Remmend effect van Gastrodia Elata Blume-extract op alfa-melanocyt stimulerende hormoon-geïnduceerde melanogenese bij murine B16F10-melanoom
May 17, 2023
ACHTERGROND/DOELSTELLINGEN:Gastrodia elata Blume (GEB), een traditioneel kruidengeneesmiddel, wordt in de oosterse geneeskunde gebruikt voor de behandeling van een breed scala aan neurologische aandoeningen (bijv. verlamming en beroerte) en huidproblemen (bijv. atopische dermatitis en eczeem). Deze studie was opgezet om te onderzoeken of GEB-extract de melanogenese-activiteit in B16F10-melanoom van muizen remt.
Volgens relevante studies is cistanche een veel voorkomend kruid dat bekend staat als "het wonderkruid dat het leven verlengt". Het belangrijkste bestanddeel is cistanoside, dat verschillende effecten heeft, zoals antioxiderende, ontstekingsremmende en immuunfunctiebevordering. Het mechanisme tussen cistanche en het bleken van de huid ligt in het antioxiderende effect van cistanche-glycosiden. Melanine in de menselijke huid wordt geproduceerd door de oxidatie van tyrosine gekatalyseerd door tyrosinase, en de oxidatiereactie vereist de deelname van zuurstof, dus de zuurstofvrije radicalen in het lichaam worden een belangrijke factor die de melanineproductie beïnvloedt. Cistanche bevat cistanoside, een antioxidant en kan de vorming van vrije radicalen in het lichaam verminderen, waardoor de melanineproductie wordt geremd.
Klik op Cistanche Tubulosa-supplement
Voor meer informatie:
david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501
INVOERING
De menselijke huidskleur wordt beïnvloed door genetica en vele factoren, voornamelijk door hoeveelheden en soorten melanine. Melanine wordt geproduceerd in de melanosomen van melanocyten en overgebracht van melanocyten naar keratinocyten in de basale laag van de epidermis als reactie op de blootstelling van de huid aan zonlicht, stress en melanine-stimulerende factoren [bijv. alfa-melanocyt-stimulerend hormoon (-MSH) , stikstofmonoxide en endotheline-1] [1,2]. -MSH bevordert bijvoorbeeld melanogenese door inductie van microphthalmia-associated transcription factor (MITF), wat een sterke inductor is van de melanocyt-specifieke enzymen zoals tyrosinase, tyrosinase-related protein (Trp)1 en Trp2 [1]. De productie van melanine wordt voornamelijk gereguleerd door tyrosinase, het snelheidsbeperkende enzym voor melanogenese, dat de hydroxylering van tyrosine tot 3,4-dihydroxyfenylalanine (L-DOPA) door mycofenolaat en de oxidatie van L-DOPA tot dopaquinon door difenolase katalyseert. wat een gebruikelijke stap is voor de biosynthese van zowel eumelanine als pheomelanine. De daaropvolgende stappen omvatten twee extra melanocyt-specifieke enzymen, Trp1 en Trp2 (ook bekend als dopachrome tautomerase), om eumelanine (bruin/zwart pigment) te produceren en de cysteïne/glutathion-geassocieerde niet-enzymatische stap om pheomelanine (rood/geel pigment), respectievelijk. Tyrosinaseremmers zoals hydrochinon [3,4], kojiczuur [5], ascorbinezuur [6] en arbutine [7] zijn gebruikt om hyperpigmentatiestoornissen te behandelen, maar er zijn recentelijk meldingen gedaan van verschillende bijwerkingen bij mensen [1, 2]. Daarom wordt veel aandacht besteed aan het vinden van veiligere en effectievere melanogene remmers uit natuurlijke bronnen die depigmentatie kunnen veroorzaken zonder bijwerkingen.
Gastrodia elata Blume (GEB), een orchideeplant zonder chlorofyl, heeft de symbiotische schimmels Mycena osmundicola en Armillaria mellea nodig voor respectievelijk ontkieming en groei/rijping [8,9]. GEB is gebruikt als een oosters medicinaal middel om neurodegeneratieve aandoeningen te behandelen (bijv. verlamming, duizeligheid, beroerte, epilepsie en dementie) [9,10]. Uit GEB is een verscheidenheid aan bioactieve verbindingen geïsoleerd, de belangrijkste zijn de fenolverbindingen zoals gastrodine, 4-hydroxybenzylalcohol, 4-hydroxybenzaldehyde, vanilline, vanillylalcohol en vanillinezuur [{{6 }}]. Onlangs is gemeld dat bioactieve verbindingen van GEB een remmend vermogen hebben voor tyrosinase-activiteit [13-16]. Bovendien hebben recente studies ergothioneïne (Ergo) [8,11] en diosgenine [17] geïdentificeerd in GEB. Ergo komt vooral voor in paddenstoelen [18,19], terwijl diosgenine in wilde yam zit [20]. Beiden staan in de top 10 van botanische ingrediënten die in 2010 aanwezig zijn in anti-verouderingscrèmes vanwege hun sterke antioxiderende werking [21], wat suggereert dat GEB zowel als functioneel cosmetisch middel als in medicinale voeding kan worden gebruikt.
Hoewel er rapporten zijn over de samenstelling van gevriesdroogd en stoomgedroogd GEB [22], de chemische bestanddelen ervan [11,12,23] en antioxiderende [12], bloedplaatjesaggregatieremmende en antitrombotische [24] effecten, zijn er weinig is bekend over de remmende effecten van GEB-extract op de melaninesynthese en de relevante enzymen in B16F10-melanoom. Aangezien GEB is gebruikt als een traditionele remedie voor neurologische aandoeningen en huidproblemen vanwege zijn bioactieve verbindingen en antioxiderende eigenschappen, hebben we het melaninegehalte en de tyrosinase-activiteit geanalyseerd, evenals de moleculaire niveaus van transcriptiefactoren en regulerende enzymen in B16F10-melanoom van muizen.
MATERIALEN EN METHODES
Bereiding van Gastrodia elata Blume (GEB) extract
Cel cultuur
Cel-levensvatbaarheidstest
B16F10-cellen werden uitgeplaat met een dichtheid van 4 x 104 cellen/putje in een 24-putjesplaat. De 100 procent confluente cellen werden voorbehandeld met 0-25 mg/ml GEB-extract gedurende 24 uur na behandeling met/zonder 200 nM -MSH (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, VS). Het medium is vervangen door een 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT; Amresco, Solon, OH, VS ) kleurstofoplossing [5 mg/ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)] bij 37 graden gedurende 3 uur. Het supernatant werd gedecanteerd en de formazanzouten werden opgelost in 500 µl isopropanol. De absorptie werd gemeten bij 570 nm met behulp van een spectrofotometer (Gen5.2; Biotek, Winooski, VT, VS).
Melanine-inhoudsanalyse
B16F10-cellen werden behandeld met 0-5 mg/ml GEB-extract of 400 µg/ml arbutine (een positieve controle; Sigma-Aldrich) gedurende 72 uur na behandeling met/zonder 200 nM -MSH gedurende 24 uur. De cellen werden tweemaal gewassen met 1X PBS, gevolgd door lysis in radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, VS) en centrifugatie bij 14,000 rpm gedurende 10 minuten bij 25 graden. De pellet (ongeveer 105 cellen) werd opgelost in 1 ml 1 N NaOH met 10 procent dimethylsulfoxide gedurende 2 uur bij 80 graden. De absorptie van het supernatant werd gemeten bij 470 nm. De melanineconcentratie in de monsters was afgeleid van een synthetische melanine (Sigma-Aldrich) standaardkromme. Elk monster werd genormaliseerd naar een totaal cellulair eiwitgehalte met behulp van de Pierce® BCA-methode (Thermo Scientific).
Meting van tyrosinase-activiteit
B16F10-cellen werden behandeld met 0-5 mg/ml GEB-extract of 400 µg/ml arbutine (een positieve controle) gedurende 72 uur na behandeling met/zonder 200 nM -MSH gedurende 24 uur. De cellen werden tweemaal gewassen met 1X PBS, gevolgd door lysis in RIPA lysisbuffer (Thermo Scientific) en centrifugatie bij 15,{10} rpm gedurende 20 min bij 4 graden. Het supernatant (100 μl) werd in een 96-putjesplaat geplaatst en gemengd met 100 μl 5 mM L-DOPA en 2 uur bij 37 graden geïncubeerd. De absorptie werd gemeten bij 420 nm. Elk monster werd genormaliseerd naar een totaal cellulair eiwitgehalte met behulp van de Pierce® BCA-methode (Thermo Scientific).
Analyse van real-time polymerasekettingreactie (real-time-PCR)
B16F10-cellen werden behandeld met 0-5 mg/ml GEB-extract of 400 µg/ml arbutine (een positieve controle) gedurende 72 uur na behandeling met/zonder 200 nM -MSH gedurende 24 uur. Het totale RNA van de cellen werd geïsoleerd met behulp van een Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) en een RNA-extractiekit (RNase Mini-kit; Qiagen, Hilden, Duitsland). Totaal RNA (2 ug) werd reverse getranscribeerd met behulp van een reverse transcription master premix (ELPIS, Daejeon, Korea). Realtime-PCR (LightCycler 96; Roche, Indianapolis, IN, VS) werd uitgevoerd met behulp van de primers: murine MITF forward 5'-GGCCAAGGGCAGAGCAACTT-3', backward 5'-GCCCATGGTGGCAAGCT-3'; tyrosinase voorwaarts 5′-ATAGGTGCATTGGCTTCTGG-3′, achterwaarts 5′-CCAACGATCCCATTTTTCTT-3′; Trp1 vooruit 5′-GAGTGACATCCTGTGGCTCA-3′, achteruit 5′-CGATACCCTGGGAACACTTT-3′; Trp2 vooruit 5′-GCATCTGTGGAAGGGTTGTT-3′, achteruit 5′-ACTCCTTCCTGAATGGGACC-3′; glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) voorwaarts 5′-TCAATGAAGGGGTCGTTGAT-3′, achterwaarts 5′-CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3′. De expressieniveaus waren genormaliseerd naar die van GAPDH.
Western blot-analyse
statistische analyse
RESULTATEN
Effecten van Gastrodia elata Blume (GEB) op de levensvatbaarheid van cellen in B16F10-cellen
Om de potentiële toxiciteit van GEB-extract te onderzoeken, evalueerden we eerst GEB-cytotoxiciteit door B16F10-cellen te incuberen met verschillende concentraties (0-25 mg/ml) GEB-extract na behandeling met/zonder 200 nM -MSH gedurende 24 uur. H. Ongeacht de -MSH-stimulatie werd de levensvatbaarheid van de cellen niet geremd door lage GEB-concentraties (0,5-5 mg/ml), terwijl hogere concentraties (10-25 mg/ml) significant toxiciteit induceerden (fig. 1). De levensvatbaarheid van de cellen bij 10 en 25 mg/ml GEB was respectievelijk 85,9 procent en 68,7 procent van de onbehandelde controle. De levensvatbaarheid van de cellen bij 10 en 25 mg/ml GEB na -MSH-stimulatie was respectievelijk 89,9 procent en 65,3 procent van de onbehandelde controle. Daarom werd in verdere experimenten een concentratie van 0-5 mg/ml gebruikt.
Effect van Gastrodia elata Blume (GEB) op melaninesynthese en tyrosinase-activiteit in B16F10-cellen
Om de melanogenese-activiteit van GEB-extract te beoordelen, hebben we het melaninegehalte gemeten in zowel -MSH-onbehandelde als -MSH-behandelde B16F10-cellen. De cellen werden voorbehandeld met/zonder -MSH gedurende 24 uur, gevolgd door behandeling met GEB-extract in doses van 0-5 mg/ml of 400 ug/ml arbutine gedurende 72 uur. GEB-behandeling verlaagde het cellulaire melaninegehalte significant op een dosisafhankelijke manier in hogere doses (2-5 mg/ml) in de met -MSH behandelde groepen en alle met -MSH onbehandelde groepen. -MSH alleen verhoogde het melaninegehalte met 180 procent in vergelijking met de controle, en GEB-behandeling remde duidelijk de melaninesynthese in de -MSH-geïnduceerde hyperpigmentatietoestand op een dosisafhankelijke manier in vergelijking met -MSH-onbehandelde groepen (Fig. 2).
Omdat tyrosinase het snelheidsbeperkende enzym is van de melaninesynthese, bepaalden we het remmende effect van GEB-extract op cellulaire tyrosinase-activiteit in B16F10-cellen. -MSH induceerde tyrosinase-activiteit met 171,2 procent in B16F10-cellen. Ongeacht de -MSH-behandeling remde GEB-extract de tyrosinase-activiteit aanzienlijk. Arbutine staat bekend als een remmer van melaninesynthese via de tyrosinaseroute [7], die significant werd geremd met 35-40 procent in vergelijking met onbehandelde controle in zowel de -MSH-onbehandelde als -MSH-behandelde groepen (Fig. 3) . Het melaninegehalte en de tyrosinase-activiteiten van GEB-extract bij 2 en 5 mg/ml waren vergelijkbaar met die van 400 µg/ml arbutine, wat suggereert dat GEB een dosisafhankelijke anti-melanogenese-activiteit vertoont tot het niveau van positieve controle en dat deze remming van melanogenese door GEB-extract is gerelateerd aan verminderde cellulaire tyrosinase-activiteit (fig. 3).
Effecten van Gastrodia elata Blume (GEB) op mRNA-niveaus en eiwitexpressie van MITF, tyrosinase, Trp1 en Trp2 in B16F10-cellen
Om te bepalen of de remming van melaninesynthese door GEB-extract geassocieerd was met melanogenese-gerelateerde genexpressie, voerden we real-time PCR uit om de mRNA-niveaus van MITF, tyrosinase, Trp1 en Trp2 te onderzoeken. mRNA-niveaus van al deze genen hadden de neiging om door GEB-extract op een dosisafhankelijke manier te worden verlaagd in zowel de -MSH-onbehandelde als -MSH-behandelde groepen, maar ze waren verwaarloosbaar in -MSH-onbehandelde cellen. Moleculaire niveaus van MITF, tyrosinase, Trp1 en Trp2 werden geremd bij lage GEB-concentraties (0.5-1 mg/ml) en werden duidelijk maar niet significant geremd bij hogere concentraties (2-5 mg /mL) in -MSH-onbehandelde cellen. -MSH induceerde duidelijk de mRNA-niveaus van deze genen, maar GEB-extract verminderde het. Zelfs in met -MSH behandelde cellen hadden lagere doses GEB-extract de neiging om de MITF-, tyrosinase-, Trp1- en Trp2-mRNA-niveaus te verlagen, terwijl hogere doses GEB-extract de mRNA-niveaus van al deze genen aanzienlijk remden. De remmingsniveaus van GEB-extract bij hogere doses waren vergelijkbaar met die van arbutine, een bekend huidblekend ingrediënt in cosmetica (fig. 4).
Verder evalueerden we de eiwitexpressie van deze transcriptiefactor en melanogene enzymen door western blot-analyse. -MSH-behandeling induceerde significant eiwitexpressie evenals mRNA-niveaus van al deze genen, die op een dosisafhankelijke manier werden teruggewonnen. Terwijl lagere doses GEB-extract de neiging hadden om -MSH-geïnduceerde eiwitexpressie van MITF, tyrosinase, Trp1 en Trp2 te verminderen, remden hogere doses significant al deze markers in met -MSH behandelde B16F10-cellen op een dosisafhankelijke manier. De remmingsniveaus van GEB-extract bij hogere doses waren even effectief als arbutine (Fig. 5).
DISCUSSIE
In deze studie hebben we ontdekt dat GEB-extract remmende activiteit heeft tegen melanogenese en de activiteit en moleculaire expressie van de relevante enzymen zoals MITF, tyrosinase, Trp1 en Trp2 in B16F1{4}}-melanoomcellen van muizen. GEB-extract in doses van 0.5-5 mg/ml remde melanogenese-gerelateerde markers op een dosisafhankelijke manier. Terwijl lagere doses (0,5-1 mg/ml) GEB-extract de neiging hadden om melanogenese, tyrosinase-activiteit, mRNA-niveaus en eiwitexpressie van MITF, tyrosinase, Trp1 en Trp2 te verminderen, terwijl hogere doses ({{12} } mg/ml) GEB-extract remde significant al deze markercellen op een dosisafhankelijke manier in zowel -MSH-onbehandeld als -MSH-behandeld B16F10. Deze remmende effecten van GEB-extract bij hogere concentraties waren vergelijkbaar met die van 400 ug/ml arbutine.
Melanine wordt gevormd uit L-tyrosine in de melanosomen en bepaalt de karakteristieke kleur van de huid, het haar en de ogen [1]. Hoewel melanine een beschermende rol speelt tegen ultraviolet (UV) licht en stress, leidt de overproductie en accumulatie van het melaninepigment tot hyperpigmentatie en verschillende huidproblemen zoals sproeten, ouderdomsvlekken en melasma bij zoogdieren [25]. Daarom is remming van melanogenese een punt van zorg geweest voor medicinale en cosmetische behandelingen van huiddepigmentatie en -verlichting. De binding van -MSH aan de melanocortine-1-receptor (MC1R) verhoogt het cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) en activeert vervolgens de MITF. MIFT reguleert effectief de expressie van melanogene enzymen, waaronder tyrosinase, Trp1 en Trp2, die structureel een 40-45 procent vergelijkbare identiteit delen [1,2]. Bovenal is tyrosinase-remming de meest gebruikelijke benadering om hypopigmentatie van de huid te bereiken, omdat dit enzym de snelheidsbeperkende stap van pigmentatie katalyseert. Zowel Trp1 als Trp2 zijn betrokken bij de daaruit voortvloeiende biosynthese van melanine [1,2].
Lee et al. [26] screende 100 plantenextracten voor cosmetisch gebruik door de remmende activiteiten van tyrosinase en DOPA auto-oxidatie te meten en rapporteerde dat veel plantenextracten zoals Gastrodia elata, Chaenomeles speciosa, Dryopteris crassirrhizoma, Glycyrrhizaglabra, Morusalba, Myristicafragrans, Rheum palmatum en Sophora japonica vertoonde remming van de tyrosinase-activiteit van paddenstoelen. Chen et al. [2] onderzocht ook 78 geneeskrachtige kruidenplanten en ontdekte dat de wortelstok van GEB de potentie heeft om de tyrosinase-activiteit te remmen. Hoewel GEB is gebruikt als een oosterse medicinale remedie om neurodegeneratieve aandoeningen te behandelen, is er een grote mogelijkheid om GEB te gebruiken als een tyrosinaseremmer uit deze screeningstudies.
Een recente studie [9] rapporteerde 64 GEB-componenten met behulp van verschillende chromatografietechnieken. Onder hen zijn de belangrijkste fenolverbindingen gastrodine [4-( -d-glucopyranosyloxy)benzylalcohol], 4-hydroxybenzylalcohol (4-HBA), 4-hydroxy- benzaldehyde, vanilline (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde), vanillylalcohol (4-(hydroxymethyl)-2-methoxyfenyl) en vanillinezuur (4-hydroxy{{14 }}methoxybenzoëzuur) [8-12]. Er zijn onlangs nieuwe natuurlijke verbindingen gevonden in GEB; bis (4- hydroxyfenyl)sulfide [2], Ergo [8] en diosgenine [17]. De structuur van hydrochinon en de belangrijkste fenolische verbindingen van GEB zijn vrij gelijkaardig [27]. De hydroxylgroep (-OH) van hydrochinon is gesubstitueerd met een hydroxymethylgroep (-CH2OH) in 4-HBA [27] en een carbonylgroep (-CHO) in 4-hydroxybenzaldehyde. Een methoxygroep (-OCH3) wordt respectievelijk toegevoegd aan hydrochinon om vanillylalcohol te vormen en aan 4-hydroxybenzaldehyde om vanilline te vormen. Vanillinezuur is een geoxideerde vorm van vanilline.
Recente studies meldden dat de meeste van deze verbindingen remmende activiteit uitoefenen tegen paddestoeltyrosinase en melanogenese in B16 [14,28] en HM3KO melanoomcellen [13], normale menselijke voorhuidfibroblasten [29] en in vivo zebravismodellen [2,29]. De geïsoleerde fenolfractie van met butanol geëxtraheerd GEB [14] oefende bijvoorbeeld remmende effecten uit op melanogenese door de activiteit van tyrosinase, Trp1 en Trp2 te verminderen, evenals de mRNA- en eiwitexpressie van deze enzymen. Gastrodin [15] en 4-HBA [16] onderdrukten de melanogenese door de tyrosinase-activiteit in B16-melanoomcellen te remmen. De hydroxylgroepen van gastrodine en 4-HBA hadden voornamelijk interactie met histidineresiduen op de actieve plaats van tyrosinase, wat leidde tot de remming van de tyrosinase-activiteit [30]. De zuurstof uit de fenolische OH van 4-HBA beïnvloedt de katalytische activiteit van tyrosinase door een nucleofiele aanval [31]. Hydroxy- en methoxygroepen van vanillinezuur en vanillylalcohol werken als remmers van de difenenolase-activiteit van tyrosinase [32] en vooral de omzetting van CH2OH in vanillylalcohol in -COOH (vanillinezuur), wat leidt tot een duidelijke toename van de tyrosinaseremming [32 ]. Vanillinezuur geïsoleerd uit Origanum vulgare verminderde cellulaire tyrosinase-activiteit, DOPA-oxidase en melanine-inhoud, evenals het neerwaarts reguleren van de expressie van MC1R, MITF, Trp1 en Trp2 in B16F10-cellen gestimuleerd met -MSH. Vanilline drukte geen remming van de tyrosinase-activiteit uit [29]. Onlangs fungeerde een natuurlijk product geïsoleerd uit GEB, bis(4-hydroxybenzyl)sulfide, als een sterke competitieve tyrosinaseremmer om de melaninesynthese in menselijke epidermale melanocyten en zebravismodellen te blokkeren door te laten zien dat het zwavelatoom van bis ({{ 33}}hydroxybenzyl)sulfide met koperionen in de actieve plaats van tyrosinase door computationele moleculaire modellering [2]. Deze resultaten suggereren dat een verscheidenheid aan fenolische verbindingen van GEB kunnen werken als tyrosinaseremmers door interactie met koperionen en/of histidineresiduen in de actieve plaats van tyrosinase.
Ergo en diosgenin werden geselecteerd als een van de top 10 botanische ingrediënten in de anti-verouderingscrèmes van 2010 [21]. Ergo is een natuurlijk, in water oplosbaar thiol-aminozuur [18,19], recent gevonden in GEB [8]. Bij fysiologische pH bestaat Ergo voornamelijk in de thion (= S) in plaats van de thiol (-SH) vorm [19]. De langzame afbraak, weerstand tegen disulfidevorming en auto-oxidatie maken het stabieler dan glutathion [18,19]. De aanwezigheid van de zwavel-gesubstitueerde imidazoolring in Ergo remde de activiteit van paddestoeltyrosinase op een dosisafhankelijke manier [33]. Een andere verbinding, diosgenine uit extract van wilde yam (Dioscorea villosa), heeft een depigmenterend effect en kan daarom worden gebruikt bij melasma, melanodermatitis en sun lentigo [34]. Een studie uitgevoerd op melanoomcellen heeft aangetoond dat het depigmenterende effect verband houdt met de activering van de cellulaire fosfatidylinositol- 4,5-bisfosfaat3-kinaseroute, wat suggereert dat diosgenine een effectieve remmer kan zijn van hyperpigmentatie [34]. Bovendien heeft het ontstekingsremmende en anti-verouderingseigenschappen door anti-collagenase-activiteit te induceren [35].
Er zijn ten minste drie mogelijke signaalroutes betrokken bij de regulatie van melanogenese; cAMP-afhankelijke, Wnt- en extracellulaire signaalgereguleerde kinase-signaleringsroutes [1]. Al deze signaalroutes reguleren melanogenese-gerelateerde enzymen, dwz tyrosinase, Trp1 en Trp2 via MITF-expressie en/of -activiteit [1]. De mogelijke betrokkenheid van deze signaalroutes bij de onderdrukking van melanogenese door GEB moet in de toekomst nog worden onderzocht.
BELANGENVERSTRENGELING
REFERENTIES
Voor meer informatie: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
