Evaluatie van het darmtransport van een fenylethanoïdeglycosiderijk extract uit Cistanche Deserticola door het Caco-2-celmonolaagmodel

Invoering

De Caco-2-cellijn, die is afgeleid van menselijke colonadenocarcinomen, vertoont enterocytachtige kenmerken. Onder normale omstandigheden differentiëren Caco-2-cellen spontaan van volwassen cellen en vormen ze intacte monolagen. De aangrenzende cellen hechten zich via nauwe verbindingen gevormd aan de apicale zijde van de monolaag, die passief onderscheid kunnen maken tussen de cellen.en transporteerden actief medicijnen door de epitheellaag. Vanwege de morfologische en biochemische gelijkenis met normale enterocyten dienen Caco-2 celmonolagen als een algemeen geaccepteerd in vitro model voor de studie van het intestinale absorptiepotentieel en de transportkarakteristieken van geneesmiddelen.

In tegenstelling tot chemicaliën zijn plantenextracten (PE) mengsels waarvan de biologische activiteit en actieve bestanddelen vaak niet goed geïdentificeerd zijn. Bovendien zijn de darmtransporteigenschappen van PE, in tegenstelling tot de eigenschappen van de bestanddelen ervan, nauw verwant aan klinisch gebruik. Fluxmetingen voor een testmonster over een monolaag van Caco-2-cellen omvatten gewoonlijk chemische methoden, zoals HPLC, LC/MS, enz. Hoewel deze methoden krachtige hulpmiddelen zijn, zijn ze complex, tijdrovend, duur en soms geavanceerde apparatuur vereisen. Belangrijker nog is dat noch een enkele component, noch een minderheidscomponent PE als geheel kan weerspiegelen. Er moet dus een nieuwe aanpak worden ontwikkeld, onafhankelijk van de bepaling van de bestanddelen, om de transporteigenschappen van PE te identificeren en evalueren.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), een holoparasitaire plant, is een veelgebruikt traditioneel Chinees medicijn dat voornamelijk wordt gebruikt voor de behandeling van nierdeficiëntie, lichaamszwakte en obstipatie, en deze toepassingen zijn officieel vastgelegd in de Chinese Farmacopee.Fenylethaanglycosiden (PhG's), waaronder echinacoside (EC), acteoside (AC) en isoacteoside (IS), enz., zijn een klasse polyfenolische verbindingen. Ze worden beschouwd als een van de belangrijkste bioactieve bestanddelen van Cistanche-soorten. Farmacologische onderzoeken hebben aangetoond dat de bioactiviteit van PhG's divers is en antioxidatieve, antivermoeidheids-, hepatoprotectieve, immuunmodulerende, ontstekingsremmende en neuroprotectieve effecten omvat. De darmtransporteigenschappen van PhGs zijn echter niet onderzocht. In deze studie onderzochten we de darmpermeabiliteit van een PhG-rijk extract (PRE) van CD als een geïntegreerd systeem en de permeabiliteit van drie belangrijke PhG's (AC, IS en EC) in gedifferentieerde Caco-2-cellen. Onze resultaten gaven aan dat PRE voornamelijk wordt getransporteerd via slecht geabsorbeerde passieve diffusie langs een concentratiegradiënt zonder efflux, wat de farmacokinetische basis vormt voor de klinische toepassing van PhG's bij de ziekte van Crohn.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materialen en methodes

Materialen

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) werd gekocht bij Must Biotechnology Co. (Chengdu, China). Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS) en niet-essentiële aminozuren (NEAA) werden geproduceerd door Gibco BRL (Grand Island, NY, VS). 6-TranswellTM-platen met putjes (groeioppervlak van het inzetmembraan 4,67 cm2) werden verkregen van Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, VS). Rattenstaartcollageen werd verkregen van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Alle reagentia en chemicaliën voor de HPLC-analyse waren van analytische kwaliteit.

Voorbereiding van PRE vanaf CD

Het aan de lucht gedroogde CD-materiaal werd verpoederd en geëxtraheerd door percolatie met 70% ethanol. De PhG-rijke fractie werd bereid zoals eerder beschreven en geëxtraheerd met waterverzadigde n-butylalcohol. De extractvloeistof werd geconcentreerd en onder verminderde druk gedroogd. Macroporeuze hars-UV-spectrofotometrie mat een PhG-gehalte van 78,4%. Het uiteindelijke monster vertegenwoordigde een opbrengst aan grondstof van 1,75% op basis van droog gewicht. Het verkregen monster werd tot verder gebruik bij -20 graden bewaard.

Bepaling van AC, IS en EC door middel van HPLC

Een Shimadzu HPLC-systeem uitgerust met LC-oplossingssoftware werd gebruikt om de inhoud van AC, IS en EC in PRE te testen. Een Intersil C18-kolom met omgekeerde fase (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) werd gebruikt en op kamertemperatuur gehouden. De mobiele fasen waren acetonitril en water dat 0,1% fosforzuur (v/v) bevatte met gradiëntelutie (Tabel 1) bij een stroomsnelheid van 1,0 ml/min. De UV-spectrofotometerdetector werd ingesteld op 334 nm. Om de flux van AC en IS nauwkeurig te bepalen, hebben we een nieuwe HPLC-fluorescentiedetectiemethode (HPLC-FLD) ontwikkeld. Na een structurele analyse en fluorescentiegolflengtescanning (gegevens niet getoond), verkregen we de optimale fluorescentiedetectieomstandigheden voor AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) en IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm).

De HPLC-analysemethode werd gevalideerd met behulp van de volgende prestatiekenmerken: stabiliteit, lineariteit, gevoeligheid, precisie (variabiliteit binnen en tussen de dagen) en nauwkeurigheid. De analyten in de transportbuffer werden 24 uur in het donker bij 25 graden bewaard en hun stabiliteit werd gemeten. De analyten waren zeer stabiel in de aanwezigheid van vitamine C (0,4%) omdat de waarden van de relatieve standaardafwijking (RSD) in de piekgebieden <3,5% waren. De lineaire regressievergelijking, correlatiecoëfficiënt, bereik van lineariteit, LOD en LOQ voor AC, IS en EC worden weergegeven in Tabel 2. De LOD's (18–30 nM) en LOQ's (60–100 nM) waarden illustreren dat de HPLC-FLD- en HPLC-UV-methoden zeer gevoelig zijn. De RSD-waarden die de precisie van de methode uitdrukken waren allemaal < 2% voor de intra- en inter-day variabiliteit, wat wijst op een goede precisie. Voor herstelevaluatie werden AC, IS en EC aan de transportbuffer toegevoegd om drie (hoge, gemiddelde en lage) concentratieniveaus op te leveren. De terugwinningswaarden van de methode voor de analyten zijn samengevat in Tabel 3. De gemiddelde terugwinningswaarden varieerden van 90,0% tot 96,4%, wat wijst op een goede nauwkeurigheid. Concluderend zijn de gevestigde HPLC-methoden bevredigend wat betreft lineariteit, gevoeligheid, precisie en nauwkeurigheid voor de kwantificering van AC, IS en EC in transportbuffer.

Bepaling van PRE door middel van een bioassaysysteem

De bioassay (totale anti-oxidatieve capaciteit) was gebaseerd op de FRAP-test (ferric reduction/antioxidant power) die we eerder beschreven [16] en gevalideerd in termen van lineariteit en precisie (variabiliteit binnen en tussen de dagen). Op basis van de kalibratiecurven werd de lineariteit van de bioassaymethode bepaald. Het lineaire concentratiebereik was 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). De nauwkeurigheid van de gevestigde bioassaymethode werd bepaald in termen van de intra- en inter-day variabiliteit voor een analyse van PRE (10,0 ug/ml). De herhaalbaarheid binnen de dag van de methode werd bepaald op basis van vijf opeenvolgende bepalingen op dezelfde dag. De herhaalbaarheid tussen de dagen werd gemeten op basis van vijf opeenvolgende bepalingen op drie verschillende dagen. De RSD-waarden voor de nauwkeurigheid van de methode waren respectievelijk 1,014% en 4,72% voor intra- en inter-day variabiliteit, wat wijst op een goede nauwkeurigheid. De gevestigde bioassaymethode is dus bevredigend wat betreft lineariteit, precisie en nauwkeurigheid voor de kwantificering van PRE in een transportbuffer.

Cel cultuur

Caco{{0}} cellen werden gekweekt bij 37 graden en 95% relatieve vochtigheid in een atmosfeer die 5% CO2 bevatte en een medium bestaande uit DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamine, penicilline (100 U/ml) en streptomycine (100 ug/ml). Het medium werd om de dag vervangen tijdens celgroei en differentiatie. De cellen werden gekweekt in plastic flessen van 75- cm2 en elke 3-5 dagen geoogst met 0,05% EDTA-trypsine. Voor de transportexperimenten werden de cellen uitgezaaid met een dichtheid van 1 x 105 cellen/cm2 op Transwell-inserts bedekt met collageen. Ongeveer 21 dagen na het zaaien werden de monolagen gebruikt voor de transportexperimenten. Hun integriteit werd bepaald door het meten van de trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) over de monolagen met een EVOM uitgerust met ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., VS). De TEER-waarden van de Caco-2 celmonolaag moesten groter zijn dan 500 O∙cm2.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR VERZACHTEND EN LAXEREND PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Transportexperimenten

De monolaag werd gewassen met transportbuffer (P-buffer met 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM glucose, 3 mM CaCl2 en 145 mM NaCl, pH 7,4) en vervolgens gedurende 20 minuten voorgeïncubeerd. op 37 graden. Na het verwijderen van de transportbuffer werd verse transportbuffer met testmonsters toegevoegd aan de apicale (AP) kamer (1,5 ml) in AP naar basolaterale (BL) directionele onderzoeken of de BL-kamer (2,5 ml) in BL naar AP directionele onderzoeken. Voor AC-, IS- en EC-testen met behulp van HPLC werd met verschillende tijdsintervallen (30, 60, 90 en 120 minuten) een hoeveelheid (300 µl) uit elke ontvangstkamer verwijderd. De opvangkamer werd na elke bemonstering aangevuld met hetzelfde volume verse, voorverwarmde (37 graden) transportbuffer. De verzamelde monsters werden voor verder gebruik bij -20 graden bewaard. Voor PRE-bepaling met behulp van bioassay werden alleen de monsters na 120 minuten genomen. Vanwege de instabiliteit van PRE, AC, IS en EC werd 0,4% (w/v) vitamine C toegevoegd om de monsters te stabiliseren en de AC-, IS- en EC-gehalten met HPLC te bepalen, en de monsters voor de PRE-bioassay werden onmiddellijk na bemonstering getest. De waarde van de schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (Papp of 'Papp) van elk monster werd berekend.

Gegevensanalyse

De Papp-waarden in de AP BL- of BLAP-richtingen van AC, IS en EC werden berekend op basis van de volgende vergelijking: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), waarbij Papp de schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt (cm/s) is, bepaald met HPLC. (4Q/4t) is de snelheid waarmee de testverbinding (AC, IS of EC) aan de ontvangerzijde verschijnt (μmol/s); A is de oppervlakte van het inzetstuk (cm2); C0 is de initiële concentratie van de teststof aan de donorzijde (μmol/ml). Concreet werd de massa-eenheid "ug" gebruikt in plaats van "μmol" toen de 'Papp-waarden werden berekend. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD.

Resultaten

Compositie van AC, IS en EC in PRE vanaf CD

Omdat AC, IS en EC als de belangrijkste bioactieve stoffen worden beschouwdPhG's van Cistanche-soortenanalyseerden we hun inhoud in PRE via HPLC-UV. Het representatieve chromatogram wordt getoond in figuur 1. De identificatie van deze bestanddelen was gebaseerd op het vergelijken van de retentietijden en het UV-spectrum met die van authentieke standaarden bij een golflengte van 334 nm. De gehalten aan AC, IS en EC in PRE waren respectievelijk 26,60%, 1,84% en 32,83%. Deze drie verbindingen zijn dus verantwoordelijk voor 61,27% van PRE; bovendien geven de bovenstaande resultaten aan dat het PhG-gehalte in PRE 78,4% bedraagt. Daarom zijn AC, IS en EC goed voor ongeveer 80% van de PhG's in PRE.

Totale anti-oxidatieve capaciteiten van PRE, AC, IS en EC

Studies van deantioxidatieve activiteit van PhG'svan CD zijn gerapporteerd, en AC, IS en EC zijn verantwoordelijk voor ongeveer 80% van de PhG's in PRE. Zo werden de totale antioxidatieve capaciteiten van PRE, AC, IS en EC getest en uitgedrukt met behulp van de FRAP-waarden (× 10–6 mmol). Zoals weergegeven in figuur 2 waren, toen de FRAP-waarde 8 x 10–6 mmol was, de eindconcentraties van PRE, AC, IS en EC 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml en 4,89 ug/ml. /ml, wat aangeeft dat de totale anti-oxidatieve capaciteit van deze vier monsters als volgt gerangschikt is: AC > EC > PRE > IS. De bioactiviteit van PRE wordt toegeschreven aan de actieve ingrediëntgroepen (AIG). Voor ongeveer 60% van PRE vertoonden AC en EC een sterkere totale anti-oxidatieve activiteit dan PRE en IS. Omdat IS (1,84%) een zeer klein deel van PRE uitmaakt, zijn ook andere componenten, zoals het zwak antioxidatieve IS, duidelijk actief in PRE. Verrassend genoeg verschilde de totale anti-oxidatieve activiteit bijna 7-voudig tussen AC en zijn isomeer IS, wat aangeeft dat niet alleen het aantal fenolische hydroxylgroepen maar ook de positie van fenolische hydroxylgroepen in het molecuul het anti-oxidatieve effect beïnvloedde. .

Validatie van de Caco-2 monolagen

Om het monolaagsysteem van Caco-2-cellen te valideren, werden de Papp-waarden van propranolol (een goed getransporteerde marker) en Lucifer geel (een slecht getransporteerde marker) van de AP naar de BL over de Caco-2 monolagen bepaald bepaald als respectievelijk 1,51 x 10–5 cm/s en 2,8 x 10–7 cm/s, en deze waarden kwamen overeen met die gepubliceerd in eerdere rapporten. De alkalische fosfatase-activiteitstest bevestigde ook dat de monolagen van Caco-2-cellen kwalitatief vergelijkbaar waren met het epitheel van de dunne darm.

De permeabiliteit van AC, IS en EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), terwijl die van slecht geabsorbeerde geneesmiddelen laag waren (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

De permeabiliteit van PRE

De bovenstaande resultaten geven aan dat het totale anti-oxidatieve vermogen van PRE ten minste te danken is aan 61,27% AIG uit PRE. Daarom evalueerden we de TR van PRE op basis van de concentratie-effectcurve van de totale anti-oxidatieve capaciteit en berekenden we de 'Papp-waarden om de transportkarakteristieken van PRE weer te geven. De 'Papp-waarden van PRE voor AP!BL en BL!AP waren (2,16 ± 0.26) × 10–7 cm/s en (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, respectievelijk, wat aangeeft dat deze verbinding slecht permeabel was. Bovendien was efflux of actief transport niet duidelijk omdat de verhouding 'Papp BL tot AP / 'Papp AP tot BL voor PRE 1,45 was. Bovendien nam de bidirectionele TR van PRE lineair toe tussen ongeveer 300 en 900 ug/ml (Fig. 5). Het gebrek aan richtingsvoorkeur van de resultaten suggereert dat passieve diffusie het belangrijkste transportmechanisme van PRE is.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE IMMUNITEIT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Discussie

Vergeleken met sterk gezuiverde geneesmiddelen bestaat PE doorgaans uit mengsels die bestaan ​​uit honderden bestanddelen met sterk verschillende fysiochemische eigenschappen. Daarom oefent PE systematische, multitarget en multichannel synergetische actie uit vanwege hun complexe AIG [21], wat de analyse van de transportkarakteristieken van PE belemmert. Om de transporteigenschappen van PE wetenschappelijker te beoordelen, hebben sommige onderzoekers meerdere componenten in PE geïdentificeerd in plaats van één enkele component [22-24]. Niettemin kan een beperkt aantal bestanddelen de PE als geheel niet weerspiegelen. Het bepalen van alle componenten in PE is echter onmogelijk. Bovendien, als diverse componenten in PE totaal verschillende transporteigenschappen vertonen, zullen de holistische transportkenmerken van PE moeilijk te identificeren zijn.

In de jaren negentig werden bioassaysystemen gebruikt om de TR van antimicrobiële middelen te evalueren [25]. In 2005 hadden Eguchi en zijn collega's [26] de antioxidatieve activiteit van wortelextract geëvalueerd met behulp van BL-media uit gedifferentieerde Caco-2-cellen; deze benadering is geschikter om in vivo situaties weer te geven.

Gebaseerd op een eerder rapport over de activiteit van PhG's en onze resultaten (Fig. 2), kan de TR van AIG in PRE worden geëvalueerd door de totale anti-oxidatieve capaciteit van het medium in de ontvangstkamer te bepalen. Na de transportexperimenten ontdekten we dat de TR van PRE in beide richtingen vergelijkbaar was, en dat dit transport onverzadigd en slecht geabsorbeerd was ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), en dat gebeurde niet. duiden op efflux, wat suggereert dat passieve diffusie langs een concentratiegradiënt het belangrijkste transportmechanisme van PRE is (Fig. 5). Bovendien zijn de transporteigenschappen van PRE consistent met die van AC, IS en EC, de effectieve componenten die antioxidatieve activiteit vertonen in PRE (Fig. 4 en Tabel 4). Dit resultaat werd verwacht en gaf aan dat het huidige bioassaysysteem geschikt en betrouwbaar is voor de evaluatie van de transportkarakteristieken van AIG in PRE in gedifferentieerde Caco-2 cellen.

In tegenstelling tot de canonieke Papp-waarde, die gewoonlijk wordt gebruikt om het transport van een enkele verbinding weer te geven, weerspiegelt de 'Papp-waarde verkregen uit de TR op basis van de concentratie-effectcurve mogelijk niet alleen de componenten die monolagen met een intacte structuur binnendringen, maar ook er zijn ook andere factoren betrokken die verband houden met de doelactiviteit, zoals de metabolieten van de componenten, chemisch afgebroken producten en zelfs sommige cytokinen die worden uitgescheiden door Caco-2-cellen als reactie op stimulatie en die de bioactiviteit van het doel kunnen beïnvloeden. De hierboven genoemde multifactor bepaalt dus, en niet alleen de vervoerde intacte componenten, de 'Papp-waarde'. Daarom kan 'Papp sterker correleren met in vivo situaties dan de canonieke Papp-waarde. In deze studie hebben we de passief verspreide en slecht geabsorbeerde aard van PRE verduidelijkt op basis van de 'Papp-waarde', en deze aard kan verband houden met de hoge dosering en de lange klinische behandelingsperiode van CD. Niettemin zullen deze bevindingen artsen een meer systematische leidraad bieden bij de toepassing van coeliakie als alleen de transportkenmerken van de meeste AIG bij coeliakie, en niet alleen van PhG's, zijn geïdentificeerd.

Het geselecteerde bioactiviteitsitem moet echter voldoende gevoelig zijn om te worden gedetecteerd in het medium van de ontvangstkamer, wat een uitdaging vormt voor het opzetten van een bioassaysysteem om de transporteigenschappen van PE te evalueren. Bovendien moet de bioactiviteit ook afhankelijk zijn van zoveel mogelijk componenten. In onze studie was de bepaling van het totale anti-oxidatieve vermogen geschikter dan verschillende andere methoden (S1 Fig.). Maar toch kan onze test de TR van PRE pas na 120 minuten detecteren.

Gezamenlijk heeft de huidige studie een nieuw bioassaysysteem opgezet om de darmpermeabiliteit van PRE in gedifferentieerde Caco-2-cellen te evalueren. De verkregen resultaten toonden aan dat een slecht geabsorbeerde passieve diffusie langs een concentratiegradiënt zonder efflux het belangrijkste transportmechanisme van PRE is (Fig. 5), dat de farmacokinetische basis verschaft voor de klinische toepassing van PhGs bij de ziekte van Crohn. Het gebruik van een nieuw bioassaysysteem om de TR te evalueren en daardoor de 'Papp-waarden' te berekenen om de darmtransporteigenschap van AIG in PE's te beoordelen, is haalbaar. Deze aanpak kan ook geschikt zijn voor andere PE, gegeven de juiste bioactiviteit.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%