Interferentie van fenylethanoïdeglycosiden uit Cistanche Tubulosa met de MTT-test

1. Inleiding

De parasitaire plantCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceaefamilie) is wijd verspreid in Noord-Afrikaanse, Arabische en Aziatische landen [1]. De stamt af vanC. tubulosaEnC. deserticolazijn belangrijk in de traditionele Chinese geneeskunde, omdat ze worden gebruikt voor de behandeling van impotentie, onvruchtbaarheid, lumbago en constipatie als gevolg van colontraagheid [2]. Bovendien is het ethanolische extract vanC. tubulosaEr is aangetoond dat het een significant beschermend effect heeft tegen cerebrale hypoxie bij muizen [3].

Endotheelcellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van hypoxische pulmonale hypertensie. De EA.hy926 endotheelcellijn is aanzienlijk vergelijkbaar met primaire endotheelcellen. Tijdens ons onderzoek naar het anti-hypoxische effect van het ethanolische extract van C. tubulosa op EA.hy926-endotheelcellen merkten we dat de 3-(4,5-dimethylthiazool-2-yl){{7 }},5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test, die vaak wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen in onderzoeken naar cytotoxiciteit en cytostatische activiteit, genereerde tegenstrijdige resultaten door een verhoogde levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen na behandeling aan te tonen.

Een nauwkeurige beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen is essentieel om potentiële cytotoxische of cytoprotectieve effecten van een geneesmiddel te identificeren. We hebben daarom onderzocht welke componenten aanwezig in het ethanolische extract van C. tubulosa verantwoordelijk kunnen zijn voor de tegenstrijdige resultaten die zijn waargenomen met de MTT-test. We hebben er twee geïsoleerdfenylethanoïdeglycosiden (PhG's)uit ethanolisch extract van C. tubulosa,echinacoside (hierna verbinding 1) en acteoside (hierna verbinding 2). We bepaalden hun effect op de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen met behulp van verschillende methoden. Om verder te verduidelijken welke substituent van verbindingen 1 en 2 verantwoordelijk kan zijn voor de tegenstrijdige resultaten, hebben we bovendien hun aglyconen, cafeïnezuur (hierna verbinding 3) en 3,4-dihydroxylfenylethanol (hierna verbinding 4) getest op EA Levensvatbaarheid van .hy926-cellen met dezelfde methoden.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET REMMEN VAN APOPTOSE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Resultaten en discussie

2.1. Identificatie van verbindingen

De structuren van de twee verbindingen waaruit geïsoleerd isEthanolisch extract van C. tubulosawerden geïdentificeerd door analyses van kernspinresonantie (NMR) en massaspectrometrie (MS), zoals weergegeven in figuur 1. Verbinding 1 werd geïdentificeerd als echinacoside in vergelijking met eerder gerapporteerde NMR (tabel 1) en MS (m/z 785 [M−H ]−) gegevens [4]. De NMR-spectra van verbinding 2 waren zeer vergelijkbaar met die van verbinding 1, behalve de afwezigheid van een -D-glucopyranosylgroep (Tabel 1). Verbinding 2 (m/z 623 [M−H]−) werd geïdentificeerd alsacteoside[5]. Belangrijk is dat beide verbindingen hetzelfde aglycon bevatten, waaronder cafeïnezuur (verbinding 3) en 3,4-dihydroxylfenylethanol (verbinding 4).

2.2. Cellevensvatbaarheidstesten

MTT- en CCK{{0}}-testen werden gebruikt om het effect van verbindingen 1-4 op de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen te analyseren. De MTT-test toonde aan dat de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen significant toenam na behandeling met 25 en 50 μM verbindingen 1, 2 of 3 (166,3% en 174,1% voor verbinding 1, 205,8% en 224,3% voor verbinding 2, en 164,8% en 189,6% voor respectievelijk verbinding 3; p <0,05) in vergelijking met controlecellen (Figuur 2A). Bovendien heeft morfologische inspectie van de cellen vastgesteld dat behandeling met 50 μM verbinding 1, 2 of 3 de vorming van paarse formazankristallen verhoogde, die een directe indicatie zijn van het aandeel levende cellen (Figuur 3). Omgekeerd suggereerde de CCK-8-test dat de levensvatbaarheid van de cellen significant afnam na behandeling met 12,5, 25 en 50 μM verbinding 1, 2 of 3 (75,5%, 45,1% en 43,7% voor verbinding 1, 85,5%, 51,8% en 34,3% voor respectievelijk verbinding 2 en 64,5%, 48,2% en 36,4% voor verbinding 3, vergeleken met controlecellen (Figuur 2B). Verbinding 4 had geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen in de MTT- of CCK-8-test. De discrepantie tussen de resultaten verkregen met de twee testen suggereert dat een van de twee testen mogelijk niet nauwkeurig de effecten van verbindingen 1 en 2 op de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen weerspiegelt.

2.3. Apoptosebeoordeling door Hoechst

Kleuring Hoechst 33342 is een celdoorlaatbare DNA-kleuring die wordt geëxciteerd door ultraviolet licht en blauwe fluorescentie uitzendt bij 460 tot 490 nm. Het gecondenseerde chromatine van apoptotische cellen kleurt helderder dan het chromatine van normale cellen [6]. Terwijl controlecellen uniform verspreid chromatine, normale organellen en intacte celmembranen vertoonden, vertoonden cellen die 48 uur met 50 μM verbindingen 1, 2 of 3 waren geïncubeerd de typische kleuring van apoptotische cellen (Figuur 4A). Omgekeerd verhoogde blootstelling van cellen aan 50 μM verbinding 4 het aantal apoptotische kernen niet in vergelijking met de controlebehandeling.

2.4. Flowcytometrische analyse van apoptotische cellen

De dubbelkleuringstest met annexine V-FITC/PI identificeert apoptotische cellen door de binding met hoge affiniteit van annexine V-FITC aan fosfatidylserine, dat wordt geëxternaliseerd in cellen die apoptose ondergaan [7]. In deze test binden levensvatbare cellen niet aan annexine V of PI en worden daarom niet gekleurd (kwadrant linksonder), vroege apoptotische cellen worden groen gekleurd door de binding van annexine V-FITC (kwadrant rechtsonder), en late apoptotische cellen zijn groen en rood gekleurd door de binding van annexine V-FITC aan respectievelijk fosfatidylserine en PI aan necrotische cellen (kwadrant rechtsboven). Zoals weergegeven in Figuur 4B, namen cellen die 48 uur lang met 50 μM verbindingen 1, 2 of 3 waren geïncubeerd, het percentage apoptotische cellen toe van 3,74% (controlecellen) naar respectievelijk 10,32%, 12,95% en 11,30%. Vergeleken met controlecellen verhoogde verbinding 4 het percentage apoptotische EA.hy926-cellen niet.

In overeenstemming met de resultaten verkregen met de CCK-8-test en door Hoechst 33342-kleuring, toonde de flowcytometrietest aan dat verbindingen 1, 2 en 3 apoptose induceerden in EA.hy926-cellen. Alles bij elkaar suggereren deze waarnemingen dat de toename in de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen, waargenomen met de MTT-test na behandeling met verbindingen 1-3, een vals-positief resultaat vertegenwoordigde.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE IMMUNITEIT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Discussie

In 1983 ontwikkelde Mosmann een colorimetrische MTT-microtiterplaattest voor het meten van celproliferatie en cytotoxiciteit [8]. Deze eenvoudige test en de aanpassingen ervan worden nu op grote schaal gebruikt in celbiologische laboratoria over de hele wereld. Fractioneringsstudies in zoogdiercellen gaven aan dat de gereduceerde pyridine-nucleotide-cofactor, NADH, verantwoordelijk is voor de meeste MTT-reductie. Dit werd ondersteund door onderzoeken met hele cellen [9]. MTT-reductie wordt daarom geassocieerd met metabolisch actieve cellen en is niet alleen gekoppeld aan mitochondriale ademhaling, maar ook aan het cytoplasma en niet-mitochondriale membranen, waaronder het endosoom/lysosoomcompartiment en het plasmamembraan [10]. De netto positieve lading op het MTT-molecuul is de belangrijkste factor voor de cellulaire opname ervan via het plasmamembraanpotentieel.

Met name kan het voorkomen dat de MTT-test af en toe niet accuraat het daadwerkelijke effect weergeeft dat een geteste verbinding op specifieke cellen heeft. De chemische structuren of groepen die tegenstrijdige resultaten in de MTT-test kunnen veroorzaken, zijn echter niet geïdentificeerd. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat de MTT-test het antiproliferatieve effect van (-)-epigallocatechine-3-gallaat, het meest voorkomende polyfenol in groene thee, zou kunnen onderschatten [11]. In onderzoeken waarbij de MTT-test werd gebruikt om chemogevoeligheid van tumoren te detecteren, vertoonden chemotherapeutische middelen tegen kanker, zoals epirubicine, paclitaxel, docetaxel en imatinibmesylaat (Gleevec), een verhoogde levensvatbaarheid van de cellen [12,13]. Bovendien hebben verschillende onderzoeken gemeld dat bepaalde plantenextracten en redox-actieve polyfenolen de MTT-test zouden kunnen verstoren, omdat ze het MTT-tetrazoliumzout direct verminderen in afwezigheid van cellen [14].

De noodzaak om de MTT-formazankristallen op te lossen vóór spectrofotometrische analyse in een microplaatlezer en de inherente eindpuntaard van de reactie beperken het gebruik van de MTT-test tot bepaalde toepassingen. Dit leidde tot de ontwikkeling van tetrazolium-analogen waarin de fenylgroepen waren versierd met negatief geladen sulfonaatgroepen, zoals 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5- sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), een negatief geladen inwendig zout [15] en 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS), een zwak zuur inwendig zout dat nauw verwant is aan MTT [16] . Deze modificaties resulteerden in de productie van in kweekmedium oplosbare formazanproducten, waardoor de noodzaak van een solubilisatiestap vóór kwantificering werd geëlimineerd. Dienovereenkomstig, omdat de toegenomen negatieve lading op deze moleculen hun vermogen om door celmembranen te bewegen verminderde [17], werden intermediaire elektronenacceptoren (IEA), zoals 1-methoxy-5-methylfenazinemethylsulfaat ({{25} }}methoxy PMS) waren nodig om de reductie van de tetrazolkleurstof te vergemakkelijken of om de reductiesnelheid te verhogen.

Meer recentelijk is een nieuwe generatie wateroplosbare tetrazoliumzouten ontwikkeld waarvan WST-1 het prototype is [18]. WST-1, een negatief geladen gedisulfoneerd inwendig zout dat een jodiumresidu bevat, is stabieler dan XTT en MTS in aanwezigheid van 1-methoxy PMS, het is verplicht IEA. Dit leidde tot de marketing van WST-1/1-methoxy PMS als een handige kit voor celproliferatie met enkelvoudig reagens. Er zijn verschillende andere tetrazoliumzouten in de WST-serie ontwikkeld, waarvan WST misschien wel de meest bruikbare is-8 [19]. WST-8 lijkt zeer vergelijkbare cellulaire reductie-eigenschappen te hebben als WST-1 en wordt onafhankelijk op de markt gebracht als de CCK-8-test. WST-8 is ondoordringbaar voor cellen en wordt daarom extracellulair gereduceerd, via elektronentransport van intracellulair NADH naar WST-8 door het plasmamembraan, gemedieerd door 1-methoxy PMS. Hoewel zowel MTT- als WST-8/1-methoxy-PMS-reductie worden aangestuurd door intracellulaire NADH, lijkt de bron van NADH binnen deze twee methoden te verschillen. WST-8/1-methoxy PMS-reductie is in sterkere mate afhankelijk van de malaat/aspartaat-shuttle die de mitochondriale tricarbonzuurcyclus-NADH verbindt met de extramitochondriale ruimte [20].

In voorlopige experimenten bevestigden we dat verbindingen 1, 2, 3 en 4 het MTT-tetrazoliumzout niet direct konden verminderen (niet getoond). In het huidige onderzoek werd de directe invloed van de verbindingen zelf op het reagens geëlimineerd door de microplaten zorgvuldig te wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat MTT- of CCK-8-oplossing werd toegevoegd, zoals aangegeven in de protocollen van de fabrikant. Niettemin waren de resultaten verkregen met behulp van de twee methoden nog steeds tegenstrijdig (Figuur 2). Zoals verwacht verhoogde incubatie van cellen met verbindingen 1, 2 en 3 de reductie van het tetrazoliumzout tot paars formazan, vergeleken met de controlegroep (Figuur 3), wat suggereert dat louter reductie van het tetrazoliumzout in de aanwezigheid van een specifieke verbinding is niet voldoende om het vermogen van de verbinding om de MTT-test te verstoren te beoordelen.

Om te bepalen of verbindingen 1, 2, 3 en 4 apoptose in EA.hy926-cellen konden induceren, werden cellulaire morfologische veranderingen en externalisatie van fosfatidylserine beoordeeld. In overeenstemming met de afname van de cellulaire levensvatbaarheid waargenomen met de CCK-8-test, suggereerden de resultaten van Hoechst-kleuring en flowcytometrie-analyse met behulp van annexine V-FITC/PI dat de groeiremming die werd waargenomen na behandeling met verbinding 1, 2 en 3 ten minste gedeeltelijk te wijten aan apoptose van EA.hy926-cellen. Onze resultaten ondersteunden ook het idee dat de caffeylgroep die aanwezig is in zowel verbindingen 1 als 2 verantwoordelijk was voor de tegenstrijdige resultaten verkregen met de MTT-test.

Vergelijkbaar met onze bevindingen vertoonde Rottlerin, een krachtige kaliumkanaalopener met grote geleiding, in vitro geen reactiviteit ten opzichte van MTT. Het versterkte echter sterk de vorming van formazankristallen in cellen, een resultaat dat duidelijk in strijd was met Rottlerin-remming van NF-KB en celproliferatie waargenomen door analyse van [3H]-thymidine-opname in DNA [21]. Het mechanisme waarmee Rottlerin de MTT-reductie versterkte, werd toegeschreven aan het mitochondriale ontkoppelingseffect [22]. Rottlerin heeft een cinnamoylzuursubstituentgroep. Vergeleken met cinnamoylzuur bezit verbinding 3 twee extra hydroxylresten, die zich bevinden op C-3 en C-4. Daarom speculeren we dat het mechanisme waarmee verbindingen 1 en 2 tegenstrijdige resultaten veroorzaken in de MTT-test ook geassocieerd kan zijn met hun mitochondriale ontkoppelingseffecten. Om deze hypothese te testen zijn vergelijkende studies tussen verbindingen 1 en 2, en een chemische ontkoppelaar, zoals trifluorcarbonylcyanide fenylhydrazon (FCCP), nodig.

 NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Experimenteel gedeelte

3.1. Reagentia en chemicaliën

Verbinding 3 (cafeïnezuur-poeder, zuiverheid=98,6%) werd gekocht bij Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). Verbinding 4 (3,4-dihydroxylfenylethanol-olie, zuiverheid=98,5%) werd verkregen van Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). MTT en dimethylsulfoxide (DMSO) werden verkregen bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). De CCK-8-test werd gekocht bij Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan). Hoechst 33342 en annexine V-FITC / PI-apoptosedetectiekits werden gekocht bij het Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China).

3.2. Plantaardig materiaal

C. tubulosastengels werden verzameld in de prefectuur Yutian, de autonome regio Xinjiang Uygur, China. Vouchermonsters werden gedeponeerd in het Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, China) en geauthenticeerd door Yi Zhang van Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, China).

3.3. Extractie en isolatie van plantmateriaal

Aan de lucht gedroogde C. tubulosa-stelen (0,6 kg) werden verpoederd en gedurende 2 uur bij 70 graden geëxtraheerd met 50% ethanol. Na verwijdering van het oplosmiddel onder verlaagde druk werd het ethanolische extract (212,5 g) opgelost en gesuspendeerd in water (2 L) en geëxtraheerd met n-butanol (2 L x 3). Het n-butanolextract (110 g) werd gechromatografeerd op een polyamidekolom en geëlueerd met ethanol/water (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), waardoor vijf fracties (A-E) werden geproduceerd. . Fractie B (65 g) werd gefractioneerd op een ODS-kolom; elutie met ethanol:water (1:9) scheidde verbinding 1 (3 g). Fractie D (10,5 g) werd gefractioneerd op een ODS-kolom; elutie met ethanol/water (1:4) scheidde verbinding 2 (1 g).

NMR-spectra werden opgenomen op een Bruker Avance 600 spectrometer in CD3OD met tetramethylsilaan (TMS) als de interne standaard. Massaspectra werden uitgevoerd op een BioTOF-Q massaspectrometer.

3.4. Cel cultuur

EA.hy926-cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA, VS). Cellen werden gekweekt in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum en 1% (v/v) penicilline-streptomycine in een bevochtigde omgeving met 5% CO2 bij 37 graden.

3.5. Levensvatbaarheid van de cellen

De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld met behulp van de MTT- en CCK{{0}}-testen. Verbindingen 1 en 2, en hun aglyconen, cafeïnezuur (3) en 3,4-dihydroxylfenylethanol (4) werden opgelost in DMSO tot de uiteindelijke DMSO-concentratie < 0,1% (v/v) in kweekmedia.

EA.hy926-cellen werden uitgezaaid op 96-putjesplaten met 4 x 103 cellen/putje. Na 24 uur incubatie werden de cellen gedurende 24 uur behandeld met 6,25-50 μM verbinding 1, 2, 3 of 4. Het kweekmedium werd verwijderd en de cellen werden tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Porties (10 μl) voorraad-MTT-oplossing (5 mg·ml-1) werden toegevoegd aan elk putje dat 100 μl medium bevatte en gedurende 4 uur met cellen geïncubeerd. Na incubatie werd het medium verwijderd en werden aliquots van 150 μl DMSO aan elk putje toegevoegd om de formazankristallen oplosbaar te maken. De absorptie werd gemeten bij 490 nm met behulp van een microplaatlezer (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, VS). De levensvatbaarheid van de cellen werd uitgedrukt als het percentage MTT-reductie, waarbij de waarde van 100% werd toegewezen aan de absorptie van de controlecellen. Alle experimenten werden driemaal uitgevoerd en gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking (SD).

De CCK-8-test werd uitgevoerd volgens de literatuur met kleine aanpassingen [23]. Concreet werden de cellen gedurende 24 uur behandeld met 6,25-50 μM verbindingen 1, 2, 3 of 4 en tweemaal gewassen met PBS vóór de toevoeging van 10 μl CCK-8-oplossing en 100 μl kweekmedia. Na 2 uur incuberen van de microplaat bij 37 graden werd de absorptie gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer. De levensvatbaarheid van de cellen werd uitgedrukt als het percentage levensvatbare cellen ten opzichte van controlecellen (100%). Alle experimenten werden driemaal uitgevoerd en uitgedrukt als gemiddelde ± SD.

3.6. Apoptosebeoordeling door Hoechst 33342 Kleuring

Apoptotische morfologische veranderingen werden waargenomen door kleuring met Hoechst 33342. In het kort werden EA.hy926-cellen gezaaid op 48- putjesplaten (2 x 104 cellen / putje) en behandeld met 50 μM verbinding 1, 2, 3 of 4 gedurende 48 uur bij 37 graden, tweemaal gewassen met PBS, en gefixeerd met 4% (v/v) paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na tweemaal spoelen met PBS werden de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur gekleurd met Hoechst 33342 (10 ug · ml-1) en tweemaal gewassen met PBS. Hoechst-gekleurde kernen werden zichtbaar gemaakt met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Olympus, Tokio, Japan).

3.7. Apoptose-analyse door flowcytometrie

Apoptotische cellen werden gedetecteerd door annexine V-FITC/PI dubbele kleuring en flowcytometrie-analyse. In het kort: na behandeling met 50 μM verbinding 1, 2, 3 of 4 gedurende 48 uur werden de cellen geoogst en opnieuw gesuspendeerd in PBS bij 1 x 105 cellen·ml−1. Na 5 minuten centrifugeren bij 500 x g bij 25 graden werden 195 μl annexine V-FITC-bindingsbuffer en 5 μl annexine V-FITC toegevoegd. Na voorzichtig vortexen werd het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Na 5 minuten centrifugeren bij 500 x g bij 25 graden werd 190 μl FITC-geconjugeerde annexine V-bindingsbuffer en 10 μl PI toegevoegd. Na voorzichtig vortexmengen werden monsters binnen 30 minuten geanalyseerd met behulp van een FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, VS).

3.8. Statistische analyse

Alle experimentele gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. De significantie van de verschillen tussen experimentele monsters en de overeenkomstige controle werd beoordeeld door middel van eenwegsvariantieanalyse (ANOVA) met behulp van de SPSS-software (versie 11.5). De statistische significantie werd vastgesteld op p < 0.05.

4. Conclusies

Onze resultaten suggereren dat een overschatting van het aantal levensvatbare cellen waargenomen in de MTT-test de cytotoxiciteit van bepaalde verbindingen zou kunnen maskeren. Daarom raden we aan om tijdens de screening van geneesmiddelen verschillende methoden te gebruiken om het effect van de specifieke verbinding op de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen (zoals CCK-8 en 3H-TdR-testen) om te voorkomen dat er misleidende resultaten worden gegenereerd.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET BEVORDEREN VAN TESTOSTERONAFSCHEIDING PHGS75% ECH 30% ACT 12%