In vitro evaluatie van de fotoreactiviteit en fototoxiciteit van natuurlijke polyfenol-antioxidanten

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comom meer te weten.

Abstract:Polyfenolen zijn een grote familie van natuurlijke verbindingen die veel worden gebruikt in cosmetische producten vanwege hun antioxiderende en ontstekingsremmende gunstige eigenschappen en hun vermogen om door UV-straling veroorzaakte oxidatieve stress te voorkomen. Aangezien deze verbindingen chromoforen bevatten en rechtstreeks op de huid worden aangebracht, kunnen ze reageren met zonlicht en fototoxische effecten uitoefenen. De beschikbare wetenschappelijke informatie over het fototoxische potentieel van deze natuurlijke verbindingen is schaars, en daarom was het doel van deze studie om de fotoreactiviteit en fototoxiciteit van vijf fenolische verbindingen te evalueren.antioxidantenmet gedocumenteerd gebruik in cosmetische producten. Een standaard ROS-assay werd gevalideerd en toegepast om de fotoreactiviteit van de natuurlijke fenolische antioxidanten cafeïnezuur, ferulazuur, p-coumarinezuur,3,4-dihydroxyfenylazijnzuur (DOPAC) en rutine te screenen. Het fototoxiciteitspotentieel werd bepaald met behulp van een humane keratinocytcellijn (HaCaT), gebaseerd op de 3T3 Neutral Red Uptake fototoxiciteitstest. hoewel allebestudeerde fenolische antioxidantengeabsorbeerde UV/Vis-straling in het bereik van 290 tot 700 nm, was alleen DOPAC in staat singlet-zuurstof te genereren. Het genereren van reactieve zuurstofsoorten is een chemische reactie in een vroeg stadium als onderdeel van het fototoxiciteitsmechanisme. Toch verminderde geen van de onderzochte verbindingen de levensvatbaarheid van keratinocyten na bestraling, wat leidde tot de conclusie dat ze geen fototoxisch potentieel hebben. De gegevens die met dit werk zijn verkregen, suggereren dat deze verbindingen veilig zijn wanneer ze in cosmetische producten worden verwerkt.

trefwoorden:foto veiligheid; fotoreactiviteit; fototoxiciteit; polyfenolen;natuurlijke fenolische antioxidanten; reactieve zuurstofsoorten; keratinocyten; huidverzorging; Cosmetische producten

Klik hier om meer te weten

Invoering 

Polyfenolen (PP's) vormen een van de meest talrijke en meest verspreide groepen natuurlijke producten in het plantenrijk. De chemische structuur van PP's wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een of meer fenolische hydroxylgroepen, gebonden aan een of meer benzeenringsystemen [1]. Polyfenolen vertonen een verscheidenheid aan gunstige biologische activiteiten bij mensen, waaronder antivirale, antibacteriële, anticarcinogene, hepatoprotectieve, ontstekingsremmende en antioxiderende werking [2-5].als antioxidanten, kunnen polyfenolen celbestanddelen beschermen tegen oxidatieve schadelijke effecten van reactieve zuurstofsoorten (ROS), zoals singlet-zuurstof, superoxide en hydroxylradicalen, waardoor het risico op verschillende ziekten die verband houden met oxidatieve stress wordt beperkt [6,7]. Vanwege hun chemische eigenschappen zijn PP's in staat om ROS op te vangen en overgangsmetaalionen, zoals ijzer en koper, te cheleren, wat de interesse van de cosmetische industrie heeft gewekt voor hun gebruik in huidverzorgingsformules [8-10]. Blootstelling aan ultraviolet (UV) is een van de belangrijkste factoren die huidkanker veroorzaken, en huidcellen kunnen direct worden beschadigd door UV-straling of indirect door UV-gemedieerde ROS-overproductie [11]. Experimentele en epidemiologische studies hebben gesuggereerd dat polyfenolen de huid via meerdere wegen beschermen tegen de nadelige effecten van UV-straling [12]. Daarom worden verschillende verbindingen die tot deze familie behoren al gebruikt als ingrediënten in een aantal commerciële cosmetische producten die op de markt verkrijgbaar zijn [13]. De toegenomen vraag van consumenten naar natuurlijke cosmetica drong er bij de industrie op aan om formuleringen te ontwikkelen met natuurlijke extracten met actieve ingrediënten, zoals polyfenolen, als een veelbelovende en effectieve oplossing voor huidverzorging [13]. De chromoforen die aanwezig zijn in de structuur van polyfenolen hebben echter het vermogen om UV/Vis-straling te absorberen en chemische reacties te ondergaan, wat resulteert in een cascade van gebeurtenissen die kunnen leiden tot fototoxische reacties [14]. Fototoxiciteit wordt gedefinieerd als een toxische reactie die wordt opgewekt door topisch of systemisch toegediende fotoreactieve chemicaliën na blootstelling van het lichaam aan omgevingslicht [15]. Actieve farmaceutische ingrediënten en hulpstoffen voor systemische toediening, klinische formuleringen voor plaatselijke toepassing, huidpleisters en andere hebben fototoxisch potentieel en kunnen opmerkelijke fototoxische reacties veroorzaken. Dientengevolge bieden regelgevende instanties, de Amerikaanse FDA, EU EMA en ICH, richtlijnen voor fotoveiligheid en introduceren ze testmethoden en evaluatiestrategieën [15-17]. Veiligheidsbeoordeling van cosmetische producten is verplicht volgens de wetgeving van de Europese Unie [18]. De vereiste veiligheidsevaluatie omvat relevante toxicologische onderzoeken naar cosmetische ingrediënten, waaronder een foto-geïnduceerde toxiciteitsevaluatie [18]. Aangezien dierproeven voor cosmetische producten zijn verboden, zijn de afgelopen jaren een aantal in vitro fotoveiligheidstests voorgesteld, waaronder UV-spectrumanalyse, een 3T3 Neutral Red Uptake fototoxiciteitstest (3T3 NRU PT) en een reactieve zuurstofspecies ( ROS) test [18-20]. De ROS-assay is ontworpen voor de beoordeling van fotoreactiviteit van geneesmiddelen, met als principe het volgen van fotochemische reacties in de testchemicaliën die zijn blootgesteld aan gesimuleerd zonlicht [19,20]. Door deze fotochemische reacties kunnen ROS, zoals superoxide-anion en singletzuurstof, worden gegenereerd, en deze fotochemische processen kunnen een trigger zijn voor door geneesmiddelen geïnduceerde fototoxiciteit [19,20]. Hoge niveaus van ROS kunnen cytotoxiciteit veroorzaken door schade aan DNA, lipiden en eiwitten door oxidatieve stress.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlDe in vitro methodologie 3T3 NRU-PT gebruikt de muisfibroblastencellijn Balb/c 3T3 en de opname van neutraal rood als het eindpunt van cytotoxiciteit. De fototoxiciteit wordt vervolgens bepaald door de relatieve vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen die zijn blootgesteld aan de teststof in aanwezigheid en afwezigheid van licht dat het zonlicht nabootst. Studies die in de literatuur zijn gerapporteerd, concludeerden dat deze test overgevoelig is en ten onrechte de veiligheidsrisico's van dieren en mensen voorspelt, wat leidt tot een groot aantal valse positieven in vergelijking met in-vivo-resultaten [21–23]. Gezien deze beperking werd door onze groep een wijziging van de 3T3 NRU-PT-methodologie voorgesteld op basis van het gebruik van een menselijke keratinocytcellijn (HaCaT) [24]. Aangezien deze methodologie gebruikmaakt van menselijke keratinocytcellen, vertegenwoordigt het een realistischer model, aangezien dit het meest voorkomende type cellen is dat aanwezig is in de buitenste laag van de huid, waar topische verbindingen worden aangebracht en blootgesteld aan zonlicht [24]. Het doel van de huidige studie was om het foto-geïnduceerde toxiciteitspotentieel van de natuurlijke polyfenolen p-coumarinezuur, cafeïnezuur, 3,4-dihydroxyfenylazijnzuur (DOPAC), ferulazuur en rutine te schatten (Figuur 1), die al worden gebruikt als cosmetische ingrediënten of die worden overwogen vanwege hun interessante chemische en antioxiderende eigenschappen [25-27]. Een ROS-assay werd gevalideerd en geïmplementeerd voor de verkennende fotoveiligheidsbeoordeling van de verbindingen, en hun cytotoxiciteit en fototoxiciteit werden verder beoordeeld met behulp van een menselijke keratinocytcellijn (HaCaT).

2. Resultaten en discussie 

De eerste overweging voor de beoordeling van fotoreactief potentieel is of een verbinding fotonen absorbeert bij elke golflengte tussen 290 en 700 nm. Een verbinding met een molaire extinctiecoëfficiënt (MEC) van meer dan 1000 L mol−1 cm−1 bij elke golflengte tussen 290 en 700 nm wordt als voldoende fotoreactief beschouwd om directe fototoxiciteit te veroorzaken [15]. De absorptiespectra van cafeïne-, p-coumarinezuur en ferulazuur, DOPAC en rutine in DMSO bij UV-zichtbaar licht worden weergegeven in figuur 2. Alle verbindingen absorberen in het spectrale bereik van 200 tot 700 nm, met een maximale golflengte bij of boven 290 nm en met een MEC typisch groter dan 4000 L mol−1 cm−1 (Tabel 1). Polyfenolen zijn biologische verbindingen die π-geconjugeerde systemen met fenolische hydroxylgroepen bevatten. De elektronische overgangen van de molecular-type moleculaire orbitalen zijn verantwoordelijk voor het UV-zichtbare spectrum van deze groep verbindingen [28]

Alle geteste verbindingen hadden een MEC van meer dan 1000 L mol−1 cm−1, wat betekent dat het allemaal mogelijke fototoxische verbindingen zijn die het bestuderen waard zijn [15]. Voorafgaand aan het uitvoeren van de ROS-assay, werd de zonnesimulator geëvalueerd en werden de experimentele omstandigheden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat de gemeten waarden van singlet-zuurstof (SO) en superoxide-anion (SA) dicht bij die in de literatuur lagen [29]. De optimalisatie van de ROS-generatietest werd uitgevoerd met behulp van positieve en negatieve controles en er werd een haalbaarheidsstudie uitgevoerd met behulp van referentiechemicaliën. Onder de gebruikte experimentele omstandigheden voldeden alle geteste stoffen in de haalbaarheidsstudie aan de acceptatiecriteria die waarden voor SO en SA binnen de toelaatbare waardebereiken gaven [29].

De ROS-assay werd uitgevoerd voor de polyfenolische verbindingen en het vermogen van de geteste stoffen om ROS te genereren, bij een concentratie van 200 µM, wordt weergegeven in Tabel 2. Tabel 2. De resultaten werden verkregen voor de geteste verbindingen met behulp van de ROS-assay.

De verkregen resultaten laten zien dat, met uitzondering van DOPAC, alle verbindingen als niet-fotoreactief kunnen worden geclassificeerd. Hoewel deze stoffen een UV-zichtbare lichtabsorptie en MEC hoger dan 1000 L mol−1 cm−1 vertoonden, genereerden ze geen ROS onder de geteste omstandigheden, noch SO- noch SA-soorten. Verrassend genoeg was DOPAC in staat om de vorming van SO-soorten te induceren en werd daarom geclassificeerd als fotoreactief, ondanks dat deze verbinding de laagste MEC-waarde had in het UV-zichtbare bereik van alle onderzochte verbindingen. Er zijn meer studies nodig om de resultaten van DOPAC te begrijpen, wat in de nabije toekomst ook belangrijk kan zijn om een ​​correlatie vast te stellen tussen de chemische structuur van een verbinding en zijn vermogen om fotoreactief te zijn. De cytotoxiciteit van DMSO gebruikt voor de evaluatie van fototoxische effecten, in aanwezigheid en afwezigheid van bestraling, na 1 uur blootstelling werd geëvalueerd. Voor de niet-bestraalde plaat vertoonde DMSO geen statistisch significant verschil ten opzichte van de negatieve controles. Voor de bestraalde plaat was er echter een significant verschil tussen de 1 procent DMSO en de oplosmiddelcontrole ten opzichte van de negatieve controles (p < 0,0001),="" wat="" het="" gebruik="" van="" oplosmiddelcontrole="" bij="" alle="" experimenten="" rechtvaardigde="" om="" te="" garanderen="" dat="" de="" verschillen="" in="" cellevensvatbaarheid="" werden="" alleen="" toegeschreven="" aan="" de="" onderzochte="" verbindingen.="" om="" de="" haalbaarheid="" van="" de="" fototoxiciteitstest="" met="" een="" humane="" keratinocytcellijn="" (hacat)="" te="" verzekeren,="" werden="" 5-methoxypsoraleen,="" chloorpromazinehydrochloride="" en="" kinine="" getest="" als="" positieve="" controles,="" en="" acetylsalicylzuur,="" hexachlorofeen="" en="" natriumlaurylsulfaat="" als="" negatieve="" controles="" [24].="" de="" resultaten="" die="" zijn="" verkregen="" uit="" de="" fototoxiciteitstest="" waarin="" de="" levensvatbaarheid="" van="" de="" cellen="" van="" de="" hacat-cellen,="" bestraald="" en="" niet-bestraald,="" in="" aanwezigheid="" van="" de="" geteste="" (poly)fenolische="" verbindingen="" wordt="" vergeleken,="" zijn="" weergegeven="" in="" figuur="" 3.="" de="" concentratiebereiken="" van="" de="" chemicaliën="" die="" zijn="" getest="" in="" aanwezigheid="" (irr="" plus="" )="" en="" de="" afwezigheid="" (irr−)="" van="" licht="" werden="" bepaald="" in="" experimenten="" voor="" het="" bepalen="" van="" het="" dosisbereik,="" rekening="" houdend="" met="" de="" maximale="" concentratie="" van="" 1000="" µm.="" er="" werd="" een="" geometrische="" verdunningsreeks="" gebruikt="" en="" indien="" nodig="" aangepast="" als="" functie="" van="" de="" concentratie-respons="" in="" aan-="" en="" afwezigheid="" van="" bestraling.="" binnen="" het="" geteste="" concentratiebereik="" (12,5;="" 31,25;="" 62,5;="" 125;="" 250;="" 500="" en="" 1000="" µm)="" veroorzaakte="" geen="" van="" de="" teststoffen="" een="" afname="" van="" 50="" procent="" in="" cellevensvatbaarheid,="" daarom="" was="" het="" niet="" mogelijk="" om="" de="" overeenkomstige="" ic50-="" en="" pif-waarden="" te="" berekenen="" .="" integendeel,="" het="" was="" mogelijk="" om="" een="" ​​dosisafhankelijke="" toename="" van="" de="" levensvatbaarheid="" van="" de="" bestraalde="" cellen="" waar="" te="" nemen="" in="" aanwezigheid="" van="" de="" geteste="" stoffen,="" mogelijk="" als="" gevolg="" van="" de="" fotoprotectieve="" effecten="" van="" deze="" antioxidanten="" tegen="" de="" oxidatieve="" schade="" veroorzaakt="" door="" de="" straling,="" wat="" leidt="" tot="" een="" hoger="" percentage="" van="" levensvatbare="" cellen="" in="" vergelijking="" met="" de="" controle="" (onbehandelde="" bestraalde="" cellen).="" in="" de="" literatuur="" wordt="" beschreven="" dat="" uv-straling="" leidt="" tot="" de="" vorming="" van="" ros,="" een="" overproductie="" van="" stikstofmonoxide="" en="" uitputting="" van="" de="" antioxidantafweer="" in="" keratinocyten="" [30].="" om="" deze="" redenen="" zijn="" polyfenolen="" met="" antioxiderende="" eigenschappen="" bestudeerd="" als="" fotoprotectieve="" middelen.="" hoewel="" de="" meeste="" onderzoeken="" zich="" richtten="" op="" het="" fotobeschermende="" vermogen="" van="" polyfenolen,="" bestudeerden="" ze="" niet="" hun="" fototoxisch="" potentieel.="" eerdere="" studies="" bevestigden="" het="" vermogen="" van="" cafeïne-,="" ferula-="" en="" p-coumarinezuren="" om="" ros="" en="" reactieve="" stikstofsoorten="" (rns)="" op="" te="" vangen.="" bovendien="" werd="" voor="" deze="" drie="" fenolische="" verbindingen="" ook="" in="" vivo="" bescherming="" tegen="" de="" schadelijke="" effecten="" van="" uv-straling="" vastgesteld="" [31-34].="" deze="" gegevens="" kunnen="" de="" toename="" van="" het="" percentage="" levensvatbare="" cellen="" verklaren="" bij="" blootstelling="" aan="" bestraling="" in="" aanwezigheid="" van="" de="" onderzochte="" verbindingen.="" rutine,="" zoals="" cafeïne-,="" ferula-="" en="" p-coumarinezuren,="" testten="" negatief="" in="" de="" ros-generatietest="" en="" induceerden="" geen="" fototoxiciteit="" in="" de="" hacat-cellijn.="" er="" is="" enige="" tegenstrijdige="" informatie="" in="" de="" literatuur="" over="" het="" fototoxische="" potentieel="" van="" rutine,="" vandaar="" het="" belang="" van="" de="" verkregen="" resultaten.="" de="" evaluatie="" van="" het="" fototoxisch="" potentieel="" met="" behulp="" van="" een="" keratinocytcelsysteem="" (hacat),="" toonde="" aan="" dat="" rutine="" fototoxiciteit="" vertoonde="" [35].="" integendeel,="" met="" behulp="" van="" een="" experimentele="" opstelling="" die="" capillaire="" elektroforese="" met="" elektrochemische="" en="" uv-detectie="" toepast="" om="" de="" fototoxiciteit="" van="" plantenextracten="" en="" componenten="" te="" testen="" in="" termen="" van="" zuurstofverbruik="" en="" het="" genereren="" van="" reactieve="" zuurstofsoorten="" bij="" bestraling="" met="" zichtbaar="" licht,="" was="" het="" mogelijk="" om="" te="" concluderen="" dat="" rutine="" was="" niet="" fototoxisch="" [36],="" wat="" in="" overeenstemming="" was="" met="" de="" resultaten="" die="" in="" dit="" werk="" werden="" verkregen,="" waarbij="" rutine="" geen="" fotoreactiviteit="" vertoonde="" omdat="" het="" geen="" so="" of="" sa="" genereerde="" in="" de="" ros-generatietest.="" aan="" de="" andere="" kant="" werd="" in="" dit="" werk="" ook="" aangetoond="" dat="" rutine="" op="" zichzelf="" geen="" fototoxisch="" potentieel="" heeft="" in="" de="" hacat-cellijn.="" deze="" tegenstrijdige="" bevindingen="" benadrukken="" het="" belang="" van="" het="" gebruik="" van="" gestandaardiseerde="" testomstandigheden="" en="" ook="" het="" gebruik="" van="" een="" geschikte="" lichtbron="" om="" misleidende="" resultaten="" te="" voorkomen.="" interessant="" is="" dat,="" en="" ondanks="" de="" structurele="" overeenkomst="" tussen="" dopac="" en="" de="" andere="" bestudeerde="" pp's,="" dopac="" so="" genereerde="" in="" de="" ros-generatietest="" en="" werd="" geclassificeerd="" als="" fotoreactief.="" bij="" testen="" in="" de="" hacat-cellijn="" bleek="" dopac="" echter="" niet-fototoxisch="" te="" zijn.="" uit="" de="" verkregen="" resultaten="" blijkt="" dat="" dopac="" fotoreactief="" maar="" niet="" fototoxisch="" is,="" dus="" het="" is="" niet="" te="" verwachten="" dat="" fototoxische="" reacties="" optreden="" na="" plaatselijke="" toepassing="" van="" deze="">

3. Materialen en methoden

3.1. Reagentia

3,4-Dihydroxyfenylazijnzuur (DOPAC), cafeïnezuur, transferulazuur, p-coumarinezuur, rutine, chloorpromazine-hydrochloride, dinatriumwaterstoffosfaat-dodecahydraat, monobasisch natriumfosfaat-monohydraat, Neutraal Rood (NR) en dimethylsulfoxide (DMSO) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Madrid, Spanje). Kininehydrochloride, benzocaïne, diclofenac en erythromycine werden gekocht bij Acofarma (Madrid, Spanje). De geïmmortaliseerde humane keratinocyt (HaCaT) cellijn werd verkregen van Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, Duitsland). Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 4,5 g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES en DMEM met 4,5 g/L D-glucose, L glutamine, 25 mM HEPES zonder fenolrood, Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), Fetal Bovine Serum (FBS) en trypsine EDTA werden gekocht bij Gibco Life Technologies (Waltham, MA, VS). Ethanol werd geleverd door Aga (Lissabon, Portugal). N, N-Dimethyl-4-nitroguanidine (RNO), imidazool en Nitro Blue Tetrazolium (NBT) werden gekocht bij Alfa Aesar (Kandel, Duitsland).

3.2. Spectrale absorptie 

Het absorptiespectrum van elke onderzochte verbinding werd bepaald in het bereik van 290 tot 700 nm, volgens de OESO-testrichtlijn 101, met behulp van een Jasco V650 UV/VIS-spectrofotometer [37]. De stoffen werden opgelost in DMSO om een ​​eindconcentratie van 10 µg/ml te verkrijgen en de absorptiespectra werden gemeten met UV-transparante kwartscuvetten (weglengte=10 mm). Elk spectrum werd gecorrigeerd voor oplosmiddelspecifieke basislijnabsorptie. Molaire extinctiecoëfficiënten (MEC) werden berekend met behulp van de hoogste absorptiepieken van 290 tot 700 nm [15].

3.3. Reactieve zuurstofspecies (ROS) Assay 

Het ROS-assayprotocol werd opgesteld en de validatiestudies werden uitgevoerd volgens de procedure beschreven in de literatuur [19,29]. Voorraadoplossingen van alle geteste stoffen werden bereid in een concentratie van 10 mM in DMSO en binnen dezelfde dag gebruikt, beschermd tegen licht. In het kort werd de vorming van singletzuurstof (SO) gedetecteerd door spectrofotometrische meting van p-nitrosodimethylaniline (RNO) bleken bij 440 nm met imidazool als een selectieve acceptor van singletzuurstof. Monsters, die de geteste chemische stof (200 µM), RNO (50 µM) en imidazool (50 µM) in 20 mM natriumfosfaatbuffer (PB, pH 7,4) bevatten, werden in een buis geplaatst en gemengd met een vortexmixer en gesoniceerd, beschermd tegen licht, gedurende 10 min. Het mengsel werd overgebracht naar een Hellma kwartsglas high-performance cel en gecontroleerd op neerslag onder een microscoop voor blootstelling aan licht. Vervolgens werden de monsters bestraald met behulp van een Fitoclima S600PL thermostatische zonnesimulator (Aralab, Portugal), uitgerust met acht Repti Glo (20 W) UV-Vis-lampen, gedurende 90 minuten bij 25 C. Na bestraling werd de absorptie opnieuw afgelezen bij 440 nm. De vorming van superoxide-anionen (SA) werd gedetecteerd door de reductie van nitroblauwtetrazolium (NBT) tot monoformazan (NBT plus) waar te nemen, waarvan de vorming spectrofotometrisch kan worden gevolgd bij 560 nm. Monsters die de geteste verbindingen (200 µM) en NBT (50 µM) in 20 mM NaPB bevatten, werden bestraald en de reductie in NBT werd gemeten door de toename in absorptie bij 560 nm op dezelfde manier als voor SO-bepaling. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Omdat de gebruikte zonnesimulator afweek van de aanbevolen modellen, was het noodzakelijk om de bestralingsomstandigheden te valideren. Er werd een ROS-assay uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de bestralingsomstandigheden voldeden aan de aanbevolen criteria met behulp van positieve (kinine) en negatieve controles (sulisobenzone) en chemische referentieverbindingen [29]. Volgens het resultaat (gemiddelde van drievoudige bepalingen) van de ROS-assay werden de geteste polyfenolische verbindingen geclassificeerd als fotoreactieve stoffen wanneer een SO-waarde van 25 of meer en/of een SA-waarde van 20 of meer werd gemeten; op zijn beurt werd het bepaald als een niet-fotoreactieve stof wanneer waarden van minder dan 25 voor SO en minder dan 20 voor SA werden geregistreerd [29].

3.4. Cel cultuur 

De HaCaT-cellen werden op 37 C gehouden in een vochtige atmosfeer van 95 procent lucht en 5 procent CO2 in de incubator in DMEM met 10 procent FBS en 1 procent antibiotica. Met behulp van een omgekeerde microscoop werd celconfluentie waargenomen en als de cellen 70-80 procent confluentie bereikten, werd subcultuur gedaan om celdood te voorkomen. Hiertoe werd het kweekmedium afgezogen en werden de cellen gewassen met DPBS, werd 2 ml trypsine 0,25 procent toegevoegd en gedurende 7 tot 8 minuten bij 37 C in een 5 procent CO2-atmosfeer geïncubeerd. Nadat de cellen waren losgemaakt, werd een vers medium toegevoegd om de trypsine-actie te blokkeren. Voor het tellen van cellen werd een celsuspensie van 10 L in een Neubauer-kamer geplaatst waar de cellen werden geteld. De verkregen celsuspensie werd vervolgens met een vers celkweekmedium in nieuwe kolven verdeeld. Voor celbevriezing werd DMSO (5 procent v/v) gebruikt als cryo-conserveringsmiddel om de vorming van kristallen tijdens de opslagfase te voorkomen. Om de tijd te bepalen die nodig is om de cellen te dupliceren, werden 1 x 106 cellen gezaaid in vijf kolven van 75 cm2 en gedurende 24 uur bij 37 ◦C in een 5 procent CO2-atmosfeer geïncubeerd om volledige hechting te bereiken. Vervolgens werden de cellen van elke kolf op verschillende tijdstippen geteld. De resultaten werden uitgezet in een grafiek die het aantal cellen tegen de tijd weergeeft, waaruit de verdubbelingstijd werd berekend met behulp van lineaire regressieanalyse. De berekende verdubbelingstijd die werd verkregen was 20,43 uur, wat consistent is met de waarden die in de literatuur worden vermeld, waarmee wordt bevestigd dat de gebruikte cellen zich in normale groeiomstandigheden bevonden [38]. 3.5. Fototoxiciteitstest Voor de studie van fototoxiciteit werd een eerder in ons laboratorium geïmplementeerd protocol gevolgd [24]. De hoogte van de UVA/UVB Osram-lamp (240V E27) is aangepast om de cellen te bestralen met een bestralings-UVA-dosis van 1,7 mW/cm2 (Cosmedico radiometer, UVM-7), volgens OESO-richtlijn [23] . Tijdens de bestraling (10 min) werden de platen in een piepschuimrecipiënt met een waterkoelsysteem gehouden, en de temperatuur werd gedurende de hele procedure gevolgd. In het kort, om de NR-opname-assay uit te voeren, werden HaCaT-cellen gezaaid (2 x 104 cellen / putje) en 24 uur bij 37 ◦C in een 5 procent CO2-atmosfeer geïncubeerd. Daarna werd het medium verwijderd, werden verschillende concentraties van de teststoffen toegevoegd en werden de cellen gedurende 1 uur onder dezelfde omstandigheden geïncubeerd. Eén plaat werd in het donker bewaard, terwijl de andere plaat 10 minuten werd bestraald met een temperatuur van 29-32 ◦C. Daarna werd het celmedium vervangen door vers DMEM zonder fenolrood en 18-22 uur geïncubeerd. Na deze incubatieperiode werden cellen van beide platen gewassen met DPBS en werd compleet DMEM met 50 µg/ml NR aan elk putje toegevoegd en 3 uur geïncubeerd. Na incubatie met NR werd de NR-oplossing verwijderd en werd een NR-desorbeeroplossing (50 procent ethanol: 1 procent azijnzuur: 49 procent gedestilleerd water) toegevoegd om de NR-kleurstof uit de cellen te extraheren. Voor de afleesprocedure werd de absorptie gemeten bij 540 nm. Binnen elke plaat werden DMSO-controles getest. Gegevens over de levensvatbaarheid van de cellen die van elke plaat werden verkregen, werden uitgedrukt als de absorptieverhouding van behandelde cellen tot oplosmiddelcontrolecellen en werden verder gebruikt om de IC50-waarden te schatten met behulp van lineaire regressieanalyse. De foto-irritatiefactor (PIF)-waarde voor elke teststof werd berekend als de verhouding tussen de ICso-waarde van de bestraalde (Irrplus) versus de ICso-waarde van de niet-bestraalde (Irr−) cellen. Volgens de OESO-richtlijn voorspelt een PIF-index lager dan 2 de afwezigheid van een fototoxisch effect, een PIF-index tussen 2 en 5 een waarschijnlijk fototoxisch effect en een PIF hoger dan 5 een fototoxisch effect [23]. Geteste verbindingen werden geëvalueerd in een reeks van concentraties: 12,5; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 en 1000 µM. 3.6. Statistische analyse Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van ten minste drie onafhankelijke experimenten die in drievoud zijn uitgevoerd. Om de normaliteit en homogeniteit van variantie te bevestigen, werd de D'Agostino-Pearson omnibus normaliteitstest gebruikt, en daarna de One-way variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Dunnett's post hoc-test (vergelijking met negatieve controlecellen met oplosmiddel), werd uitgevoerd. De grafieken zijn gegenereerd met de software GraphPadPrism voor Windows (versie 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, VS).

4. Conclusies

In deze studie werden een Reactive Oxygen Species (ROS) -assay en een 3T3 Neutral Red UptakePhototoxicity-assay (3T3 NRU-PT) gebruikt om het gedrag van natuurlijke fenolische antioxidanten te onderzoeken bij blootstelling aan straling die het zonlicht nabootst om hun fotoreactiviteit en fototoxiciteit te onderzoeken potentieel. De verkregen resultaten lieten de conclusie toe dat, hoewel rutine en cafeïne, p-coumarine en ferulazuren UV-zichtbare lichtstraling absorberen en een MEC van meer dan 1000 L mol−1cm−1 vertonen, ze geclassificeerd zijn als niet-fotoreactief. Bovendien induceerden deze verbindingen geen fototoxiciteit wanneer ze werden getest met de HaCaT-cellijn. De gevonden gegevens suggereren dat:deze antioxidantenop zichzelf wordt niet verwacht dat ze fototoxiciteit veroorzaken en daarom kunnen ze als veilig worden beschouwd voor gebruik in cosmetische formuleringen. Aan de andere kant was het mogelijk om een ​​toename van de levensvatbaarheid van de cel die aan de straling werd blootgesteld waar te nemen in aanwezigheid van deze antioxidanten, wat een mogelijk fotobeschermend effect aan het licht bracht dat interessant zou kunnen zijn om te bestuderen om hun gebruik als mogelijke fotobeschermende middelen in cosmetische formuleringen te ondersteunen. In het geval van DOPAC bleek deze verbinding fotoreactief te zijn, hoewel er geen fototoxiciteit werd waargenomen in de 3T3 Neutral Red Uptake-assay. Er moeten echter meer studies worden uitgevoerd om de mechanismen achter de fotoreactiviteit van DOPAC te begrijpen, om de fotoveiligheid ervan te waarborgen en ook om de rol en relatie tussen de chemische structuur en het potentieel van een verbinding om fotoreactief te zijn, te begrijpen. Auteursbijdragen: Formele analyse, BA; Schrijven—Originele ontwerpvoorbereiding, BA; Conceptualisatie IFA, HC en JG: bronnen, IFA, HC, JMSL en JG; Schrijven - Review & Editing, IFA, HC, JMSL en JG; Toezicht, IFA, HC en JG; Financiering Acquisitie, IFA, HC, JMSL en JG Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd. Financiering: dit onderzoek heeft geen externe financiering ontvangen. Verklaring van de institutionele beoordelingscommissie: niet van toepassing. Verklaring van geïnformeerde toestemming: niet van toepassing. Beschikbaarheidsverklaring: alle gegevens die in deze studie worden gepresenteerd, zijn opgenomen in het artikel. Erkenningen: dit werk wordt gefinancierd door nationale fondsen van FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, in het kader van het project UIDP/04378/2020, UIDB /04378/2020 van de ResearchUnit on Applied Molecular Biosciences-UCIBIO en het project LA/P/0140/2020 van het AssociateLaboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB en UIDB/00081/2020 gesubsidieerd door FCT/MCTES (PIDDAC). Belangenverstrengeling: De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling. Beschikbaarheid voorbeeld: Niet van toepassing.

Referenties

1. Zillich, OV; Schweiggert-Weisz, U.; Eisner, P.; Kerscher, M. Polyfenolen als actieve ingrediënten voor cosmetische producten. Int. J. Cosmet. Wetenschap. 2015, 37, 455-464. [Kruisref]
2. Jelena, CH; Giorgio, R.; Justyna, G.; Neda, M.-D.; Natasa, S.; Arthur, B.; Giuseppe, G. Gunstige effecten van polyfenolen op chronische ziekten en veroudering. In polyfenolen: eigenschappen, herstel en toepassingen; Galanakis, CM, red.; Woodhead Publishing: Kidlington, VK, 2018; blz. 69-102.
3. Cory, H.; Passarelli, S.; Szeto, J.; Tamez, M.; Mattei, J. De rol van polyfenolen in de menselijke gezondheid en voedselsystemen: een mini-review. Voorkant. Nutr. 2018, 5, 87. [CrossRef]
4. Fraga, CG; Croft, KD; Kennedy, DO; Tomás-Barberán, FA De effecten van polyfenolen en andere bioactieve stoffen op de menselijke gezondheid. Voedsel Functie. 2019, 10, 514-528. [Kruisref]
5. Bertelli, A.; Biagi, M.; Corsini, M.; Baini, G.; Cappellucci, G.; Miraldi, E. Polyfenolen: van theorie naar praktijk. Voedingsmiddelen 2021, 10, 2595. [CrossRef]
6. Chen, K.; Lu, P.; Beeraka, NM; Sukocheva, OA; Madhunapantula, SV; Liu, J.; Sinelnikov, MIJN; Nikolaenko, VN; Bulygin, KV; Mikhaleva, LM; et al. Mitochondriale mutaties en mitoepigenetica: focus op de regulatie van oxidatieve stress-geïnduceerde reacties bij borstkanker. Semin. Kanker Biol. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. Forman, HJ; Zhang, H. Gericht op oxidatieve stress bij ziekte: belofte en beperkingen van antioxidanttherapie. nat. Rev. Drugsontdek. 2021, 20, 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo, YC Kunnen plantaardige fenolverbindingen de huid beschermen tegen zwevende deeltjes in de lucht? Antioxidanten 2019, 8, 379. [CrossRef]
9. Jesumani, V.; Du, H.; Pei, P.; Aslam, M.; Huang, N. Vergelijkend onderzoek naar de huidbeschermende activiteit van polyfenolrijk extract en polysacchariderijk extract van Sargassum vachellianum. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10. Saraf, S.; Kaur, CD Phytoconstituents als fotobeschermende nieuwe cosmetische formuleringen. apotheker. Rev. 2010, 4, 1-11. [Kruisref]