Deel 1 Neuroprotectieve effecten van fenylethanoïde glycosiden in een in vitro model van de ziekte van Alzheimer
Mar 10, 2022
Is het neuroprotectieve effect van Cistanche echt?
JIANHUA YANG1*, BOWIE JU1,2*, YAO YAN1, HUAN HUAN XU1,
SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 en JUMPING HU2
1 Afdeling Farmacie, Het Eerste Aangesloten Ziekenhuis; 2 Afdeling Natuurlijke Geneesmiddelen,
College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011, P.R. China
Ontvangen 8 januari 2016; Geaccepteerd januari 6, 2017
Abstract.
De huidige studie had tot doel de neuroprotectieve effecten vanfenylethanoïde glycosiden(PhG's) op H2O2- en β-amyloïde peptide (Aβ)1-42-geïnduceerde schade van PC12-cellen als een in vitro model van de ziekte van Alzheimer (AD). De optimale inductiecondities werden vastgesteld door screening van verschillende incubatietijden en concentraties. PC12-cellen werden behandeld met 0,5 μM Aβ1-42 en H2O2 in aanwezigheid van PhG's gedurende 24 uur en de levensvatbaarheid van de cel werd vervolgens geëvalueerd door een MTT-test; lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte en malondialdehyde (MDA) gehalte werden ook gemeten. De optimale omstandigheden voor het vaststellen van het AD-model waren de behandeling van PC12-cellen met 0,5 μM Aβ1-42 gedurende 48 uur, of met 25 μM H2O2 opgelost in DMEM met PBS. PhG's bij concentraties van 5, 25 en 50 μg/ml verhoogden de levensvatbaarheid en verlaagden de afgifte van LDH en MDA door PC12-cellen die gewond waren geraakt met Aβ1-42 of H2O2. Concluderend werd het model van Aβ1-42- en H2O2-geïnduceerde PC12-celbeschadiging met succes vastgesteld. PhG's bleken een significant neuroprotectief effect te hebben tegen Aβ1-42- of H2O2-geïnduceerde celbeschadiging.
Voor meer informatie kunt u contact opnemen met:joanna.jia@wecistanche.com
Cistanche deserticola heeft vele effecten, klik hier om meer te weten
Introductie
De ziekte van Alzheimer (AD), een neurodegeneratieve aandoening met de klinische kenmerken van progressief geheugenverlies en cognitieve functiestoornissen (1), is wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van dementie (2). De financiële kosten zijn immens door de prevalentie van AD (3). Daarom is het dringend noodzakelijk om passende middelen te ontwikkelen voor het beheer en de preventie van AD.
De pathogenese van AD is nauw verbonden met de accumulatie van neurofibrillaire klitten en seniele plaques (SP's) in aangetaste hersengebieden (4,5). β-amyloïde peptide (Aβ), de belangrijkste component van SP's, is gemeld dat het een oorzakelijke rol speelt in de progressie van AD, omdat het een toxisch effect heeft op neuronale cellen (6). Aβ-fragmenten, waaronder Aβ1-40, Aβ25-35 en Aβ1-42, zijn gegenereerd door de splitsing van amyloïde voorlopereiwit (7). De neurotoxiciteit van Aβ1-42 bleek significant hoger te zijn dan die van Aβ25-35 en Aβ1-40, en Aβ1-42 kan een AD-model induceren (1,8-10). Oxidatieve stress kan betrokken zijn bij de pathogenese van AD en is het belangrijkste mechanisme dat ten grondslag ligt aan Aβ-geïnduceerde neurotoxiciteit (11-13). Verschillende studies suggereerden dat Aβ1-42 intracellulaire accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) veroorzaakte, wat leidde tot lipide- en eiwitoxidatie, DNA-schade en activering van celcycluscontrolepuntsignalering (1,14,15). Overmatige hoeveelheden H2O2 kunnen leiden tot oxidatieve schade en apoptose van PC12-cellen veroorzaken (16). Daarom kan het richten op oxidatieve stress een veelbelovende aanpak zijn voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor het remmen van Aβ-geïnduceerde neurotoxiciteit bij AD. Herba (H.)Cistanche, een Chinees kruidengeneesmiddel dat vaak wordt gebruikt op het vasteland van China voor het voeden van de nieren en het aanvullen van essentie en bloed, is gebruikt om geheugenverlies en seniele constipatie te behandelen (17).Fenylethanoïde glycoside(PhG), een van de belangrijkste bestanddelen in H.Cistanche, verbetert de aantasting van neuronale apoptose veroorzaakt door Aβ25-35 via de antioxiderende effecten (18,19). Een eerdere studie identificeerde vijf belangrijke componenten uit de totale PhG's, namelijkacteoside, 2'-acetylacteoside, echinacoside |, cistanosiden, enisoacteoside |(20). Onder deze componenten isacteosideenechinacoside |er is gemeld dat het neuroprotectieve effecten heeft op Aβ25-35- of H2O2-geïnduceerde neurotoxiciteit (21-23). Wu et al (24) suggereerden bijvoorbeeld datacteosideenechinacoside |verbeterde cognitieve disfunctie veroorzaakt door Aβ1-42. De huidige studie had tot doel de beschermende effecten van PhG's in een in vitro ratcelmodel van AD te onderzoeken.
Materialen en methoden
VoorbereidingvanPhG's. Totale PhG's werden geëxtraheerd uitH.Cistanchezoals eerder beschreven (25). De luchtgedroogde stengel vanH.Cistanche werd gepoederd en geëxtraheerd door percolatie met 80% EtOH. Het percolaat werd verdampt onder gereduceerde
druk, gevolgd door hersuspensie in een passende hoeveelheid H2O2(100 μmol/l). Het mengsel werd geïsoleerd op een SP-825 macroporeuze harskolom (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) en geëlueerd met 0, 30, 50, 70 en 90% EtOH in water. Om de PhG-rijke fractie te verkrijgen, werden de 30-50% EtOH-eluenten geconcentreerd en gedroogd onder verminderde druk. Ultraviolette (UV) spectrofotometrie werd uitgevoerd om de totale PhG's te bepalen. De inhoud vanechinacoside |enacteosidewerd bepaald door hogedrukvloeistofchromatografie volgens een eerder protocol (26). Een Hypersil ODS-2 kolom (4,6x250 mm, 5 μm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, China) werd gebruikt en onderhouden op kamertemperatuur. De mobiele fasen waren methylcyaniden en water met 0,4% fosforzuur (v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland). Het debiet was 0,75 ml/min en de golflengte was ingesteld op 333 nm.
Celkweekenmedicamenteuze behandeling.De PC12 rat feochromocytoom cellijn werd geleverd door Dr. He Chunhui, de Medical School, Xinjiang Medical University (Urumqi, China). Cellen werden gekweekt in dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, VS) met 10% foetaal runderserum (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, China), 100 U/ml penicilline en 100 U/ml streptomycinen in een incubator bij 37°C met 5% CO2en 95% lucht. Bij het bereiken van 80% confluentie werden de cellen behandeld met 0,25% trypsine en gepasseerd.
Om de interferentie van het medicijn zelf op de groei van PC12-cellen te elimineren, werd een toxiciteitsexperiment uitgevoerd. In het kort, PC12 cellen (3x104cellen/ml) werden gezaaid in 96-putplaten bij 100 μl/put en 's nachts geïncubeerd bij 37°C. Na het weggooien van het supernatant werd 200 μl complete DMEM toegevoegd aan de blancogroep, terwijl cellen in de interventiegroepen werden behandeld door PhG's in verschillende doses (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 en 200 μg / ml). Na incubatie van de cellen bij 37°C gedurende 48 uur, 20 μl MTT-oplossing (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) werd aan elke put toegevoegd. Na incubatie gedurende 4 uur werd het supernatant weggegooid en werd 150 μl dimethylsulfoxide per put toegevoegd, gevolgd door agitatie gedurende 10 minuten. De optische dichtheid (OD) waarden bij 490 nm werden gedetecteerd met behulp van een ELISA-plaatlezer.
Eenβ1‑42-geïnduceerdPc12celbeschadiging.Aβ1-42 peptide gekocht bij Bioss Biotech (Beijing, China) werd opgelost in water (100 μg/ml). Vervolgens werd het mengsel gedurende 4 dagen geïncubeerd bij 37°C en vóór gebruik bewaard bij 4°C.
PC12-cellen werden gezaaid in 96-well platen (3xl04cellen in 100 μl per put). Na kweek gedurende 24 uur voor therapietrouw werd 50 μl Aβ1-42 bij verschillende eindconcentraties (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 of 2 μM) opgelost in serumvrije DMEM toegevoegd, gevolgd door incubatie gedurende 24, 48, 72 of 96 uur. De levensvatbaarheid van cellen werd geëvalueerd door middel van een MTT-test. De optimale Aβ1-42 concentratie was 0,5 bepaald als μM. PC12 cellen (3xl04cellen per put) werden behandeld met verschillende doses PhG's (0, 0,5, 5, 25 of 50 μg/ml) in aanwezigheid van 0,5 μM Aβ1-42 gedurende 24 uur. De levensvatbaarheid van cellen werd geëvalueerd door middel van een MTT-test.
H2O2-geïnduceerdPc12celbeschadiging. PC12-cellen werden verguld gezaaid in 96-well platen (3xl04cellen in 100 μl per put). Na het kweken
gedurende 24 uur voor hechting, 100 μl H2O2bij verschillende eindconcentraties (0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 en 500 μM) opgelost in DMEM met of zonder PBS (0,01 mol/l) werd toegevoegd, gevolgd door incubatie gedurende 24 uur. De levensvatbaarheid van cellen werd geëvalueerd door middel van een MTT-test. De optimale H2O2concentratie en oplosmiddel werden bepaald om dein vitromodel van AD.
PC12 cellen (3xl04cellen per put) werden behandeld met verschillende doses PhG's (0, 0,5, 5, 25 en 50 μM). Na kweken gedurende 24 uur voor hechting, werden PC12-cellen behandeld met 100 μl H2O2opgelost in DMEM met PBS in aanwezigheid van PhG's gedurende 24 uur. De levensvatbaarheid van de cel werd geëvalueerd door middel van een MTT-test.
Lactaatdehydrogenase (LDH)vrijgave assay. Celbeschadiging werd beoordeeld door de LDH-activiteit in het supernatant van PC12-cellen te meten met behulp van een LDH-kit volgens het protocol van de fabrikant (cat. nr. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). Kortom, dubbel gedestilleerd H2O, 0,2 μmol/ml pyruvinezuur, matrixbuffer en co-enzym I-buffer werden na 48 uur na medicamenteuze behandeling in volgorde toegevoegd. Na incubatie bij 37°C gedurende 15 min werd 2,4-dinitro-fenylhydrazine toegevoegd. Vervolgens werd aan elke put 250 μl van een 0,4 M NaOH-oplossing toegevoegd. Het supernatant werd verzameld na incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De absorptie bij 450 nm werd vervolgens gemeten met een microplaatlezer.
Metingvanmalondialdehyde(MDA). MDA werd gemeten in het supernatant van PC12-cellen met behulp van een commerciële kit (cat. nr. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) volgens het protocol van de fabrikant Kortom, gedehydrateerde alcohol en andere reagentia werden in volgorde toegevoegd, gevolgd door incubatie in een waterbad bij 95 ° C gedurende 40 minuten. Het mengsel werd gecentrifugeerd bij 1.006 xgen 25°C gedurende 10 min na afkoeling. Het supernatant werd vervolgens gebruikt om het MDA-gehalte te bepalen. De absorptie werd vervolgens gemeten met een microplaatlezer bij 532 nm.
Beoordeling van beschermend Effecten van echinacoside | en acteoside tegen ADVERTENTIE in Vitro. PC12-cellen werden gezaaid met een dichtheid van 3xl04cellen/put in 96-put platen (100 μl/put). Cellen werden geïncubeerd met geneesmiddelen waaronder echinacoside (cat. nr. 111670-200503; National Institutes for Food and Drug Control, Beijing, China) en acteoside (cat. nr. 111530-200505; National Institutes for Food and Drug Control) bij verschillende concentraties (0,5, 25 en 50 μg/ml). Vervolgens werden de cellen behandeld met Aβ1-42 of H2O2gedurende 24 uur en de levensvatbaarheid van de cel werd gemeten met een MTT-test.
Statistisch analyse. Waarden worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaarddeviatie. De t-toets van de student werd gebruikt voor intergroepsvergelijkingen. Statistische analyses werden uitgevoerd met BEHULP VAN SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultaten
Kwantificering van PhG's van H. Cistanches.De UV-spectra van de PhG's geëxtraheerd evenals standaardoplossingen vanechinacoside |en acteoside werden geregistreerd en de resultaten toonden aan dat de UV-spectra consistent waren (fig. 1). UV-spectrofotometrie
toonde aan dat het PhG-gehalte 87,6% was. De HPLC-resultaten toonden aan dat de inhoud van echinacoside en acteoside
respectievelijk 37,7 en 17,8% (fig. 2).
VastberadenheidvandeideaalPhGconcentratie. Vergeleken met de blancogroep had PhG bij 75, 100, 125, 150, 175 en 200 μg/ml een significant remmend effect op PC12-cellen (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80% (fig. 3). Zo werden PhG's met een concentratie van 5, 25 en 50 μg /ml gebruikt voor de behandeling van PC12-cellen in latere experimenten omdat ze de levensvatbaarheid van de cel niet beïnvloedden.
Eenβ1‑42-geïnduceerdPc12celbeschadiging.Vergeleken met die in de controlegroep was de levensvatbaarheid van de cellen in de 0,5 μM Aβ1-42-letselgroep 63% (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">in vitroAD-model.
De activiteit van PC12-cellen behandeld met 0,5 μM Aβ1-42 in aanwezigheid van veilige doses PhG's (5, 25 en 50 μg/ml) gedurende 24 uur werd ook bepaald. Vergeleken met de modelgroep (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">
H2O2-geïnduceerdPc12celbeschadiging. De levensvatbaarheid van PC12-cellen behandeld met 25 μM H2O2opgelost in DMEM met PBS was 56,43%. De levensvatbaarheid van PC12-cellen behandeld met 200 μM H2O2opgelost in DMEM zonder PBS was 71,64% (tabel I). Zo werden PC12-cellen behandeld met 25 μM H2O2opgelost in DMEM met PBS werden geselecteerd als de optimale voorwaarde voor het opzetten van het AD-model.
Vergeleken met de controlegroep was de levensvatbaarheid van cellen in de modelgroep 48,8% (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">
PhG's en de levensvatbaarheid van PC12-cellen behandeld met PhG's in concentraties van 5, 25 en 50 μg/ml waren respectievelijk 54, 57 en 64% (tabel II).
PhG's remmen door letsel geïnduceerde LDH-afgifte door PC12-cellen. In vergelijking met de controlegroep was het LDH-gehalte van het supernatant van gewonde PC12-cellen verhoogd, wat op een concentratieafhankelijke manier werd geremd door PhG's. Dit resultaat gaf aan dat PhG's een significant neuroprotectief effect hebben op PC12-cellen (fig. 6).
geremd door PhG's op een concentratieafhankelijke manier. Dit resultaat gaf aan dat PhG's een significant neuroprotectief effect hebben op PC12-cellen (fig. 7). PhG en zijn componenten echinacoside en acteoside redden de levensvatbaarheid van gewonde PC12-cellen. Vergeleken met de modelgroep verhoogde behandeling met acteoside de levensvatbaarheid van Aβ1-42-gewonde PC12-cellen significant op een dosisafhankelijke manier. PhG's en echinacoside verhoogden ook significant de levensvatbaarheid van Aβ1-42-gewonde PC12-cellen bij alle geteste concentraties (fig. 8A).
In vergelijking met de modelgroep verhoogde acteoside de levensvatbaarheid van PC12-cellen die met H werden behandeld significant2O2. PhG's verhoogden ook de levensvatbaarheid van PC12-cellen behandeld met H2O2, terwijl het effect niet significant was bij concentraties van 5 en 25 μg/ml (fig. 8B). Bovendien verhoogde echinacoside de levensvatbaarheid van de cel met 25 μg/ml.
Kortom, acteoside, PhG's en echinacoside oefenden significante neuroprotectieve effecten uit op PC12-cellen die werden blootgesteld aan letsel met Aβ1-42 of H2O2.
