. Daarna werd 25 µl 3 mM p-nitrofenylglucopyranoside toegevoegd aan ofwel APLE/a-glucosidase of acarbose/a-glucosidase voorgeïncubeerd mengsel om een ​​reactie te starten. Het reactiemengsel werd in elk geval 20 minuten bij 25°C geïncubeerd. Na 20 minuten incubatie werd de reactie gestopt door toevoeging van 0,1 M Na,CO (1 ml). Een controle werd bereid met gebruikmaking van dezelfde procedure, behalve dat -glucosidase vooraf werd geïncubeerd met een buffer in plaats van APLE of acarbose. Het reactieproduct (een geelgekleurd p-nitrofenol) na beëindiging van de reactie werd gemeten met een spectrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments) bij 405 nm voor de bepaling van a-glucosidase-activiteit. De resultaten werden uitgedrukt als een percentage van de controle. In elk geval werden experimenten drie keer herhaald. Percentage (procent) remming van -glucosidase-activiteit werd geschat met behulp van de formule:

2.20. Wijze van -Glucosidase-remming door APLE.De wijze van remming van -glucosidase enzymatische activiteit door APLE werd uitgevoerd volgens een eerdere procedure [41] met enkele modificaties. In het kort, in één set reageerbuisjes werd exact 25 L van 5 mg/ml APLE voorgeïncubeerd met -glucosidase-oplossing（50 μL） bij 25 graden gedurende 10 minuten. In de tweede set buizen werd een -glucosidase voorgeïncubeerd met 50 L 20 mM fosfaatbuffer (pH=6.9）. Vervolgens werd 25 µl p-nitrofenylglupyranoside (PNP) in verschillende concentraties (0,3-3,0 mg/ml) toegevoegd aan beide sets reageerbuizen om de reactie te starten. De reactiemengsels werden vervolgens gedurende 20 minuten bij 25°C geïncubeerd, waarna Na, CO, -1000 μL） werd toegevoegd om de reactie te beëindigen. De hoeveelheid vrijgekomen product werd spectrofotometrisch gemeten met behulp van een p-nitrofenol standaardcurve en omgezet in reactiesnelheden, (v). Een dubbele reciproke grafiek (1/v tegen 1/S) waarbij S de substraatconcentratie is, werd uitgezet. De wijze van remming van -glucosidase-activiteit door APLE werd bepaald door analyse van de Line weaver-Burk-grafiek.

2.21. Beoordeling van 2,2-Difenyl-1-Picrylhydrazy(DPPH)radicalenopruimingsactiviteit.DPPH radicale wegvangende activiteit werd uitgevoerd volgens een eerdere methode [42] met enige modificatie. In het kort werd een reactiemengsel van 2 ml bereid door DPPH (1.0 ml 0.135 mM) bereid in methanol en 1.0 ml verschillende concentraties APLE (40,80,120,160) te mengen. en 200 ug/ml) of ascorbinezuur. Het reactiemengsel werd krachtig geschud en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker gelaten. De absorptie werd gemeten (UV-vis, T70 PG Instruments) bij 517 nm tegen een blanco. Alle tests werden in drievoud uitgevoerd. Een gelijke hoeveelheid methanol en DPPH-oplossing diende als controle. DPPH radicale wegvangende activiteit werd geschat met behulp van de formule:

2.22. Stikstofoxide (NO) Radical Scavenging Assay.GEEN radicalen wegvangende activiteit van APLE en standaarden werd geschat met behulp van de Griess Illosvory-reactie zoals eerder beschreven [43] met enkele wijzigingen. In het kort, het Griess Ilosvory-reagens gebruikte 0,1 procent (w/v) naftylethyleendiaminedihydrochloride in plaats van 5 procent 1-naftylamine. Variërende concentraties

({{{{10}}}}ug/ml) van zowel APLE als standaarden (gallinezuur en ascorbinezuur), bereid en aangevuld tot 167 L, werden in geëtiketteerde reageerbuizen gedaan en vervolgens werd 667 uL 10 mM natriumnitroprusside werd toegevoegd. Natriumfosfaatbuffer (167 µl, pH 7,4) werd vervolgens toegevoegd en het mengsel werd gedurende 150 minuten bij 25°C geïncubeerd. Daarna werd een 2000 L sulfanilzuurreagens (0,33 procent in 20 procent ijsazijn) toegevoegd en men liet dit 5 minuten staan ​​om de reactie van diazotering te voltooien. Ten slotte werd nog eens 2000 μl 0,1 procent naftylethyleendiaminedihydrochloride toegevoegd, gemengd en men liet het 30 minuten staan ​​bij 25°C. De nitrietconcentratie werd gemeten (UV-vis, T70 PG Instruments) bij 546 nm en werd berekend met de controlenitraatoplossing die geen APPLE/of standaarden had maar alle andere componenten van het reactiemengsel had. Natriumfosfaatbuffer werd gebruikt als een blanco oplossing. Percentage (procent) GEEN wegvangend vermogen van APLE en standaarden werd berekend met behulp van de formule:

waarbij Ac de absorptie van de controle is en At de absorptie van de test (APLE/standaard).

2.23. IJzerverlagende antioxidantcapaciteit (FRAC) Assay.FRAC werd getest volgens de vorige methode [44] met enkele wijzigingen. In het kort omvatte de reactie 250uL APLE/standaardoplossing in verschillende concentraties (12,5-200ug/ml), 625 µL natriumfosfaatbuffer (0,2M bij pH 6,6 ), en 625 µL van 1 procent kaliumferricyanide, [K,Fe(CN)] in verschillende reageerbuizen. Deze werden gedurende 20 minuten bij 50°C geïncubeerd om de reactie te voltooien. Vervolgens werd 625 µl 10% trichloorazijnzuur (TCA)-oplossing aan de reageerbuizen toegevoegd. Het totale mengsel werd 10 minuten bij 3000 rpm gecentrifugeerd, waarna 1800 uL supernatant werd genomen en gemengd met 1800 L gedestilleerd water. Daarna werd 360 L 0,1 procent ferrichloride-FeCl-oplossing toegevoegd en grondig gemengd. De absorptie van de oplossing werd gemeten bij 700 nm met behulp van een spectrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments) tegen de reactieblanco. Een typische blanco oplossing die hetzelfde oplossingsmengsel bevatte zonder APLE/of quercetine werd onder vergelijkbare omstandigheden geïncubeerd. Een verhoogde absorptie van het reactiemengsel duidt op een toegenomen reducerend vermogen. Het experiment werd drie keer herhaald bij elke concentratie. FRAC werd gemeten als quercetine-equivalent (QE).

2.24. Schatting van IC's en EC's0 Om IC en ECsoof APLE te bepalen met respectievelijk zijn antioxidant, vrije radicalen wegvangend en remmend effect op de enzymatische activiteit van -amylase en -glucosidase, werd een reeks toenemende concentraties van APLE getest tegen de respectieve activiteiten. Na het omzetten van de concentraties naar uitloggen werd op de horizontale as uitgezet tegen het percentage maximale activiteiten (antioxidant, opruiming van vrije radicalen en remmend effect op -amylase en a-glucosidase enzymatische activiteit) op de verticale as. De concentratie APLE die 50 procent van de maximale activiteiten produceerde (antioxidant,

vrije radicalen wegvangen en remmend effect op -amylase en a-glucosidase enzymatische activiteit) werd grafisch bepaald met behulp van GraphPad prisma versie 8 statistische software.

2.25. Statistische analyse.De verkregen gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Graph Pad Prism Version 8 voor Windows (Graph Pad Software, San Diego, CA, VS). De gemiddelde vergelijking tussen groepen werd gedaan met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstests. P Minder dan of gelijk aan 0,05 werd in alle analyses als statistisch significant beschouwd.

Dit artikel is afkomstig uit Hindawi BioMed Research International Volume 2021, artikel-ID 9920826, 17 pagina's https://doi.org/10.1155/2021/9920826