DEEL 1 Echinacoside induceert vasorelaxatie van de longslagader bij ratten door de NO-cGMP-PKG-BKCa-kanalen te openen en de intracellulaire Ca2 plus-niveaus te verlagen

Hoe induceert echinacoside veneuze ontspanning?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Afdeling Farmacologie, School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2 Onderzoekscentrum voor geneeskunde op grote hoogte, Medical College of Qinghai University, Xining 810001, China; 3 School of Pharmacy, Qinghai University for Nationalities, Xining 810007, China; 4 Qinghai Entry-Exit Inspectie en Quarantaine Bureau, Xining 810001, China

Doel:Aanhoudende pulmonale vasoconstrictie zoals ervaren op grote hoogte kan leiden tot pulmonale hypertensie (PH). Het belangrijkste doel van deze studie is om het vaatverwijdende effect vanechinacoside(ECH), een fenylethanoïde glycoside van het Tibetaanse kruid Lagotis brevituba Maxim enCistanche tubulosa, op de longslagader en zijn potentiële mechanisme.

Methoden:Pulmonale arteriële ringen verkregen van mannelijke Wistar-ratten werden gesuspendeerd in orgaankamers gevuld met Krebs-Henseleit-oplossing, en isometrische spanning werd gemeten met behulp van een krachtopnemer. Intracellulaire Ca2 plus-niveaus werden gemeten in gekweekte pulmonale arteriële gladde spiercellen (PASMC's) van ratten met Fluo 4-AM.

Resultaten: ECH(30-300 μmol/L) ontspanden de longslagaders van ratten die vooraf waren samengetrokken door noradrenaline (NE) op een concentratie-afhankelijke manier, en dit effect kon worden waargenomen in zowel intacte endotheel- als endotheel-ontdekte ringen, maar met een significant lagere maximale respons en een hogere EC50 in door endotheel ontdane ringen. Dit effect werd significant geblokkeerd door L-NAME, TEA en BaCl2. IMT, 4-AP en Gli remden echter nietECH-geïnduceerde ontspanning. Onder extracellulaire Ca2 plus-vrije omstandigheden werd de maximale contractie verminderd tot 24,54 procent ± 2,97 procent en 10,60 procent ± 2,07 procent in ringen die waren behandeld met respectievelijk 100 en 300 mol/L ECH. Onder omstandigheden van extracellulaire calciuminstroom werd de maximale contractie verminderd tot 112,42 procent ± 7,30 procent, 100,29 procent ± 8,66 procent en 74,74 procent ± 4,95 procent in ringen die waren behandeld met respectievelijk 30, 100 en 300 mol/L ECH. Nadat cellen waren geladen met Fluo 4-AM, was de gemiddelde fluorescentie-intensiteit lager in cellen die waren behandeld metECH(100 mol/L) dan bij NE.

Conclusie: ECHonderdrukt NE-geïnduceerde samentrekking van de longslagader van de rat via verlaging van de intracellulaire Ca2 plus-niveaus, en induceert de relaxatie ervan via de NO-cGMP-route en opening van K-plus-kanalen (BKCa en KIR).

trefwoorden:Tibetaans kruid;echinacoside; pulmonale hypertensie; grote hoogte; vasorelaxatie; NEE; BKCa; KIR; slagader ring; pulmonale arteriële gladde spiercellen.

Voor meer informatie kunt u contact opnemen met:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola heeft veel effecten, klik hier voor meer informatie

Invoering

Aanhoudende pulmonale vasoconstrictie zoals ervaren op grote hoogte kan leiden tot pulmonale hypertensie (PH) en mediale hypertrofie [1], die zijn geïdentificeerd als de belangrijkste oorzaak van rechterventrikelhypertrofie en hartfalen [2]. Personen die tijdelijk of permanent op grote hoogte wonen, kunnen milde tot matige pulmonale hypertensie vertonen, en degenen met een grotere vatbaarheid voor hypoxie kunnen overdreven pulmonale vasoconstrictie hebben, wat leidt tot verschillende ziekten op grote hoogte die gepaard gaan met aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit, zoals longoedeem op grote hoogte en hartaandoeningen [3].Echinacoside(ECH) (Figuur 1) is afenylethanoïde glycosidegevonden in een verscheidenheid aan Chinese kruiden zoals het Tibetaanse kruid Lagotis brevituba Maxim enCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim is een soort van Lagotis spp. behorend tot de Scrophulariaceae en groeit wijdverbreid op een hoogte van meer dan 3000 meter op het Qinghai-Tibet-plateau.ECHheeft verschillende gewenste farmacologische kenmerken, zoals antioxidatieve, ontstekingsremmende, neuroprotectieve, hepatoprotectieve en stikstofoxide (NO) radicalen wegvangende eigenschappen [6]. Het kan ook endotheelafhankelijke relaxatie in de thoracale aortaringen van de rat opwekken en hart- en vaatziekten genezen [7]. Voor zover wij weten, is er echter geen onderzoek gedaan naar de effecten ervan op de vasculaire tonus in longslagaders. De doelstellingen van deze studie zijn als volgt: (1) om te onderzoeken of ECH in vitro vasorelaxatie induceert in longslagaders van ratten die vooraf zijn samengetrokken met noradrenaline (NE), en of dit effect, indien aanwezig, endotheel-afhankelijk is of direct inwerkt op vasculaire gladde spieren ; (2) om het effect van ECH op de extracellulaire calciuminstroom en intracellulaire calciumafgifte in pulmonale arteriële gladde spiercellen (PASMC's) van de rat te onderzoeken; en (3) om mogelijke routes en K-plus-kanalen te identificeren die betrokken zijn bij ECH-geïnduceerde relaxatie.

materialen en methodes

Reagentia

ECH werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Peng-fei TU van de Universiteit van Peking (Beijing, China), met een zuiverheid van meer dan 98 procent, zoals bepaald door high-performance vloeistofchromatografie. Dimethylsulfoxide (DMSO) werd gekocht bij Solar Science & Technology Co, Ltd (Beijing, China); NE, acetylcholine (ACh, groter dan of gelijk aan 99 procent), indomethacine (IMT), Nω-Nitro-L-argininemethylesterhydrochloride (L-NAME), tetraethylammoniumchloride (TEA), bariumchloride (BaCl2), {{ 9}}aminopyridine ({{10}}AP), en glibenclamide (Gli) van Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, VS); hoog-glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS) en trypsine van Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, VS); muis anti-rat primair gladde spier actine (-SMA) antilichaam en geit anti-muis secundair antilichaam van Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, China); Fluo Calcium Indicators (Fluo 4-AM) van Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, VS); en alle anorganische zouten van Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Beijing, China). IMT werd opgelost in DMSO en 5 procent NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM en ECH werden opgelost in DMSO en alle andere reagentia werden opgelost in Krebs-Henseleit (KH) of PBS-oplossing. Voorlopige experimenten toonden aan dat DMSO bij minder dan 0,1 procent (v/v) geen effect had op de spanningsontwikkeling van geïsoleerde longslagaderringen.

proefdieren

Alle procedures en protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van het Medical College of Qinghai University. Mannelijke Wistar-ratten, 6-8 weken oud, 250-300 g lichaamsgewicht, werden gekocht bij het Animal Center van Lanzhou University (Lanzhou, China) en op een standaard laboratoriumdieet en kraanwater ad libitum gehouden bij een omgevingstemperatuur van 22 ± 2 graden en een relatieve vochtigheid van 45 procent -55 procent gedurende de experimenten.

In vitro doorbloeding van de longslagader

Bereiding van pulmonale arteriële ringen bij ratten

Ratten met een gewicht van 250-300 g werden verdoofd door intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (40 mg/kg), en daarna werden hun harten en longen verwijderd en onmiddellijk ondergedompeld in ijskoude KH-oplossing die (in mmol/L) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgS04.7H20, 1,2 KH2P04, 25 NaHC03 en 11,1 glucose (pH 7,4). De intrapulmonale slagaders (0,7-1,5 mm in diameter) werden vrij van omringend bindweefsel en adventitia ontleed en vervolgens in ringen van ongeveer 2-3 mm lang gesneden. De ringen werden opgehangen in orgelkamers gevuld met 10 ml KH-oplossing bij 37 graden en begast met 95 procent O2-5 procent CO2 [8], en isometrische spanning werd gemeten met behulp van een krachtopnemer (JH-2, Space Medico -Ingenieursinstituut, Peking, China)

Beoordeling van vaatringactiviteit en beoordeling van endotheelfunctie

Vaatringen mochten 2 uur equilibreren onder een basale spanning van 400 mg, gedurende welke tijd de KH-oplossing elke 15 min werd ververst; vervolgens werd 1 μmol / L NE aan de kamer toegevoegd om de activiteit van elke ring te beoordelen door het contractiepercentage te detecteren. Voor en na het experimentele protocol werd het krimppercentage gemeten (Figuur 2A en 2B). Endotheel werd in sommige ringen verwijderd door zachtjes over het intimale oppervlak te wrijven met een fijne staaldraad, en de integriteit werd kwalitatief beoordeeld door de mate van relaxatie veroorzaakt door ACh (10 μmol/L) in het percentage contractiele tonus veroorzaakt door NE (1 mol/l). Als de relaxatie met ACh groter was dan 80 procent, bleef het endotheel in goede staat; als de relaxatie minder dan 30 procent was, werd het endotheel vernietigd (Figuur 2A en 2B) [9].

Isolatie en kweek van PASMC's van ratten

Distale longslagaders werden geïsoleerd uit longkwabben van ratten en het endotheel en adventitia werden voorzichtig verwijderd. Nadat weefsels waren gehakt tot stukjes van {{0}} mm, werden ze onmiddellijk aan de kolven toegevoegd, gedurende ongeveer vier uur op 37 graden en 5 procent CO2 in een bevochtigde incubator gehouden en vervolgens gekweekt met hoog-glucose DMEM aangevuld met 20 procent FBS, 100 E/mL penicilline en 100 E/mL streptomycine gedurende ongeveer vijf dagen. De helft van de kweekmedia werd vervangen door verse media toen cellen tevoorschijn kwamen. Toen cellen 80 procent samenvloeiing bereikten, werden ze geoogst met 0,125 procent trypsine en gezaaid in de kolven (verhouding 1:2) die hoog-glucose DMEM bevatten aangevuld met 10 procent FBS, 100 U/ml penicilline en 100 U/ml streptomycine . Voor alle experimenten werden cellen met drie tot acht passages gebruikt.

Identificatie van PASMC's door immunohistochemie

PASMC's waren positief voor immunochemische kleuring wanneer typische "hill and valley"-kenmerken werden waargenomen. Cellen werden gezaaid in 6-putjesplaten met glazen dekglaasjes. Toen cellen 80 procent samenvloeiing bereikten, werden ze gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde, gedurende 15 minuten geblokkeerd met 3 procent waterstofperoxide en vervolgens overnacht bij 4 graden geïncubeerd met muis-anti-rat primair -SMA-antilichaam. Nadat ze gedurende 10 minuten driemaal in PBS waren gewassen, werden de cellen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundair anti-muis-antilichaam van de geit, opnieuw gedurende 10 minuten driemaal in PBS gewassen en zichtbaar gemaakt met diaminobenzidine.

Detectie van de intracellulaire calciumconcentratie in PASMC's van ratten

PASMC's werden gezaaid in {{0}}putjesplaten met glazen dekglaasjes. Toen cellen 80 procent confluentie bereikten, werden de kweekmedia vervangen door serumvrij DMEM. Vierentwintig uur later werden de cellen geladen met 7 mol/L Fluo 4-AM bij 37 graden gedurende 30 minuten in een bevochtigde atmosfeer van 5 procent CO2. De resterende kleurstof werd gewassen met Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)-oplossing die het volgende bevat (in mmol/L): 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgS04·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHC03, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 en 5,56 D-glucose, zonder fenolrood. Cellen geladen met Fluo 4-AM werden blootgesteld aan een van de drie behandelingsomstandigheden: (1) de controlegroep (con-groep), waarin cellen werden geïncubeerd met serumvrij DMEM; (2) de NE-groep, waarin cellen werden geïncubeerd met serumvrij DMEM aangevuld met 1 mol/L NE gedurende 10 minuten; en (3) de NE plus ECH (100 μmol/L) groep (NE plus ECH100 groep), waarin cellen werden geïncubeerd met serumvrij DMEM aangevuld met 1 μmol/L NE gedurende 10 min en 100 μmol/L ECH gedurende 20 minuten. Fluorescentie-intensiteit werd waargenomen en gefotografeerd door fluorescentiemicroscopie (IX71, Olympus, Tokyo, Japan) [11]. Voor elk monster werden zes gezichtsvelden (200×) verzameld. De intracellulaire calciumconcentratie werd gekwantificeerd door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit te meten met behulp van Image Pro-Plus 6.0-software.

statistische analyse

Gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. Wanneer een geschikt, significant verschil werd vastgesteld met de test van Dunnett of de Student-Newman-Keuls-test voor meervoudige vergelijkingen na eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA). Een waarschijnlijkheidsniveau van P<0.05 was="" considered="">

Resultaten Vasorelaxerende effecten van ECH op geïsoleerde longslagader

Aan het begin van het experiment had de cumulatieve toevoeging van ECH van 30 tot 300 mol/L geen significant effect op de basale spanning van de longslagader. Nadat de NE-geïnduceerde vasoconstrictie een plateau had bereikt, werd ECH cumulatief (30-300 mol/L) toegevoegd aan het intacte endotheel (E plus, Figuur 2C) of endotheel-beroofde ringen (E–, Figuur 2C). In intacte endotheelringen verwijdde cumulatieve toevoeging van ECH de bloedvaten op een concentratieafhankelijke manier, met een maxi-

moeder relaxatiepercentage van 89,22 procent ±0,32 procent bij 300 mol/L en een EC50 van 51,60±0,57 μmol/L (Figuur 2A en 2C). Evenzo verwijdde ECH in endotheel-beroofde ringen de bloedvaten ook op een concentratieafhankelijke manier, maar met een significant lagere maximale respons van 67,72 procent ± 1,69 procent (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Effecten van ECH op intracellulaire calciumafgifte en extracellulaire calciuminstroom

De door endotheel ontdane ringen werden blootgesteld aan 1 mol/L NE totdat de maximale contractie was bereikt. Onder extracellulaire Ca2plus-vrije omstandigheden werden de ringen voor aanvang van de experimenten geëquilibreerd in Ca2plus-vrije KH-oplossing die 0,2 mmol/1 EGTA bevatte. Na drie wassingen met Ca2 plus- en EGTA-vrije KH-oplossing, werden de ringen gedurende 20 minuten voorgeïncubeerd met ECH (30, 100 en 300 mol/L) en vervolgens opnieuw blootgesteld aan 1 μmol/L NE. De geproduceerde ringen

niet-aanhoudende contracties die snel terugkeerden naar de basislijn, vergeleken met de initiële contracties veroorzaakt door NE, die als referentie dienden. De maximale contractie van de controle was 33,27 procent ±2,94 procent (Figuur 3A en 3E), maar was significant verminderd tot 24,54 procent ± 2,97 procent en 10,60 procent ± 2,07 procent in ringen die waren voorbehandeld met respectievelijk 100 en 300 mol/L ECH (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Rollen van verschillende remmers bij door ECH geïnduceerde vasorelaxatie van de longslagader bij ratten

Door ECH geïnduceerde vasorelaxatie van de longslagader bij ratten werd onderzocht in aanwezigheid of afwezigheid van de volgende remmers: L-NAME (eNOS-remmer), IMT (cyclo-oxygenaseremmer), TEA (groot geleidend Ca2 plus-geactiveerde K plus kanaalremmer), BaCl2 ( interne gelijkrichter K plus kanaalremmer), 4-AP (spanningsafhankelijke K plus kanaalremmer) en Gli (ATP-gevoelige K plus kanaalremmer). De ringen werden maximaal samengetrokken met 1 μmol/L NE, en vervolgens L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) , BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) of Gli (10 μmol/L) werden respectievelijk toegevoegd. Zodra een nieuw plateau was bereikt, werd ECH cumulatief toegevoegd van 30 tot 300 mol/L. De concentratie-responscurves in de aanwezigheid van verschillende remmers worden getoond in figuur 4. Het vaatrelaxerende effect van ECH op pulmonale arteriële ringen samengetrokken met 1 mol/L NE werd significant geblokkeerd door L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L) en BaCl2 (1 mmol/L), met maximale relaxaties van respectievelijk 64,41 procent ±3,20 procent, 84,38 procent ±0,70 procent en 75,27 procent ±0,93 procent (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identificatie van ratten PASMC's

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 procent) (Figuur 6A). Bruingekleurde myofilamenten werden duidelijk waargenomen in het cytoplasma bij hoge vergroting (Figuur 6B).

Cistancheechinacosidekan weerstaanapoptose

Effect van ECH op de intracellulaire calciumconcentratie in PASMC's van ratten

NE (1 μmol/L) verhoogde de intracellulaire calciumconcentratie significant (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">