Identificatie en functionele analyse van een bifavon als een nieuwe remmer van tijdelijke receptorpotentiële vanilloïde 4-afhankelijke atherogene processen

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comom meer te weten

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei & Shaik O. Rahaman

Atherosclerose, een progressieve ontstekingsziekte van grote slagaders, is de belangrijkste oorzaak van de groeiende last van hart- en vaatziekten gerelateerde mortaliteit en morbiditeit wereldwijd1. De cruciale initiërende gebeurtenis die leidt tot atherosclerose omvat de retentie van gemodificeerde low-density lipoproteïne (oxLDL) deeltjes in de subendotheliale aorta intimale ruimten, voornamelijk in arteriële vertakkingspunten2. Tijdens vroege atherogenese, na endotheeldisfunctie, transmigreren circulerende bloedmonocyten naar de intima-gebieden en differentiëren ze in weefselmacrofagen . In aorta-intimale ruimtes creëert binding en opname van oxLDL door macrofagen, geholpen door scavenger-receptoren zoals SRA en CD36, een feedforward athero-inflammatoire lus die resulteert in de ontwikkeling van met lipiden beladen schuimcellen, een cruciaal proces bij atherosclerose2-8. De cascades van ontstekingsgebeurtenissen veroorzaakt door schuimcellen leiden tot de vorming van een vroege vettige streep en uiteindelijk het verschijnen van geavanceerde atherosclerose-laesies die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een fibreuze kap, verkalkt weefsel, immuuncellen, matrixeiwitten en lipiden. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) van de TRPV-subfamilie, een niet-selectief, polymodaal kationkanaal dat doorlaatbaar is voor Ca2 plus, wordt alom tot expressie gebracht in verschillende celtypen, waaronder macrofagen . Voorheen bekend als een osmosensor, is het nu bekend dat TRPV4 reageert op veelsoortige biochemische en biomechanische stimuli, waaronder warmte, matrixstijfheid, osmolariteit, groeifactoren, pH en 4 forbolesters11-24. Van TRPV4 is gemeld dat het verschillende fysiologische functies medieert, zoals pijnsensatie bij ontstekingen en neuropathieën18,22,23, myofibroblastdifferentiatie en -migratie 17,25,26 en osteoclastdifferentiatie in het bot27. TRPV4-mutaties zijn in verband gebracht met verschillende kanalopathieën28-31. Recente studies door onze groep en anderen hebben een mogelijke rol van dit kanaal in ontelbare pathologische aandoeningen zoals longverwondingen22,32, schuimcelvorming14,16, weefselfibrose17,33, vreemdlichaamreactie13 en kanker34,35 geïmpliceerd. Eerder werd een atheroprotectieve rol van TRPV4 aangetoond, waarbij door chemische agonist geïnduceerde TRPV4-functie in endotheelcellen werd geassocieerd met activering van eNOS en remming van monocytadhesie aan endotheelcellen . Daarentegen zijn tekortkomingen in TRPV4-functies in verband gebracht met tal van athero-inflammatoire reacties, waaronder endotheeldisfunctie, verminderde vorming van macrofaagschuimcellen en vaatziekten . Ons laboratorium heeft onlangs een proatherogene rol van TRPV4 geïdentificeerd, waarbij het oxLDL-geïnduceerde macrofaagschuimcelvorming reguleert. Mechanistisch hebben we aangetoond dat TRPV4 de opname maar niet de binding van oxLDL in macrofagen op een CD36-onafhankelijke manier beïnvloedt14. In een andere studie rapporteerden we een TRPV4-afhankelijke exacerbatie van oxLDL-geïnduceerde schuimcelvorming in aanwezigheid van lipopolysaccharide en toenemende matrixstijfheid, waardoor een verband werd gelegd tussen mechanosensing en het risico op atherosclerose16. Alles bij elkaar genomen, suggereren deze bevindingen dat TRPV4 een aantrekkelijk doelwit is bij atherosclerose en andere ziekten, waardoor de ontdekking van kleine molecuulremmers van TRPV4 wordt gestimuleerd die kunnen worden vertaald in klinisch effectieve therapieën. Het gebruik van natuurlijke verbindingen in therapieën heeft aan bekendheid gewonnen, voornamelijk gedreven door de behoefte aan kosteneffectieve en biocompatibele verbindingen in vergelijking met de momenteel bestaande synthetische medicijnen. Natuurlijke verbindingen zoals:flavonoïden, alkaloïden,polyfenolen, en curcuminoïden, beïnvloeden hart- en vaatziekten via diverse mechanismen zoals remming vanpro-inflammatoirsignalen, insulinesensibilisatie en het verbeteren van bloedlipidenprofielen door zich te richten op de AMPK-, COX1/2-, eNOS- en Nrf2-routes40-45. Recente studies door meerdere groepen hebben twee flavonoïden, berberine en apigenine, geïdentificeerd als potentiële modulatoren van TRPV4-activiteit46,47. We hebben een semi-high-throughput screeningmethode ontwikkeld en gebruikt om potentiële antagonisten van TRPV4 te identificeren uit een bibliotheek van natuurlijke verbindingen met behulp van een op Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) gebaseerde Ca2 plus influx-assay. Hierin rapporteren we de identificatie en functionele analyse van Linkedin, een flavon, als een nieuwe remmer van TRPV4-afhankelijke atherogene processen in macrofagen, waarmee we een basis leggen voor verdere studies van deze natuurlijke verbinding als een natuurlijke anti-atherosclerotische kleine molecuul verbinding. Van Linkedin is gemeld dat het neuroprotectieve,anti-kankerverwekkend, enontstekingsremmendrollen48,49. We rapporteren het werkingsmechanisme van Linkedin tegen TRPV4 in de setting van de vorming van macrofaagschuimcellen met behulp van tal van biochemische en cellulaire testen.

Klik hier om meer te weten

Materialen en methoden Dier- en celcultuur

We kochten congene C57BL/6 wildtype (WT) muizen van Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, VS). De richtlijnen van de University of Maryland Animal Care and Use Committee werden gevolgd voor alle dierproeven en de auteurs voldeden aan de ARRIVE-richtlijnen. Voor isolatie van door thioglycolaat geïnduceerde murine residente macrofagen (MRM), werd peritoneale lavage verzameld na 4 dagen intraperitoneale thioglycolaatinjectie en werden cellen gehandhaafd in 10 procent foetaal runderserum (FBS) dat DMEM7,14,16 bevatte. Een muizenmacrofaagcellijn (RAW264.7) en menselijke dermale fibroblasten (HDF) werden gekocht bij ATCC (Manassas, VA) en werden respectievelijk gekweekt met DMEM of MEM (Gibco, Waltham, MA). Van muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's) werden geoogst van 6- tot 7- weken oude muizen, zoals eerder beschreven14,50,51. In het kort, dijbenen van WT- en TRPV4 KO-muizen werden verzameld en beenmerg van dijbenen werd weggespoeld met volledige DMEM-media met 10 procent FBS. De gesuspendeerde beenmergcellen werden gefilterd door een 70 µm zeef (BD bioscience), gecentrifugeerd en bewaard in DMEM-medium aangevuld met M-CSF (25 ng/mL) gedurende 7-8 dagen bij 37 graden om differentiatie tot macrofagen mogelijk te maken.

Reagentia

Linkedin en GSK1016790A (GSK101) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) en de FLIPR Calcium 6-assaykit werd verkregen bij Molecular Device (Sunnyvale, CA). Human native LDL (VLDL) werd gekocht bij Stemcell Technologies (Vancouver, Canada). We hebben LDL gedurende 12 uur bij 37 graden geïncubeerd met 5 µM CuSO4 om koper-geoxideerd LDL (oxLDL)7,14,16 te bereiden. Fluorescerend met kleurstof gelabeld, DiI-oxLDL, werd gekocht bij Invitrogen (Carlsbad, CA) en MCSF bij R&D (Minneapolis, MN). Antilichamen voor FACS-analyse waren: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 en TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-geconjugeerde secundaire antilichamen waren van R&D (Minneapolis, MN) en PE-geconjugeerde isotype-controles waren van BD (Franklin Lake, NJ). Voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (qRT-PCR) gebruikten we de RNeasy-kit van QIAGEN (Redwood City, CA). Alle primers werden gekocht van Bio-Rad (Hercules, CA). Celkweekmedia, celkweekgerelateerde producten en Western-blot-reagentia werden verkregen van Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche tegen vermoeidheid

Semi high-throughput screening

We hebben een semi-high-throughput-screening uitgevoerd op antagonisten van Trpv4 uit een bibliotheek van 2000 natuurlijke verbindingen (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) met behulp van een op fluorometrische beeldplaatlezer (FLIPR) gebaseerde calciuminflux-assay14,17. We hebben ginkgetine (GGT) geïdentificeerd als een nieuwe antagonist voor TRPV4. De primaire en secundaire screening werden uitgevoerd met RAW264.7, HDF en BMDM's om het vermogen van Linkedin en andere kandidaten te beoordelen om TRPV4-opgewekte Ca2 plus infux14,17 te remmen. Als controles gebruikten we A23187, een calciumionofoor, TRPV4-nul-BMDM's en GSK219, een selectieve TRPV4-antagonist . Na de secundaire screening identificeerden we zes verbindingen die meer dan drievoudige remming van TRPV4-gemedieerde Ca2 plus-influx vertoonden in vergelijking met vehikelcontrole. Linkedin werd geïdentificeerd als de krachtigste remmer van TRPV4-activiteit. BMDM's (5 x 104 cellen/putje) werden uitgezaaid in met collageen beklede (10 µg/ml) 96-putjes met heldere bodemzwarte platen en geïncubeerd bij 37°C, 5 procent CO2. Op de dag van het experiment werden cellen beladen met calcium-6-kleurstof in HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecide en gedurende 45 minuten bij 37°C geïncubeerd. Na incubatie werden bibliotheekverbindingen aan elk putje toegevoegd tot een eindconcentratie van 2 µM. De platen werden nog 45 min bij 37°C geïncubeerd. Ca2 plus-influx werd geïnduceerd door de toevoeging van 10 nM TRPV4-agonist GSK1016790A in met drager of verbinding voorbehandelde cellen en geregistreerd door het meten van ΔF / F (Max-Min), zoals eerder beschreven . Gegevens worden weergegeven als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU).

Immunoblots

Door thioglycolaat opgewekte peritoneale macrofagen werden uitgezaaid in 10% FBS dat DMEM bevat en overnacht geïncubeerd. Niet-gehechte cellen werden gewassen en 1% runderserumalbumine (BSA) dat DMEM bevatte, werd aan de plaat toegevoegd en 3 uur geïncubeerd vóór de behandeling met Linkedin. Om de expressie van CD36-, TRPV4-, TLR2-, TLR4-, TLR6- en GAPDH-eiwitten te bepalen, werden lysaten van hele cellen bereid uit cellen die overnacht waren behandeld met Linkedin (1 en 5 µM) of vehikel in aanwezigheid of afwezigheid van oxLDL (25 µg/ml ). Om de expressieniveaus van door LPS geactiveerd p-JNK en JNK te bepalen, werden cellen gedurende 3 uur voorbehandeld met Linkedin (5 en 10 µM) en vervolgens gedurende 30 minuten gestimuleerd met E. coli LPS. Gehele cellysaten werden bereid uit tweemaal gewassen cellen (ijskoude PBS) met behulp van RIPA-buffer met toegevoegde proteaseremmercocktail (Thermo Scientific, MA). Blots werden onderzocht met konijn-anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jeruzalem, Israël), anti-muis CD36 (R&D, Minneapolis, MN), konijn-anti-TLR4, konijn-anti-TLR6, konijn-anti-JNK en konijn-anti-p- JNK primaire antilichamen (Cell Signaling, Danvers, MA) gevolgd door anti-konijn en anti-muis HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (R&D, Minneapolis, MN). Blots werden gestript en opnieuw onderzocht met anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) voor laadcontrole.

Schuimcelvorming.Thioglycolaat-getriggerde MRM werden gezaaid op glazen dekglaasjes in een plaat met 12 putjes met DMEM, 10% FBS en gedurende 2 uur bij 37 graden, 5% CO2 geïncubeerd. GGT (1 of 10 µM) werd aan de cellen toegevoegd en na 3 uur incubatie werd oxLDL (50 µg/ml) toegevoegd, en kweken werden overnacht bij 37°C geïncubeerd. Natief LDL (50 ug/ml) werd toegevoegd aan de putjes van de controlegroep en overnacht geïncubeerd. Cellen werden gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde gevolgd door Oil Red O-kleuring om de vorming van schuimcellen te kwantificeren.

Transductie van adenovirusvectoren.We verzamelden Adenovirus-constructen om Ad(RGD)-muis TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) en adenovirus blanco vector, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml) tot expressie te brengen, van Vector Biolabs, Malvern, PA. We gebruikten 1 × 108 pfu/ml voor alle experimenten. Voor schuimcelgeneratiestudies werden peritoneale macrofagen van muizen 72 uur geïncubeerd met Ade-TRPV4 of Ade-Vec in DMEM-media vóór de toevoeging van oxLDL om macrofaagschuimcellen te genereren.

Binding en opname van ox-LDL.Om de binding vast te stellen, werden peritoneale macrofagen gedurende 3 uur behandeld met twee doses (1 of 10 µM) Linkedin of vehiculum en gedurende één uur bij 4°C geïncubeerd met DiI-oxLDL. Na voorbehandeling met Linkedin of vehiculum werden de cellen gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd met DiI-oxLDL om de opname te beoordelen. Beelden werden vastgelegd door fluorescentiemicroscopie (63x) en Image J werd gebruikt om de resultaten te kwantificeren.

Flowcytometrie analyse.Door thioglycolaat opgewekte peritoneale macrofagen werden 24 uur gekweekt in DMEM, 10 procent FBS. Niet-gehechte cellen werden afgewassen, serumvrij medium werd toegevoegd en cellen werden gedurende 2 uur geïncubeerd, gevolgd door de toevoeging van 5 µM GGT of vehikel, en incubatie werd gedurende 3 uur voortgezet. Behandelde cellen werden van de plaat afgeschraapt en opnieuw gesuspendeerd in PBS, 2 procent BSA. Cellen werden gedurende 45 minuten met primaire antilichamen geïncubeerd, gevolgd door 30 minuten incubatie met PE-geconjugeerd secundair antilichaam. Een FACSCantoII flowcytometer (BD Bioscience, Ontario, Canada) werd gebruikt om gegevens te verkrijgen. Alle gegevens werden verwerkt met behulp van FlowJo-software.

qRT‑PCR.Thioglycolaat-geïnduceerde macrofagen werden gedurende 3 uur behandeld met 5 µM Linkedin of vehiculum; 25 µg/ml oxLDL werd toegevoegd aan de drager of de met Linkedin behandelde cellen, en de incubatie werd overnacht voortgezet. RNeasy Micro Kit (#74.004) van QIAGEN werd gebruikt om totaal RNA te extraheren, en een Universal SYBR Green One-Step Kit van Bio-Rad werd gebruikt om het RNA omgekeerd te transcriberen. Een C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) werd gebruikt om gegevens te verzamelen. Expressie van een gen werd bepaald als de hoeveelheid genspecifiek mRNA ten opzichte van GAPDH-mRNA met behulp van de vergelijkende CT-methode die wordt beschreven in het gebruikersbulletin van het Bio-Rad qRT-PCR-systeem.

Statistische analyse.Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van biologische drievoud. GraphPad Prism 7.0-software werd gebruikt en berekeningen werden uitgevoerd met Student's t-test voor twee groepen of eenrichtings-ANOVA voor meerdere groepen.

Ethische goedkeuring.Alle experimenten op muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en werden goedgekeurd door de Review Committee van de University of Maryland-College Park.

Resultaten in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>drievoudig; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Figuur 1. Semi-high-throughput screening-gebaseerde identificatie van Linkedin als een nieuwe TRPV4-remmer uit een bibliotheek van natuurlijke verbindingen. (A) Stroomschema met de workflow die resulteert in de identificatie van ginkgetine als een potentiële TRPV4-remmer uit een bibliotheek van 2000 natuurlijke verbindingen. (B) Representatieve FlexStation 3-opname die het remmende effect van 6 natuurlijke verbindingen op TRPV4-agonist (GSK1016790A)-geïnduceerde Ca2 plus instroom in calcium 6-kleurstof-geladen BMDM's tijdens secundaire screening toont. Voorbehandeling met alle 6 verbindingen vertoonde remmende effecten op TRPV4-afhankelijke Ca2 plus-influx in vergelijking met cellen die waren voorbehandeld met vehiculum (negatieve controle; vehikel plus GSK1016790A (10 nM)) of calciumionofoor (A23187, 2 μM). We gebruikten selectieve TRPV4-antagonist, GSK2193874 (10 nM), als een negatieve controle. Alle experimenten werden driemaal in viervoud herhaald. RFU: relatieve fluorescentie-eenheid.

TRPV4-remming door GGT heft oxLDL-geïnduceerde macrofaagschuimcelvorming op.Onze eerdere studies toonden aan dat TRPV4-opgewekte Ca2 plus influx betrokken is bij oxLDL-gemedieerde schuimcelvorming 14,16. Daarom evalueerden we de mogelijkheid dat schuimcelvorming werd geremd door GGT-gemedieerde antagonisatie van TRPV4-activiteit. Wildtype muriene peritoneale macrofagen werden geïncubeerd met oxLDL om schuimcelvorming te induceren in de aanwezigheid of afwezigheid van GGT, en geanalyseerd door Oil Red O-kleuring. Zoals verwacht, vonden we dat de vorming van schuimcellen vijfvoudig toenam in met oxLDL behandelde macrofagen in vergelijking met natief LDL (Fig. 2A, B). Behandeling van de macrofagen met GGT (1 of 10 M) voorafgaand aan stimulatie met oxLDL verminderde echter het percentage schuimcellen significant (Fig. 2A, B). Gezamenlijk suggereren deze bevindingen een remmend effect van GGT op de vorming van schuimcellen van macrofagen, mogelijk gericht op TRPV4-opgewekte Ca2 plus instroom. Verder brachten we TRPV4 tot overexpressie in TRPV4-nulmacrofagen door gebruik te maken van adenovirusconstruct en vervolgens de vorming van schuimcellen te induceren door oxLDL te gebruiken in aanwezigheid van GGT. We ontdekten dat overexpressie van TRPV4 de vorming van schuimcellen verhoogde die werd geblokkeerd toen we de cel voorbehandelden met GGT, wat suggereert dat remming van de proatherogene schuimcelvorming door GGT TRPV4-afhankelijk is (Fig. 2C, D).

GGT blokkeert het basale expressieniveau van TRPV4- en ontstekingsreceptoren niet.Scavenger-receptor CD36 speelt een belangrijke rol bij de opname en binding van oxLDL en de vorming van schuimcellen, cruciale processen bij atherosclerose4–7,54,55. Onlangs suggereert een groeiend aantal bewijzen de betrokkenheid van toll-like receptoren bij atherosclerose2,4,56. Om te onderzoeken of GGT de vorming van schuimcellen blokkeerde door de expressie van CD36, TLR4, TLR6 en TRPV4 te beïnvloeden, voerden we immunoblot-analyse uit bij twee concentraties GGT (1 of 5 µM). We vonden vergelijkbare expressieniveaus van CD36, TRPV4, TLR6 en TLR4 in vergelijking met de onbehandelde controle (Fig. 3A-D). Flowcytometrische analyse onthulde ook geen significant verschil in de celoppervlakte-expressie van de eiwitten met of zonder GGT-behandeling (Fig. 3E-H, I-L). Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat GGT de vorming van macrofaagschuimcellen blokkeert zonder de basale niveaus van oppervlakte-expressie van TRPV4, CD36, TLR4 en TLR6 te remmen.

Figuur 2. Remming van TRPV4 door Linkedin heft oxLDL-geïnduceerde macrofaagschuimcelvorming op. (A) Thioglycolaat-geïnduceerde muriene peritoneale macrofagen werden overnacht behandeld met 50 µg/ml oxLDL, gevolgd door een pre-incubatie van 3 uur met vehikel of 1 of 10 µM Linkedin. Cellen werden behandeld met 50 µg/ml natief LDL (VLDL) als controle. Originele vergroting: 40x. (B) Kwantificering van de resultaten wordt weergegeven in (A). n=500 cellen/voorwaarde. Student's t-test; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Opname van oxLDL, maar niet bindend door macrofagen wordt onderdrukt door GGT. Omdat eerder is aangetoond dat TRPV4 een rol speelt bij de opname van oxLDL en schuimcelvorming , hebben we geëvalueerd of behandeling met GGT een verslechtering van de binding van oxLDL op het macrofaagoppervlak veroorzaakte. WT peritoneale macrofagen werden behandeld met GGT voorafgaand aan incubatie met DiI-oxLDL bij 4 graden en binding werd beoordeeld. De resultaten geven aan dat de binding van oxLDL op het macrofaagoppervlak niet significant werd belemmerd door GGT (1 of 10 µM) behandeling in vergelijking met voertuigcontrole (Fig. 5A-C). Nadat we hadden vastgesteld dat GGT de binding van oxLDL niet remt, wilden we vervolgens bepalen of de opname van oxLDL in macrofagen werd aangetast door GGT-behandeling. Interessant genoeg gaven onze resultaten aan dat er een significante remming was in de opname van oxLDL in macrofagen in met GGT voorbehandelde cellen in vergelijking met de met drager behandelde groep (Fig. 6A, B). Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat GGT de opname van oxLDL blokkeert, maar niet bindend, in macrofagen.

GGT blokkeert door oxLDL geïnduceerde expressie van TRPV4 in macrofagen.

Omdat onze eerder gepubliceerde onderzoeken aantoonden dat TRPV4-opgewekte Ca2 plus een rol speelt bij oxLDL-gemedieerde macrofaagschuimcelvorming14,16, probeerden we te bepalen of GGT de vorming van schuimcellen blokkeerde via onderdrukking van door oxLDL geïnduceerde expressie van CD36, TLR2, TLR4, TLR6 of TRPV4. We ontdekten dat nachtelijke stimulatie van macrofagen met oxLDL resulteerde in significante opregulatie van de expressie van TRPV4-eiwitten in vergelijking met LDL, terwijl expressie van andere receptoren (CD36, TLR2, TLR4 en TLR6) onveranderd bleef (Fig. 4A-F). Voorbehandeling van cellen met GGT voorafgaand aan stimulatie met oxLDL verlaagde selectief het expressieniveau van TRPV4-eiwitten in vergelijking met vehikelbehandeling (Fig. 4A-F). Gezamenlijk suggereren deze bevindingen een remmend effect van GGT op TRPV4-eiwitexpressie, die gedeeltelijk betrokken kan zijn bij de onderdrukking van schuimcelvorming door GGT.

Figuur 3. Linkedin-behandeling verandert de totale eiwit- of oppervlakte-expressie van TRPV4, CD36 en TLR's in macrofagen niet. (A–D) Immunoblots van macrofaag hele cellysaten na een nachtelijke behandeling met 1 of 5 µM Linkedin of vehiculum. Representatieve immunoblots tonen totale eiwitexpressie van CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) en TLR4 (D) in met Linkedin behandelde en onbehandelde cellen. Drie onafhankelijke biologische herhalingen en 3 experimentele herhalingen voor elke reeks experimenten werden uitgevoerd. (E-H) Flowcytometrische analyse van macrofagen die 's nachts zijn behandeld met 5 µM Linkedin of onbehandeld, met oppervlakte-expressie van TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) en TLR6 (G) in onbehandelde en met Linkedin behandelde cellen. Drie onafhankelijke biologische replica's en 30 000 cellen per aandoening werden geanalyseerd. (I–L) Kwantitatieve analyse van resultaten van (E–H). Geanalyseerd door tweezijdige t-test met een betrouwbaarheidsinterval van 99 procent. Cellen geteld per experiment, 30,000; twee experimentele herhalingen.

GGT blokkeert proatherogene JNK2-activering en ontsteking in macrofagen. Gepubliceerde rapporten van ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat activering van JNK2 een cruciale rol speelt bij de vorming van schuimcellen en atherosclerose7,57. Om te bepalen of GGT de activering van JNK1/2 kon remmen, werden macrofagen behandeld met GGT gevolgd door stimulatie met LPS of oxLDL. Resultaten van immunoblot-analyse toonden aan dat behandeling met GGT de door oxLDL of LPS geïnduceerde fosforylering van JNK1 / 2 significant onderdrukte in vergelijking met de onbehandelde of natieve LDL-behandelde controle (Fig. 7A-D). Er is aangetoond dat JNK-activering in macrofagen transcriptie induceert van pro-inflammatoire mediatoren geassocieerd met atherosclerose58-60. Om te bepalen of GGT mogelijk de expressie van deze pro-inflammatoire regulatoren in macrofagen zou kunnen blokkeren, werden met GGT voorbehandelde cellen gestimuleerd met oxLDL en werden mRNA-expressieniveaus van TNF , IL 6, IL12, IL1 en MCP1 gekwantificeerd door qRT-PCR-analyse. We detecteerden significante neerwaartse regulatie in door oxLDL geïnduceerde expressieniveaus van TNF-, IL12-, IL1- en MCP1-mRNA in met GGT behandelde cellen in vergelijking met met drager behandelde controles (Fig. 7E-I). Samengevat suggereren deze resultaten dat GGT proatherogene JNK2-activering en inflammatoire genexpressie blokkeert als reactie op oxLDL-stimulatie in macrofagen. Discussie Van natuurlijke verbindingen zoals flavonoïden en polyfenolen is bekend dat ze cardiovasculaire reacties moduleren via diverse mechanismen, zoals remming van pro-inflammatoire signalen, insulinesensibilisatie, oxidatieve status en verbetering van bloedlipidenprofielen40-45. Hierin rapporteren we de semi-high-throughput screening-gebaseerde identificatie en functionele karakterisering van Linkedin, een flavon, als een nieuwe remmer van TRPV4-afhankelijke protherogene/inflammatoire processen in macrofagen. We hebben specifiek aangetoond dat i) ginkgetin blokkeert TRPV4-gemedieerde Ca2 plus instroom in macrofagen, ii) ginkgetin blokkade van TRPV4 functie de oxLDL-geïnduceerde schuimcelvorming aanzienlijk verminderde door de opname van oxLDL in macrofagen te onderdrukken, en iii) ginkgetine blokken LPS- en oxLDL-geïnduceerde fosforylering van JNK1/2, expressie van TRPV4-eiwitten en inflammatoire genexpressie. Samengevat toonden de resultaten van onze studie aan dat ginkgetine de proatherogene/inflammatoire macrofaagfunctie op een TRPV4-afhankelijke manier remt. Atherosclerose, een aortaziekte, wordt aanvankelijk gevoed door ontsteking en de stuwing van macrofagen met oxLDL, waardoor de vorming van macrofaagschuimcellen wordt geïnduceerd, die zich vervolgens ontwikkelen tot atheroma2-10. Aangezien schuimcelvorming een cruciaal proces is bij atherogenese, kan het begrijpen en manipuleren van schuimcelvorming therapeutisch potentieel hebben. Van macrofagen is bekend dat ze een reeks membraanpenetrerende ionenkanalen en pompen tot expressie brengen, waaronder TRPV4, een mechanisch gevoelig polymodaal Ca2 plus permeabel ionenkanaal, dat wordt geactiveerd door zowel fysieke als biochemische stimuli . Gepubliceerde onderzoeken door ons laboratorium en anderen hebben de rol van TRPV4 bij macrofaagontsteking en door oxLDL geïnduceerde schuimcelvorming geïdentificeerd14-16,26. TRPV4 kan dus dienen als een levensvatbaar doelwit voor verzwakking van proatherogene processen.

Figuur 5. Linkedin onderdrukt de binding van DiI-oxLDL aan macrofagen niet. Macrofagen werden voorbehandeld met vehikel of Linkedin (1 of 10 µM) gedurende 3 uur, gevolgd door incubatie met DiI-gelabeld oxLDL (2,5 µg/ml) gedurende 1 uur bij 4 graden. (A) Representatieve fluorescentiemicroscopische beelden (oorspronkelijke vergroting, 63 ×) van DiI-oxLDL-binding op het macrofaagmembraanoppervlak (n=20 cellen/conditie). (B) Resultaten van experiment A weergegeven als plotprofiel met behulp van NIH ImageJ-software. (C) Kwantitatieve analyse van resultaten van A. n=20 cellen/conditie. bij het verbeteren van atherosclerose door het verminderen van MMP-2 en MMP-9 en het verhogen van de niveaus van NO en NOS in thoracale aorta's van rat52. In de huidige studie toonden we aan dat ginkgetine TRPV blokkeert4-de Ca2 plus instroom in macrofagen opwekte. Mechanistisch toonden we aan dat ginkgetine de opname van oxLDL blokkeert, maar niet bindend, in macrofagen. Studies die in vivo en in vitro zijn uitgevoerd, suggereerden een cruciale rol van CD36 als de belangrijkste scavenger-receptor bij de opname van oxLDL en de vorming van macrofaagschuimcellen2-7. Er werd aangetoond dat CD36-nulmuizen zonder ApoE of LDLR minder vatbaar zijn voor het ontwikkelen van atherosclerotische laesies5,6. Eerdere studies van onze groep identificeerden een essentiële rol van de CD36-JNK-signaleringscascade in de vorming van macrofaagschuimcellen7. Toll-like receptoren TLR2, TLR4 en TLR6 werken als coreceptoren door interactie met CD36 en er is aangetoond dat ze betrokken zijn bij atherogenese2,56,63. We onderzochten de mogelijkheid dat het gebrek aan schuimcelvorming in met Linkedin behandelde macrofagen te wijten was aan verminderde expressie van CD36-, TRPV4-, TLR2-, TLR4- of TLR6-eiwitten. Interessant is dat behandeling met Linkedin de expressie van CD36-, TLR2-, TLR4- of TLR6-eiwitten op basale niveaus of onder door oxLDL gestimuleerde omstandigheden niet significant verminderde. Linkedin blokkeerde echter specifiek de door oxLDL geïnduceerde opregulatie van expressie van TRPV4-eiwitten, terwijl de expressie op basale niveaus onveranderd bleef. Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat ginkgetine door oxLDL geïnduceerde schuimcelvorming blokkeert via een mechanisme dat onafhankelijk is van CD36- en TLR-expressie, maar afhankelijk is van TRPV4. Eerdere studies van onze groep en anderen toonden aan dat JNK2-activering betrokken is bij de vorming van schuimcellen en de ontwikkeling van atherosclerotische laesies7,57. Er werd ook gemeld dat JNK betrokken is bij de modulatie van MMP-9 en MMP-13, die tot overexpressie worden gebracht in atherosclerotische laesies64-68. Gezien de erkende link van JNK in atherogene processen, wilden we bepalen of ginkgetine de activering van JNK kon remmen. In overeenstemming met eerdere rapporten toonden onze resultaten ook aan dat ginkgetine door ontstekingsstimulus geïnduceerde fosforylering van JNK2 in macrofagen blokkeert. Dit resultaat suggereert een mogelijk mechanisme waardoor Linkedin de vorming van schuimcellen blokkeert. Verder vonden we een significante neerwaartse regulatie in de door oxLDL geïnduceerde expressie van TNF , IL12, IL1 en MCP1 mRNA in met ginkgetine behandelde cellen in vergelijking met vehikelcontrole, wat de potentiële ontstekingsremmende rol van ginkgetine als reactie op oxLDL benadrukt. Samengevat lieten onze resultaten zien dat ginkgetine de proatherogene en inflammatoire macrofaagfunctie op een TRPV4-afhankelijke manier remt. Deze bevindingen versterken dus de grondgedachte voor het gebruik van natuurlijke verbindingen bij de ontwikkeling van potentiële therapieën en/of chemopreventieve reagentia.

Referenties
1. Barquera, S. et al. Globaal overzicht van de epidemiologie van de atherosclerotische cardiovasculaire ziekte. Boog. Med. Onderzoek 46, 328-338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. De cellulaire biologie van macrofagen bij atherosclerose. Cel 145, 341-355 (2011).
3. Libby, P. Ontsteking bij atherosclerose. Natuur 407, 233-241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokines, macrofaaglipidemetabolisme en schuimcellen: implicaties voor de therapie van hart- en vaatziekten. prog. Lipide Res. 50, 331-347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Gerichte verstoring van de klasse B-scavenger-receptor CD36 beschermt tegen de ontwikkeling van atherosclerotische laesies bij muizen. J. Clin. Investeren. 105, 1049-1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Scavenger-receptoren klasse AI/II en CD36 zijn de belangrijkste receptoren die verantwoordelijk zijn voor de opname van gemodificeerde lipoproteïne met lage dichtheid, wat leidt tot lipidenbelading in macrofagen. J. Biol. Chem. 277, 49982-49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. Een CD36-afhankelijke signaalcascade is nodig voor de vorming van macrofaagschuimcellen. Cel Metab. 4, 211-221 (2006).
8. Ross, R. Atherosclerose - een ontstekingsziekte. N Engl J Med. 340 (2), 115-126 (1999).
9. Libby P. Te moleculaire mechanismen van de trombotische complicaties van atherosclerose. J. Stagiair. Med. 517-527, 2008.
10. Lusis, AJ Atherosclerose. Natuur 407, 233-241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Ultrasnelle activering van TRPV4-ionkanalen door mechanische krachten die worden uitgeoefend op beta1-integrines op het celoppervlak. Geheel getal. Biol. (Kam). 2 (9), 435-442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ mechanotransductie-signaleringsas in matrixstijfheid en TGF 1-geïnduceerde epitheliale-mesenchymale overgang. Cel Mol. Bioeng.12, 139-152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Voorbijgaande receptorpotentieel vanilloid 4 is vereist voor de reactie van een vreemd lichaam en de vorming van gigantische cellen. Ben. J. Patol. 189(8), 1505-1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. TRPV4-calciumdoorlatend kanaal is een nieuwe regulator van de vorming van geoxideerde LDL-geïnduceerde macrofaagschuimcellen. Vrije Radicaal. Biol. Med. 110, 142-150 (2017).