MicroRNA's bij de ontwikkeling en ziekte van nieren Ⅲ

MiRNA's in Wilms-tumor

Wilms-tumor,ofnefroblastoom, is de meest voorkomende kindertijdnierkanker, met een incidentie van 1 op de 10,000 kinderen in Noord-Amerika (111). Het is voornamelijk een sporadische ziekte, hoewel familiale vormen in ongeveer 1%-2% van de gevallen voorkomen (112, 113). Wilms-tumoren komen voort uit afwijkende nefrogenese, waarbij pluripotente embryonale voorlopers van de nieren niet differentiëren en blijven bestaanabnormaal in het postnatale leven(111, 114, 115). Deze tumoren lijken histologisch op elkaarnieren ontwikkelenmet eenverstoorde morfologie(116), en mutaties in genen die betrokken zijn bij foetale nefrogenese, waaronder WT1 (117-119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) en TP53 (123, 124), worden geassocieerd met ongeveer 40% van de Wilms-tumoren (125). Recente onderzoeken waarbij gebruik werd gemaakt van de sequentiebepaling van het hele genoom en het hele exoom van Wilms-tumoren identificeerden nieuwe mutaties in kankerrisicogenen (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), genen die coderen voor eiwitten die histonmodificaties mediëren tijdens nefrogenese (BCOR, MAP3K4) (126 ), en miRNA-verwerkingsgenen (121, 122, 128, 129).

HOE LANG DUURT HET VOORDAT CISTANCHE WERKT BIJ NIERZIEKTEPATIËNTEN?

Van de miRNA-verwerkende genen zijn mutaties in DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 en XPO5 (codeert voor exportin 5) gerapporteerd in met behandeling naïeve en neoadjuvante chemotherapie behandelde Wilms-tumoren (Figuur 3) (121, 122, 128, 129). ). Ongeveer 33% van de onderzochte Wilms-tumoren vertonen schadelijke mutaties in genen van de miRNA-verwerkingsroute (128). Een terugkerende hotspot-mutatie (E1147K) in een met al-bindend (Mg2+) residu van het RNase IIIb-domein van DROSHA, die uniek lijkt te zijn voor Wilms-tumor, maakt een einde aan de katalytische activiteit van dit domein, wat resulteert in onvolledige splitsing van pri-miRNA's en verminderde miRNA-rijping (128). Somatische hotspot-mutaties die het RNase IIIb-domein van DICER1 beïnvloeden, belemmeren de verwerking van 5p-miRNA's (die afgeleid van de 5′-arm van de pre-miRNA-haarspeld) (129) en worden vaak aangetroffen als "tweede hit"-mutaties die samen met DICER1 werken. kiemlijnmutaties om Wilms-tumorigenese te induceren bij het DICER1-syndroom (een aandoening die de gevoeligheid voor een verscheidenheid aan tumoren verhoogt) (130-132). Het blijft onduidelijk waarom een ​​verminderde DICER1-functie in Wilms-tumoren resulteert in aanhoudende en afwijkende nefrogenese, in tegenstelling tot het verlies van Dicer1 in nefron-voorlopercellen van muizen, wat verhoogde apoptose en voortijdige stopzetting van nefrogenese veroorzaakt (72-75). Enkele mogelijke mogelijkheden zijn onder meer dat de gendoseringsactiviteit cruciaal zou kunnen zijn bij het bepalen van de celoverleving of dat mutaties in het RNase IIIb-domein de specificiteit van miRNA-binding door DICER1 zouden kunnen beïnvloeden.

Mutaties in miRNA-verwerkingsgenen worden geassocieerd met de downregulatie van belangrijke miRNA's, waaronder leden van de miR-200 (121) en de let-7 families (Figuur 3) (121, 129). Laat -7 miRNA's en het RNA-bindende eiwit Lin28 samenwerken om de timing van het stoppen van nefrogenese bij muizen te controleren, mogelijk via regulatie van het groeibevorderende gen Igf2 (133). Overexpressie van Lin28 tijdens de ontwikkeling van de nieren veroorzaakt expansie van nefrogene voorlopercellen, door hun laatste differentiatiegolf te remmen, wat culmineert in neoplastische transformatie die sterk doet denken aan de menselijke Wilms-tumor (134). Een verhoogd aantal DNA-kopieën van LIN28B en verlies van DNA-kopieën van let-7a worden waargenomen in respectievelijk 25% en 46% van de menselijke Wilms-tumormonsters (126). In overeenstemming met deze waarnemingen veroorzaken kiemlijnmutaties in het menselijke DISL3L2-gen, dat codeert voor een exoribonuclease dat verantwoordelijk is voor de afbraak van voorverwerkte vormen van let-7, het Perlman-syndroom en predispositie voor Wilms-tumor (135, 136). Perlmansyndroom is een congenitaal overgroeisyndroom dat wordt gekenmerkt door macrosomie, polyhydramnion, gezichtsdysmorfologie, nierdysplasie en nefroblastomatose (een voorloperlaesie voor Wilms-tumor) (137). Van de kinderen met het Perlman-syndroom die de neonatale periode overleven, ontwikkelt 64% een Wilms-tumor (138). Interessant genoeg werden volledige of gedeeltelijke DISL3L2-deleties gevonden in ongeveer 30% van de onderzochte sporadische Wilms-tumoren (136).

Een recente studie versterkte de betekenis van het miRNA-regulerende netwerk in de etiologie van Wilms-tumor. De auteurs ontdekten dat pleiomorf adenoomgen 1 (PLAG1) een van de meest consistent opgereguleerde genen is in Wilms-tumoren met mutaties in miRNA-verwerkingsgenen (125). Ectopische expressie van PLAG1 in de zich ontwikkelende muizennier veroorzaakt neoplasie, wat gepaard gaat met transactivatie van het doelgen, het Wilms-tumor-oncogen IGF2. miR-16 en miR-34, die gedownreguleerd zijn in Wilms-tumoren, werden geïdentificeerd als potentiële regulatoren van PLAG1-expressie (125). Tabel 2 vat andere onderzoeken samen die afwijkende expressie van specifieke miRNA's hebben gerapporteerd die geassocieerd zijn met de etiologie van Wilms-tumor. Interessant is dat deze miRNA's kunnen functioneren als oncogenen (oncomiR's genoemd) of tumoronderdrukkers in de setting van Wilms-tumorontwikkeling, afhankelijk van de aard van hun doelwitten.

MiRNA's als potentiële biomarkers en therapeutische middelen

Naast hun intracellulaire locatie zijn miRNA’s ook in aanzienlijke hoeveelheden aanwezig in biologische vloeistoffen, waaronder bloed, plasma, urine, moedermelk en speeksel (139). Deze circulerende miRNA’s worden verouderd aangetroffen in microdeeltjes (exosomen, microblaasjes en apoptotische lichaampjes) (140, 141), geconjugeerd met AGO (142) of nucleofosmin 1-eiwitten (143), of geladen in HDL (144), waardoor ze opmerkelijk stabiel, zelfs onder ongunstige omstandigheden, zoals koken, extreme pH-variaties, langdurige opslag en meerdere vries-dooicycli (145, 146). MiRNA-signaturen in biologische vloeistoffen kunnen dus associaties met fysiologische of ziektetoestanden weerspiegelen (147). Samen maken deze kenmerken circulerende miRNA’s aantrekkelijk voor gebruik als niet-invasieve biomarkers voor ziektediagnose en prognose.

Circulerende miRNA's kunnen rechtstreeks worden geëxtraheerd uit ongefractioneerde biologische vloeistoffen of extracellulaire larvesikelpreparaten met behulp van in de handel verkrijgbare extractiekits (148) of TRIzol (149). Na isolatie kunnen miRNA’s bij –70 graden Celsius worden bewaard en blijven ze maximaal 1 jaar stabiel (148). Er zijn verschillende platforms beschikbaar voor miRNA-profilering, waaronder microarray-hybridisatie, qPCR en sequencing van de volgende generatie (150). Microarray en qPCR zijn de meest gebruikte methoden om de expressie van bekende miRNA's te onderzoeken (151). Beide methoden hebben de voordelen dat ze eenvoudig te gebruiken zijn, relatief snel van RNA-labeling tot datageneratie, en relatief kosteneffectief (152). Ze vertrouwen echter op de beschikbaarheid en nauwkeurige annotatie van miRNA-sequenties in databases voor het ontwerpen van probes en primers (150). Hoewel duurder, maakt sequencing van de volgende generatie de gelijktijdige detectie van zowel bekende als nieuwe miRNA-soorten mogelijk en biedt het een hoge gevoeligheid (153). Bovendien maakt de single-nucleotide resolutie van de volgende generatie sequencing de identificatie mogelijk van isomiRs, dit zijn volwassen miRNA-isovormen die verschillen van de canonieke isovormen in lengte, sequentie of beide (154, 155), die de targetingspecificiteit van het miRNA veranderen (154, 155). 156).

Diverse onderzoeken hebben het potentieel van circulerende miRNA's als biomarkers voor nierziekten bij kinderen onderzocht (157-160). Eén onderzoek identificeerde bijvoorbeeld 14 miRNA's die aanzienlijk waren opgereguleerd in het serum van patiënten met Wilms-tumor. Interessant is dat een handtekening gebaseerd op miR-100-5p- en miR-130-3p-expressie deze patiënten met nauwkeurigheid, gevoeligheid en specificiteit zou kunnen onderscheiden van gezonde controles (159). Hoewel de bevindingen uit deze studie en vele andere onderzoeken een overtuigende motivatie hebben opgeleverd om het potentieel van circulerende miRNA's als biomarkers te onderzoeken, moeten er verschillende hindernissen in het veld worden overwonnen voordat wijdverbreide klinische toepassing mogelijk is. Ten eerste is er een relatief gebrek aan consensus tussen onderzoeken, waarschijnlijk als gevolg van de afwezigheid van gestandaardiseerde methodologie voor zuivering (161) en analyse van monsters (bijv. verschillen in miRNA-profileringsplatforms, ref. 162, 163; of verschillen in smRNA-Seq-bibliotheek bereidingswijzen, ref. 164). In de tweede plaats is er het gebrek aan onderzoeken op grote schaal en gedetailleerd onderzoek op specifieke terreinenziekten.Een ander belangrijk aspect is dat de invloed van verstorende variabelen zoals leeftijd, geslacht en externe factoren (bijv. tabak, alcohol, etc.) op miRNA-profielen nog niet volledig is onderzocht (voor een diepgaande evaluatie, zie ref. 165).

Wat de therapeutische kant betreft, bevinden verschillende op miRNA gebaseerde geneesmiddelen zich momenteel in klinische onderzoeken, maar hebben nog geen goedkeuring van de FDA gekregen (166, 167). De belangrijkste benaderingen voor miRNA-therapie omvatten het herstel van miRNA-niveaus met behulp van miRNA-nabootsers, of remming van specifieke miRNA's met behulp van antagomiRs (168). Een van de uitdagingen die gepaard gaat met de ontwikkeling van op miRNA gebaseerde therapieën is de identificatie van miRNA-kandidaten voor elke ziekte. Omdat bij elke ziekte meerdere miRNA’s ontregeld zijn, moet een zorgvuldige analyse van patiëntmonsters in combinatie met in vitro en in vivo testen die de pathofysiologische mechanismen aanpakken die door de miRNA’s in kwestie worden beïnvloed, worden uitgevoerd om de kandidaat-miRNA’s voor therapeutische interventie te beperken (168, 169). Een andere uitdaging betreft de ontwikkeling van strategieën om de in vivo stabiliteit en plaatsspecifieke medicijnafgifte te verbeteren met minimale toxiciteit en off-target effecten. RNA-moleculen zijn chemisch instabiel vanwege de aanwezigheid van de 2′-hydroxylgroep op de pentose-ring. Om een ​​hogere stabiliteit en bescherming te bieden tegen nucleasen die aanwezig zijn in serum of het endocytische compartiment van cellen, hebben biotechbedrijven RNA-moleculen gegenereerd met chemische modificaties (2′-O-methylgroep, fosforothioaat of vergrendelde nucleïnezuren) in hun ruggengraat (166). Wat de in vivo afgifte betreft, omvatten de technologieën onder meer op lipiden gebaseerde (bijvoorbeeld lipide-nanodeeltjes en neutrale liposoom) en dendrimeren geconjugeerd aan een targetgroep, naast vele andere strategieën. Grote uitdagingen die verband houden met miRNA-afgiftesystemen zijn immunotoxiciteit en doelspecifieke affiniteit voor een ziekteplaats (170). Toedieningsstrategieën via verschillende toedieningsmethoden (intraperitoneale, intraveneuze en subcutane injecties) of door gebruik te maken van vectoren die nierspecifieke en induceerbare promoters bevatten, zijn met succes gebruikt voor selectieve niertargeting en om mogelijke nadelige effecten in andere weefsels en organen te voorkomen (171, 172 ).

Tabel 2. Lijst met miRNA's veranderd in Wilms-tumor

Lijst met miRNA's, geanalyseerde monsters/specimens, miRNA-niveaus waargenomen in deze monsters/specimens vergeleken met geschikte controles, doelgen, gevolgen van miRNA-veranderingen en referenties. CAMKK2, calcium/calmoduline-afhankelijk proteïnekinasekinase 2; CDC7, celdelingscyclus 7; CDH1, cadherine 1; CREB1, cAMP-responselement-bindend eiwit 1; EYA1, ogen afwezig homoloog 1; E2F3, E2F-transcriptiefactor 3; FRS2, FGF-receptorsubstraat 2; Glut1, glucosetransporter 1; IGF1R, IGF1-receptor; Jag1, gekarteld1; MET, mesenchymale-epitheliale transitie; MKNK1, MAPK-interagerende serine/threoninekinase 1; PTEN-, fosfatase- en tensine-homoloog; PUMA, p53-opreguleerde modulator van apoptose; p73, tumoreiwit p73; SIX1, sineoculis homeobox-homoloog 1; TGFBR1, TGF-receptor 1; WT, Wilms-tumor.

Samenvatting

Er is een explosie aan informatie geweest over miRNA-biogenese, de regulatie van miRNA-expressie en miRNA-functie sinds de eerste ontdekking van miRNA's in 1993 (6, 7). Dit gaat gepaard met een steeds groter begrip van hoe miRNA’s functioneren, zowel in de normale fysiologie als in de pathofysiologie van veel ziekten. Het is duidelijk geworden dat ontregeling van miRNA-expressie de vroege nierontwikkeling verstoort en betrokken is bij de pathogenese van ontwikkelingsnierziekten, zoals CAKUT en Wilms-tumor. Met recente ontwikkelingen in het gebruik van miRNA's als biomarkers en als nieuwe medicijndoelen, zijn inzichten in hoe miRNA's de ontwikkeling van nieren en ziekten reguleren van cruciaal belang om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen van deze ziekten. Om deze inspanningen volledig te realiseren zijn toekomstige studies die de functie van specifieke miRNA’s in de nierontwikkeling identificeren van cruciaal belang, naast technologieën om de doelgerichte behandeling van kleine oligonucleotiden op de nieren te optimaliseren.

Dankbetuigingen

Het laboratorium van JH wordt ondersteund door subsidies van het NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK125015 en R01DK102843). DMC werd ondersteund door de Nephrotic Syndrome Study Network Career Development Award en de Children's Hospital of Pittsburgh Research Advisory Council Postdoctoral Fellowship. MT werd ondersteund door het Summer Research Internship Program van de Universiteit van Pittsburgh (R25DK119180). De figuren zijn gemaakt met BioRender.com. Adrescorrespondentie aan: Jacqueline Ho, Afdeling Nefrologie, Afdeling Kindergeneeskunde, UPMC Kinderziekenhuis van Pittsburgh, Rangos Research Center, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, VS. Telefoon: 412.692.9440; E-mail: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A, et al. miRBase: van microRNA-sequenties tot functie. Nucleïnezuren Res. 2019;47(d1): D155–D162.

2. Friedman RC, et al. De meeste mRNA's van zoogdieren zijn geconserveerde doelwitten van microRNA's. Genoomonderzoek. 2009;19(1):92–105.

3.Ghildiyal M, Zamore PD. Kleine tot zwijgen brengende RNA's: een uitdijend universum. Nat ds. Genet. 2009;10(2):94–108.

4. Djuranovic S, et al. miRNA-gemedieerde genuitschakeling door translationele repressie gevolgd door mRNA-dedenylatie en verval.

Wetenschap. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Genuitschakeling door microRNA's: bijdragen van translationele repressie en mRNA-verval. Nat ds. Genet. 2011;12(2):99–110. 6. Lee RC, et al. Het heterochrone gen lin-4 van C. elegans codeert voor kleine RNA's met antisense-complementariteit voor lin-14. Cel.