Quercetine onderdrukt inflammatoire cytokineproductie bij reumatoïde artritis Fibroblast-achtige synoviocyten
Apr 22, 2022
Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie
Abstract.Reumatoïde artritis (RA) is een chronische, progressieve en systemische auto-immuunziekte die voornamelijk wordt gekenmerkt door symmetrische synovitis van meerdere gewrichten. Quercetine heeft ontstekingsremmende, antioxidatie- en immuunregulerende activiteiten en vertoont daarom een hoge medicinale waarde. De huidige studie was gericht op het observeren van het effect van quercetine op fibroblastachtige synoviocyten (FLS's) bij RA. Reumatoïde artritis fibroblast-achtige synoviocyten (RAFLS's) werden voorbehandeld met 50 nmol/l quercetine gedurende 2 uur en werden vervolgens gestimuleerd met TNF-a gedurende 24 uur voor daaropvolgende experimenten. RAFLS's werden getransfecteerd met kort interfererend (si)-X-inactief specifiek transcript (XIST), microRNA (miR)-485mimic,miR-485-remmer of si-PSMB8 of combinatie. ELISA, PCR en western blotting werden gebruikt om het effect van quercetine op met TNF behandelde RAFLS's te evalueren -a. Er werd onthuld dat quercetine de productie van inflammatoire cytokines en de expressie van XIST in door TNF-a geïnduceerde RAFLSs remde. Bioinformatica-analyse gaf aan dat XIST fungeerde als een spons voor miR-485 en dat proteasoomsubeenheidtype-8 (PSMB8) een direct doelwit was van miR-485. Bovendien functioneerde PSMB8 als een suppressor bij inflammatoire cytokineproductie van RAFLS's geïnduceerd door TNF-a. Over het algemeen werd waargenomen dat quercetine de productie van inflammatoire cytokines en de expressie van XIST in door TNF-a geïnduceerde RAFLS's remde. Bovendien zou XIST-silencing de ontstekingsreactie kunnen onderdrukken door miR-485 af te sponzen in cellen die zijn behandeld met TNF-a. Al met al zou quercetine de ontwikkeling van RA in vitro kunnen onderdrukken.
Invoering
Reumatoïde artritis (RA) is een veel voorkomende ontstekingsziekte die wordt gekenmerkt door infiltratie van ontstekingscellen die leidt tot degeneratie van het synovium, gewrichtskraakbeen en bot (1). Het optreden en de ontwikkeling van RA omvatten het vrijkomen van een groot aantal inflammatoirecytokinenen mediatoren, die onomkeerbare vernietiging van kraakbeen en bot in het gewricht veroorzaken (2). Met de toename van een vergrijzende bevolking in de menselijke samenleving, heeft de incidentie van RA een stijgende trend laten zien in ontwikkelde landen van 1995 tot 2001 (3,4). Momenteel is de behandeling van RA afhankelijk van niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen, glucocorticoïden, methotrexaat en andere symptomatische methoden om de ziekte onder controle te houden. Deze medicijnen kunnen de symptomen van RA verbeteren, maar langdurig gebruik heeft sterke toxische bijwerkingen, zoals remming van de immuunfunctie van het lichaam (5). Daarom is het vinden van veilige en effectieve medicijnen voor de behandeling van RA van groot belang.
Quercetine is de belangrijkste bioflavonoïde in het menselijke dieet en wordt veel aangetroffen in de bloemen, bladeren en vruchten van planten (6,7). Quercetine heeft ontstekingsremmende, antioxidatie- en immuunregulerende activiteiten (8,9) en vertoont daarom een hoge medicinale waarde. Klinische studies hebben aangetoond dat quercetine een goed effect heeft op het verlichten van artrose in de knie, evenals op reumatoïde gewrichts- en lichaamspijn na inspanning (10-12). Fibroblast-achtige synoviocyten (FLS's) zijn de belangrijkste effectorcellen en kunnen een verscheidenheid aan inflammatoire cytokines afgeven, waardoor de progressie van RA wordt verergerd (13,14). Bovendien kan TNF-a de activering en botresorptie van osteoclasten bevorderen en kan de expressie induceren van andere ontstekingsfactoren, adhesiemoleculen en proteasen geassocieerd met bot en kraakbeen; waardoor de verdikking van de synoviale bekledingslaag wordt veroorzaakt en de ontstekingsreactie van de gewrichten verder wordt verergerd (15). De huidige studie was daarom gericht op het observeren van het effect van quercetine op FLS's bij RA en het onderzoeken van het mogelijke mechanisme vanquercetinebij de behandeling van RA.
materialen en methodes
Cel cultuur. De primaire cellen RAFLS's werden verkregen uit The Cell Bank of the Type Culture Collection van de Chinese Academie van Wetenschappen (cat.nr.408-05a). Alle cellen werden in DMEM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) met 10% FBS (HyClone; Cytiva) 100 E/ml penicilline en 100 ug/ml streptomycine in een incubator bij 37°C gehouden. Na 24 uur kweken werden RAFLS's voorbehandeld met 50 nmol/l quercetine (MilliporeSigma) gedurende 2 uur bij 37 graden en vervolgens gestimuleerd met 50 ng/ml TNF-a gedurende 24 uur bij 37 graden voor de volgende experimenten.
Cistanche kan de immuniteit verbeteren
Cel transfectie. Kleine interfererende (si)-RNA's gericht op XIST (si-XIST; eindconcentratie, 20 nM) en zijn vervormde negatieve controle (NC) siRNA (eindconcentratie, 20 nM), miR-485remmer (eindconcentratie, 30 nM) en gecodeerde remmercontrole (miR-NC; eindconcentratie, 30 nM) en miR-485-nabootsingen (eindconcentratie, 15 nM) en gecodeerde nabootsingscontrole (miR-NC-nabootsingen; eindconcentratie, 15 nM) werden verkregen uit Shanghai GenePharma Co., Ltd. Een totaal van lx10 graden RAFLS's werden gedurende 12 uur uitgeplaat in platen met zes putjes, daarna werden de constructen getransfecteerd in RAFLS's door te mengen met Lipofectamine*2000-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) bij 37 graden gedurende 15 minuten volgens de instructies van de fabrikant . In totaal 24-72 uur na transfectie werden de getransfecteerde cellen verzameld voor daaropvolgende experimenten. De sequenties van de getransfecteerde moleculen waren als volgt:si-XIST, 5'-GCAAAUGAAAGCUACCAAU-3'; si-NC, 5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3'; miR-485-remmer, 5'-UCACGCGAGCCGAACGAACAA-3'; anti-miR-NC, 5'-CAGUACUUUUUGUGUAGUACAAA-3';miR-485 nabootsen, 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCUCU-3'; miR-NC, 5'-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3!
Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). De concentratie van inflammatoire cytokinen in getransfecteerde en niet-getransfecteerde RAFLS's (IL-1 , IL-6 en IL-8) werd bepaald met behulp van ELISA-kits (cat. nrs. KE00021, KE00139 en KE00006; Proteintech Group, Inc.) volgens het protocol van de fabrikant. Een microplaatlezer werd gebruikt om de absorptie bij 450 nm af te lezen.
Reverse transcriptie-kwantitatieve (RT-q) PCR-analyse. Totale cellulaire RNA's werden geëxtraheerd uit getransfecteerde en niet-getransfecteerde RAFLS's met behulp van het TRIzol"-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). cDNA-synthese werd uitgevoerd met behulp van Maxima Probe qPCR Master Mix (Fermentas; Thermo Fisher Scientific, Inc.) volgens de instructies van de fabrikant Kwantitatieve analyse van XIST- en PSMB8-expressie werd uitgevoerd met behulp van SYBROPremix Ex Taqm-reagens (Takara Bio, Inc.) en GAPDH werd gebruikt als de endogene controle Thermocyclische omstandigheden waren als volgt: 94 graden voor 3 min; 40 cycli van 94 graden voor 30 sec, 55 graden gedurende 30 sec en 72 graden gedurende 1 min; en 72 graden gedurende 10 min. Het expressieniveau van miR -485 werd geanalyseerd met behulp van SYBRO PrimeScript "M miRNA RT-PCR-kit (Takara Biotechnology Co., Ltd. ) en U6 klein nucleair RNA werd als interne referentie gebruikt. Thermocyclische omstandigheden waren als volgt: Denaturatie bij 95 graden gedurende 10 sec; 40 cycli van 95 graden gedurende 5 sec en 60 graden gedurende 20 sec; gevolgd door dissociatiecurve-analyse bij 95 graden gedurende 60 sec, 55 graden gedurende 30 sec en 95 graden gedurende 30 sec. Primers werden gekocht van Sangon Biotech Co., Ltd., en de primersequenties waren als volgt: GAPDH Forward, 5-CTTGGTATCGTGGA AGGACTC-3' en omgekeerd, 5'-GTAGAGCAGGGATGATGATG TTCT-3'; U6 vooruit, 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA AAAT-3' en achteruit, 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3'; IncRNA XIST vooruit, 5'-AATGGAACGGCTGA GTTTTAC-3' en omgekeerd, 5'-TCATCCGCTTGCGTTCAT AG-3'; miR-485 vooruit, 5'-CAGAGCTGGCCGTGAT-3 en achteruit, 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGTCCGAGGTA TTCGCACTGGATACGACGAATTC-3'; PSMB8 vooruit, 5'-GCTGCCTTCAACATAACATCA-3' en achteruit, 5'-CTG CCACCACCACCATTA-3! De relatieve expressie werd geanalyseerd met 2-AACq(16).
Western-blotting. Totaal eiwit werd geïsoleerd uit RAFLS's met behulp van pre-koude RIPA-lysisbuffer (Beyotime Institute of Biotechnology), waaronder een proteaseremmer. Het totale eiwit werd gekwantificeerd met behulp van een BCA-eiwitassaykit (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Een totaal van 30 ug eiwitmonsters per baan werden gescheiden door 10% SDS-PAGE en vervolgens overgebracht op een nitrocellulosemembraan (MilliporeSigma). De membranen werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk. Vervolgens werden de membranen een nacht bij 4 graden geïncubeerd met primaire antilichamen gericht tegen PSMB8(1:1,000; cat.nr. abl80606) en GAPDH (1:1,000; cat.nr. abl81602) (allemaal van Abcam). De membranen werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met een met mierikswortelperoxidase gemerkt secundair anti-konijn IgG-antilichaam (1:1,000;sc-2027; Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van een ECL-detectiekit (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) en geanalyseerd met Quantity One v4.6.2-software (Bio-Rad Laboratories, Inc.). GAPDH werd gebruikt als de laadcontrole.
Luciferase-reportertest. De XIST-fragmenten en PSMB8 3'-niet-vertaalde regio's die wildtype (WT) of mutante (MUT)miR-485-bindingsplaatsen bevatten, werden verkregen van Shanghai GenePharma Co., Ltd. Ze werden gekloond in de vuurvlieg luciferase-genreportervector pmiRGLO (Promega Corporation). Het plasmide werd gesynthetiseerd door Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. Vervolgens 48 uur na transfectie met behulp van LipofectamineD 2000-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) bij 37 graden met 5 procent CO, werd de luciferase-assay uitgevoerd met behulp van de dual-luciferase reporter-assaysysteemkit (Promega Corporation ) volgens de instructies van de fabrikant. De luciferase-activiteit werd geanalyseerd met behulp van een Modulus single-tube multimode reader (Promega Corporation) in vergelijking met Renilla luciferase-activiteit. De volgende sequenties werden gebruikt: XIST-WT Forward, 5'-CGCCAGCTTCGACAATTCGAC-3 en reverse, 5'-ACT TGAAGCGGCCATACGTTGACAA-3';XIST-MUT forward, 5'-TCAAAACCCAACTAGAGGACGATTTGTGA-3 ', en omgekeerd, 5'-AACCCAGAAAACCGTACGGCAATCGT-3';
PSMB8-WT vooruit, 5'-CCGCTAAGTCCGAGTAGTCA-3', en achteruit, 5'-ATAAGAATGCGGCCGAATTCATGG GAA-3'; en PSMB8-MUT vooruit, 5-TTAGGACACGCA TCGGATTACGCTATTAT-3', en omgekeerd, 5'-GACACCTGT TTACGGCTACCCGCAAATATGCCAA-3'.
Bioinformatica analyse. De bindingsplaatsen tussen miR{{0}} en XIST, evenals miR-485 en PSMB8, werden voorspeld door StarBase v2.0 (http://www.microrna.gr/lncBase) of TargetScan-software v7.1 (http://www.targetscan.org/vert_71/), respectievelijk.
Statistische analyse. Alle gemeten gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie. Verschillen werden berekend met gepaarde Student's t-test voor vergelijkingen tussen twee groepen of eenrichtings-ANOVA gevolgd door Dunnett's of Tukey's post hoc-test voor meerdere vergelijkingen. Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc.) en SPSS 14.0 (SPSS, Inc.).P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" experiments="" were="" repeated="" three="">
Resultaten
Quercetine remt de productie van inflammatoire cytokines en de expressie van XIST in RAFLS's geïnduceerd door TNF-a. Onder TNF-a-stimulatie waren de concentratie van inflammatoire cytokines (IL-1 , IL-6 en IL-8) en het expressieniveau van XIST significant opgereguleerd in RAFLS's vergeleken met die in de NC (Fig. IA en B). Behandeling met quercetine zou echter de bevordering van TNF-a bij de productie van inflammatoire cytokinen aanzienlijk kunnen onderdrukken, en het expressieniveau van XIST was aanzienlijk verlaagd in de FLS's (Fig. IA en B). Deze resultaten gaven aan dat quercetine de ontstekingsreactie in RAFLS's veroorzaakt door TNF-a zou kunnen onderdrukken.
XIST werkt als een spons voor miR{{0}}. Vervolgens werden de potentiële moleculaire mechanismen onderzocht en werden de mogelijke doelwitten van XIST voorspeld met behulp van de StarBase-database v2.0.
De bioinformatica-analyse gaf aan dat miR-485 een potentiële bindingsplaats had met de XIST-sequentie (Fig. 2A). Van transfectie met de miR-485-nabootser werd aangetoond dat het de expressie van miR-485 in RAFLS's opreguleerde (Fig. 2B). Ondertussen bootst de miR -485 duidelijk onderdrukte luciferase-activiteit na in het XIST-wildtype vergeleken met die in de NC (Fig. 2C). TNF-a kon het expressieniveau van miR-485 in RAFLS's, dat werd gered door quercetine (Fig.2D) significant downreguleren. XIST werd significant onderexpressie gebracht in RAFLS's na transfectie met si-XIST (Fig.2E). , XIST-silencing bevorderde significant de expressie van miR-485, die werd omgekeerd door de miR-485-remmer in RAFLSs behandeld met TNF-a (Fig. 2F). Deze resultaten gaven aan dat XIST interactie had met miR-485.
PSMB8 is een direct doelwit van-485. Volgens TargetScan-analyse werd een sterk geconserveerde vermeende bindingsplaats met miR-485 geïdentificeerd in het PSMB8 3'-niet-vertaalde gebied (Fig. 3A). De miR -485-nabootsing onderdrukte significant de fluorescentie in het PSMB8-wildtype in vergelijking met die in de NC (Fig. 3B). TNF-a zou het expressieniveau van PSMB8 in RAFLS's aanzienlijk kunnen opreguleren, wat werd omgekeerd door quercetine (figuur 3C). De miR-485-remmer zou het expressieniveau van miR-485 in RAFLS's (Fig. 3D) aanzienlijk kunnen verlagen. Bovendien was de expressie van PSMB8 significant verminderd in RAFLS's na transfectie met si-PSMB8 ( Fig. 3E).miR-485-remmer zou de expressie van PSMB8 op de mRNA- en eiwitniveaus significant kunnen verhogen, wat werd afgeschaft door si-PSMB8 in RAFLS's die waren behandeld met TNF-a (Fig. 3F). Deze resultaten gaven aan dat miR-485 zich rechtstreeks richtte op PSMB8.
PSMB8 functioneert als een suppressor bij de productie van inflammatoire cytokinen in RAFLS's die worden geïnduceerd door TNF-a. Na transfectie met si-PSMB8 waren de concentraties van inflammatoire cytokines (IL-1 , IL-6 en IL-8) significant verlaagd in getransfecteerde RAFLS's behandeld met TNF-a vergeleken met de niet-getransfecteerde cellen behandeld met TNF-a (Fig. 4A). Bovendien onderdrukte quercetine de ontstekingsreactie in RAFLS's onder TNF-a-stimulatie, wat
werd gered door transfectie met si-PSMB8 (Fig. 4B). Deze resultaten gaven aan dat PSMB8 de ontstekingsreactie in RAFLS's veroorzaakt door TNF-a zou kunnen onderdrukken.
Discussie
Als een natuurlijk actief product uit planten, is quercetine een secundaire metaboliet die door natuurlijke medicinale chemie uit Fagaceae-planten wordt geïsoleerd en geëxtraheerd (17). In voorgaande jaren is geverifieerd dat quercetine de ontstekingsreactie remt bij een aantal ziekten, waaronder kwaadaardige tumoren ( 18), diabetische Mellitus (19) en atherosclerose (20). De huidige studie beoordeelde de rol van quercetine op de ontwikkeling van RA. Er wordt verondersteld dat zodra fibroblasten zijn geactiveerd in de pathogenese van RA, een reeks ontstekingsfactoren en extracellulaire matrixafbrekende enzymen zullen worden geproduceerd om de ontstekingsreactie te mediëren, waardoor de progressieve vernietiging van bot en kraakbeen wordt veroorzaakt en de kwaliteit wordt beïnvloed.
van het leven ernstig (21,22). In de huidige studie werd waargenomen dat quercetine de inflammatoire cytokineproductie van FLS's, geïnduceerd door TNF-a, onderdrukte.
As a class of non-coding transcripts, IncRNAs are >200 nucleotiden lang en reguleren genexpressie op epigenetische, transcriptionele en post-transcriptionele niveaus (23,24). lncRNA XIST werd oorspronkelijk geïdentificeerd bij de regulatie van X-inactivatie in de somatische cel van vrouwelijk zoogdier (25). Eerder onderzoek suggereert dat gedereguleerde expressie van XIST betrokken is bij de ontstekingsreactie van sommige ziekten, waaronder inflammatoire neuralgie en acute pneumonie (26,27). In overeenstemming met eerder onderzoek, vond de huidige studie dat het expressieniveau van XIST werd opgereguleerd in FLS's geïnduceerd door TNF-a, die werd afgeschaft door quercetine. ncRNA's kunnen genexpressie reguleren door miRNA's te sponsen (28). Bioinformatica-analyse gaf aan dat miR-485 een potentiële bindingsplaats had met de XIST-sequentie.cistanche deserticola maBovendien werd het niveau van miR-485-expressie gedownreguleerd in FLS's die waren behandeld met TNF-a. Bovendien bevorderde XIST-silencing effectief miR-485-expressie in cellen na transfectie.
miRNA's kunnen zich richten op het 3'-niet-vertaalde gebied van mRNA's om genexpressie te regelen (29).cistanche effectenDe huidige studie onthulde dat PSMB8 een direct doelwit is van miR-485.PSMB8 kan functioneren als een subeenheid van het immunoproteasoom om als volgt een ontstekingsreactie te induceren. Yamagishi (30) rapporteerde dat specifieke remming van PSMB8 de afscheiding van ontstekingsfactoren kan verminderen, waardoor de ontstekingsreactie van diabetes mellitus wordt vertraagd. Koerner et al (31) onthulden dat de betrokkenheid van PSMB8 bij de ontstekingsreactie nauw verband houdt met de ontwikkeling van colorectale kanker. De huidige studie onthulde dat TNF-a het expressieniveau van PSMB8 in RAFLS's aanzienlijk zou kunnen opreguleren. Bovendien zou si-PSMB8 de concentratie van inflammatoire cytokines in RAFLS's die met TNF-a zijn behandeld, kunnen remmen. Bovendien kon quercetine de ontstekingsreactie niet onderdrukken in RAFLS's die werden behandeld met si-PSMB8 onder TNF-a-stimulatie. Deze gegevens suggereerden dat PSMB8 functioneert als een suppressor bij de productie van inflammatoire cytokinen in RAFLS's die worden geïnduceerd door TNF-a.
De huidige studie merkte op dat de onderdrukking van inflammatoire cytokineproductie door quercetine in FLS's geïnduceerd door TNF-a veelbelovend is in vitro. Het effect in vivo en het effect van farmacokinetiek en penetratie van het synoviale membraan op quercetine moeten echter nog worden onderzocht. Er zijn dus verdere studies gepland om te proberen het effect van quercetine op RA in vivo te bestuderen.
Tot slot,cistanche deserticolade huidige studie observeerde door quercetine geremde productie van inflammatoire cytokines en XIST-expressie in RAFLS's geïnduceerd door TNF-a. Bovendien zou XIST-silencing de ontstekingsreactie kunnen onderdrukken door miR-485 af te sponzen in cellen die zijn behandeld met TNF-a. Al met al zou quercetine de ontwikkeling van RA in vitro kunnen onderdrukken.
Dit artikel is afkomstig uit Ontvangen 17 juni 2020; Geaccepteerd 11 juni 2021DOI: 10.3892/etm.2021.10695
