Ishophloroglucin A geïsoleerd uit Ishige Okamurae onderdrukt melanogenese geïnduceerd door -MSH: in vitro en in vivo deel 2

3. Discussie

sdasdad

De verbinding DPHC geïsoleerd uit IOE had al tyrosinase-remmend gemeldactiviteit en beschermend effecttegen door UV-B-straling veroorzaakte celbeschadigingin vitro[8]; Echter,het anti-melanogenese-effectvan de componenten afgeleid van IOE in silico door interactie mettyrosinase,in vivoin fenotypestudies in diermodellen, en hun onderliggende moleculaire mechanismen,zijn nog niet onderzocht. In de huidige studie hebben we de anti-melanogenese en tyrosinase bepaaldremmende activiteiten van IPA, een florotannine geïsoleerd uit IO en IOE, in een gewerveld model van de zebravisin vivo en in B16F10-melanoomcellen in vitro, na inductie met -MSH.

Behandeling met Van MSH is bekend dat het melaninesynthese en tyrosinase-activiteit induceert [20]. Bovendien is aangetoond dat tyrosinase essentieel is voor melanogenese [29]. Eerdere studieshebben aangetoond dat moleculaire koppeling kan worden gebruikt om de remmende activiteit van tyrosinase te evalueren [30,31]. Daarom werden moleculaire docking-berekeningen uitgevoerd om het bindingsmodel van IPA te begrijpenen DPHC, een bekend polyfenol geïsoleerd uit IO, dat een hogere bindingsenergie heeft onthuld inanti-melanogenese-activiteit dan arbutine, als een positieve controle. Volgens de resultaten (figuur1), IPA onthulde de laagste dockingscores, wat erop wees dat de interactie van IPA met het doelwiteiwittyrosinase was sterker dan de andere twee verbindingen, DPHC en arbutine. Echter,er is een beperking in het correleren van de remming van paddestoeltyrosinase-activiteit met die van cellulairtyrosinase- of melanineproductie in gekweekte melanocyten [32]. Dus de remmende effectenvan IPA optyrosinase-activiteit en melanogenese werden onderzocht in een zebravisin vivomodel en muizen B16F10melanoom cellen.

Melaninepigmenten hopen zich op op het oppervlak van de zebravis, waardoor microscopische observatie van de zebravis mogelijk wordtpigmentatieproces zonder gecompliceerde experimentele procedures, waardoor ze een geschikt model zijnvoor het screenen van melanogeneseremmers [33,34]. We evalueerden de melanine-remmende effectenvan IPAen IOE in een zebravislarvenmodel gestimuleerd door -MSH door bepaling van het melaninegehalte.Alle geteste monsters oefenden diepgaande remmende effecten uitop zebravispigmentatie zonder significanttoxiciteit (Figuur S2). De remmende effectenvan pigmentatie werden waargenomen via morfologische analyse vanzebravislarven verwant aan de verschillendebehandelingen (figuur2). Daarnaast het gebruik van larven in een vroeg stadiumin plaats van het volwassen stadium biedt een ander voordeel bij het testen van de percutane effectenvan medicinaalof cosmetische samenstellingen [33,35]. In dit geval hebben we gekozen -MSH als inductor zowel in zebravissen in vivoen in B16F10-melanoomcellenin vitro. Volgens beide resultaten in zebravisembryo's en B16F10melanoomcellen nam het melaninegehalte toe -MSH-stimulatie.

Het melaninegehalte correleert direct met de activiteit en eiwitniveaus van tyrosinase [36]. Daarom,we bepaalden de remmende effectenvan IPA en IOE op de tyrosinase-activiteit veroorzaakt door -MSH aanB16F10-cellen. We ontdekten dat de met IPA behandelde groep een verminderde tyrosinase-activiteit en melanine hadinhoud gestimuleerd door -MSH, met een vermindering van ongeveer 35 procent tyrosinase-activiteit en 40 procentmelaninegehalte (figuur4A, C). IOE remde de activiteit van tyrosinase op een dosisafhankelijke manier ensignificant verminderde melanogenese in B16F10-cellen (Figuur4B, D). Vergeleken met arbutine, IPA enIOE hebben significante remmende effectenop melanineproductie en tyrosinase-activiteit, dat was tede resultaten van eerdere moleculaire docking-onderzoeken.

Het mechanisme van de remmende effecten onderzoekenop -MSH-geïnduceerde melaninesynthese incellen, werd Western-blotting uitgevoerd. De expressieniveaus van melanine-gerelateerde eiwitten, waaronderERK, JNK en p38 werden na behandeling met IPA of IOE geëvalueerd. Geactiveerde fosforyleringvan ERK kan de afbraak van MITF bevorderen via de ubiquitine-proteasoom-afhankelijke route [28]. Dit suggereert dat potentiële melanogenese-remmers de melaninesynthese kunnen onderdrukken door te bevorderende proteasomale afbraak van MITF, die verband hield met de activering van de ERK-signaleringpaden [37]. De ERK, JNK en p38 MAPK's behoren tot de MAPK-familie [38–40]. In aanvulling,activering van de p38 MAPK-route induceerde MITF-expressie [41]. In deze studie, Western blotanalyse onthulde dat IPA p-JNK en p-p38 promoot (Figuur5B, C). De niveaus van p-ERK daarentegenveranderde niet met de behandeling van IPA en IOE (Figuur5A). Deze resultaten impliceren dat de remmende effectenvan IPA en IOE op tyrosinase-activiteit en melanogenese kan verband houden met de JNK en p38signaleringsroutes.

4. Materialen en methoden

4.1. Chemicaliën en reagentia

Dimethylsulfoxide (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT),L-DOPA, alfa-melanocytstimulerend hormoon ( -MSH) en fosfaatgebufferdzoutoplossing (PBS)werden gekocht bij Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, VS). Dulbecco is gewijzigdEagle's medium (DMEM) en foetaal runderserum (FBS) werden verkregen van Invitrogen-Gibco(Grand Island, NY, VS). De extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK1/2), gefosforyleerd ERK1/2 (p-ERK1/2), c-Jun N-terminale kinase (JNK), gefosforyleerd JNK (p-JNK), p38, gefosforyleerdp38 (p-p38), cAMP-responselement-bindend eiwit (CREB), gefosforyleerd CREB (p-CREB),microftalmie-geassocieerde transcriptiefactor (MITF), tyrosinase-gerelateerd eiwit-1 (Trp-2),tyrosinase-gerelateerd eiwit-1 (Trp-1), tyrosinase (TYR), anti-muis en anti-konijn IgG-antilichamenwerden gekocht bij Cell Signaling Technology (Beverly, MA, VS). Alle andere reagentia, inclusief -MSH, werden gekocht bij Sigma-Aldrich Chemical Co.

4.2. Moleculaire koppeling van tyrosinase

Voor de koppelingsstudie werd de kristalstructuur van tyrosinase (VOB: 3NM8) verkregen uit deEiwit databank. De docking-onderzoeken werden uitgevoerd met behulp van CDOCKERin Accelrys Discovery Studio 3.0 (Accelrys, Inc., San Diego, CA, VS). Wanneer een hele nucleotidesequentie wordt gedekt door het receptorraster, wordt aangenomen dat liganden de beste koppelingspositie selecteren [42]. De docking-procedure werd genoemd in de vorige studie. In het kort werden drie stappen gevolgd: (1)omzetting van de 2D-structuur naar een 3D-structuur; (2) berekening van kosten; en (3) toevoeging vanwaterstofatomen met behulp van het flexibele docking-programma [31,43].

4.3. Voorbereiding van IOE en isolatie van IPA

IO werd in juni 2018 geoogst langs de oostkust van het eiland Jeju, Korea. De alg werd twee keer gewassenmet leidingwater om het zout, de epifyten en het zand dat aan het oppervlak vastzit te verwijderen. Vervolgens was het voorzichtiggespoeld met zoet water en werd bewaard in een medische koelkast bij−20 ◦C. Daarna de bevrorenalg werd vóór extractie gelyofiliseerd en gehomogeniseerd met een molen. De IOE werd voor 50 procent geëxtraheerdethanol (v/v, in water) onder roeren gedurende 24 uur bij kamertemperatuur, daarna werd het gefiltreerd. Het filtraatextract werd geconcentreerd onder decompressie en gevriesdroogd tot poeder (IOE). Een 50 procent ethanolextract van IO werd uitgevoerd door Shinwoo Co. Ltd. (lot nr. SW9E29SA, Gyeonggi-do, Korea). IPA wasgeïsoleerd uit IOE zoals eerder beschreven [9]. In het kort werd de IOE gefractioneerd met behulp van centrifugaalpartitie chromatografie. Alle fracties werden verzameld en de IPA werd uiteindelijk gezuiverd door eensemi-preparatieve HPLC-kolom (YMC-Pack ODS-A, 10 mm, 250 mm, 5 m). IPA werd bepaald als eenpolyfenol en zijn chemische structuur (figuur S1, aanvullende materialen) werden geïdentificeerd via LC/MEVRanalyse met een massam/z van 992.1315, wat duidt op een molecuulformule van C96H66O48 (1986.26 vanberekend molecuulgewicht,∆0.6, [M − 2H] 2−).

4.4. Oorsprong en onderhoud van ouderlijke zebravissen

Volwassen zebravissen werden verkregen van een commerciële dealer (Seoul Aquarium, Seoul, Korea) en 10vissen werden geconserveerd in een aquarium van 3-L acryl op 28,5◦C, met een licht:donkercyclus van 14:10 uur. Zebravissen warentweemaal per dag gevoerd, gedurende 6 dagen⁄week, met aanvullend Tetramin-vlokkenvoer (SEWHAPET Food Co.,Seoul, Korea). Embryo's werden binnen 30 minuten verzameld door natuurlijke spawning en 's ochtends geïnduceerddoor het licht aan te doen. Het zebravisexperiment kreeg goedkeuring van de Animal Care and UseComité van Jeju National University (goedkeuringsnummer 2017-0001).

4.5. Meting van het melaninegehalte in zebravislarven

IPA en IOE en stimulator -MSH-concentraties werden gebruikt om de effecten te onderzoekenvanaandacht voor de ontwikkeling van het embryo. In elk werden vijftien zebravisembryo's (3-4 hpf) gezaaidwell, bestaande uit 1,9 ml embryo-medium, in een 12-well seeding plate. Testmonsters werden opgelostin 1 procent DMSO met 1× PBS en goed gemengd. Elke ochtend waren de eerste 5 pdf's levensvatbare embryo'sopgesomd om een overlevingsmaat te verkrijgen. Om het melaninegehalte te bepalen, worden embryo's bij7–9 hpf werden gezaaid in een 6-putjesplaat met 30 embryo's in elk putje in een 2.7-ml embryomedium.Na 3 dagen werden de larven tweemaal gespoeld met 1× PBS om eventuele achtergebleven reagentia te verwijderen ofdeeltjes en vergelijkbare hoeveelheden larven werden in de e-tubes geplaatst. Voordat u de melanine meetinhoud werden verschillende larven van elke groep gevangen met een microscoop en de overige werden gecentrifugeerd.

Na centrifugeren werd de pellet opgelost in 1 ml 1 N NaOH bij 90°C◦C gedurende 60 minuten. Het mengselwerd vervolgens krachtig gevortext om het melaninepigment op te lossen. De absorptie van het supernatant wasgemeten bij 490nm. Het resultaat werd vergeleken met de controle waarvan werd aangenomen dat deze er één vertegenwoordigdehonderd. Het melaninegehalte werd gekalibreerd op eiwithoeveelheid en de waarnemingen werden herhaaldin drievoud.

4.6. Cytoxiciteit van IPA en IOE in B16F10-cellen

B16F10 muizenmelanoomcellen werden verkregen van ATCC (American Type Culture Collection,Manassas, VA, VS). B16F10-cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 100 U/ml penicilline,100 µg/ml streptomycine en 10 procent FBS. De cellen werden vervolgens geïncubeerd in een atmosfeer van 5 procent CO22 bij37 ◦C en werden vervolgens elke 3-5 dagen in subcultuur gebracht. De cytotoxiciteit van IPA en IOE tegen B16F10cellen werden onderzocht via colorimetrische MTT-assay. In het kort: de cellen werden gezaaid in 24-well-platen bij een

concentratie van 2× 104cellen/ml. Ongeveer 16 uur na het zaaien werden de cellen geïncubeerd met IPA en IOEbij verschillendeconcentraties gedurende 72 uur en hun levensvatbaarheid werd bepaald.

4.7. Determination of Cellular Melanin Content

Cellulair melaninegehalte werd gemeten met behulp van een eerder beschreven methode [33]. De cellen(2 × 104 cellen/ml) werden gedurende 72 uur geïncubeerd met verschillende concentraties IPA en IOE; daarom,ze werden gewassen in ijskoude PBS. In het kort werden de cellen geïncubeerd bij 80°C◦C gedurende 1 uur in 1 ml 1 NNaOH/10 procent DMSO en werden vervolgens gevortext om de melanine op te lossen: de absorptie werd gemeten bij450 nm. De optische dichtheid van de remming in de controle werd als 100 procent beschouwd. De gegevens zijngepresenteerd in de vorm van gemiddelde percentages en de resultaten werden in drievoud herhaald.