Deel twee Hoe behandelt echinacoside DNA-oxidatieve schade en remt het celapoptose?

KLIK HIER VOOR DEEL EEN

Voor meer informatie kunt u contact opnemen met:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola heeft veel effecten, klik hier voor meer informatie

3. Experimenteel Sectie

3.1. cellen en Chemicaliën

Een menselijke colorectale adenocarcinoom SW480-cellijn werd gekocht bij ATCC. De cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, VS) dat 10 procent foetaal runderserum (FBS) (Gibco) en 1 procent (v/v) penicilline-streptomycine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) bij 37 graden in een bevochtigde atmosfeer die 5 procent CO2 bevat.Echinacosidewerd gekocht bij Yuanye Biotechnology, Shanghai, China (HPLC> 98 procent). Voorraadoplossingen werden bereid in DMSO (Sigma-Aldrich) en werkoplossingen werden bereid in een celkweekmedium.

3.2. MTT-levensvatbaarheidstest

Cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten met 1 x 104 cellen per putje gedurende 12 uur en vervolgens geïncubeerd in aanwezigheid vanEchinacosideof 0,01 procent DMSO gedurende 24 of 48 uur. Uiteindelijk 20 μL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) oplossing (5 mg/ ml in PBS, pH 7, 2) (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) werd aan elk putje toegevoegd en de platen werden 4 uur geïncubeerd. Na het verwijderen van het medium dat MTT bevat, werd 150 L DMSO aan elk putje toegevoegd. De platen werden gedurende 10 minuten op een platenschudder geïncubeerd en de absorptie bij 570 nm werd gemeten met een BioRad 680-microplaatlezer (Hercules, CA, VS). Elk experiment werd tweemaal in drievoud uitgevoerd. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de GraphPad Prism-software (San Diego, CA, VS).

3.3. Kolonievormingstest

Cellen werden gezaaid in 6-putjesplaten met een dichtheid van 1 x 104 per putje gedurende 12 uur en vervolgens geïncubeerd in aanwezigheid vanEchinacosideof {{0}},01 procent DMSO gedurende 10 dagen. De platen werden gewassen met PBS en cellen werden gefixeerd met ijskoude methanol en gekleurd met kristalvioletoplossing (Sigma-Aldrich) (0,5 procent in 25 procent methanol). Beelden werden gefotografeerd nadat de platen een nacht waren gedroogd. De kristalviolette kristallen werden opgelost in 70 procent ethanol en de absorptie bij 595 nm werd gemeten met een BioRad-microplaatlezer. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de GraphPad Prism-software.

3.4. DNA-fragmentatieanalyse met DAPI-fluorescentie kleuring

Na medicamenteuze behandeling werden de cellen in {{0}}putjesplaten eenmaal gewassen in PBS, gedurende 20 minuten gefixeerd in ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich) in PBS en vervolgens gekleurd met 4 ,6-diamidino-2- fenylindol (DAPI) (Sigma-Aldrich) (0,2 ug/mL) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na wassen met PBS werden de cellen verzegeld in VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, VS). Nucleaire morfologie werd gefotografeerd met een Olympus fluorescentiemicroscoop.

Echinacoside in cistanche kan het immuunsysteem versterken

3.5. Celcyclusanalyse

Cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten met 1 x 104 cellen per putje gedurende 12 uur en vervolgens geïncubeerd in aanwezigheid vanEchinacosideof {{0}}.01 procent DMSO gedurende 24 uur. Uiteindelijk werden cellen geoogst met trypsine (Invitrogen), tweemaal gewassen in PBS en vervolgens 2 uur gefixeerd met ijskoude ethanol (70 procent) bij -20 graden. Vaste cellen werden tweemaal gewassen in koude PBS en opnieuw gesuspendeerd in 300 L vers bereide PBS met 0,1 procent Triton X-100, 0,2 mg/ml DNase-vrij RNase A (Sigma), 10 ug/ml Propidiumjodide (PI) (Roche, Indianapolis, IN, VS). Na incubatie bij 37 graden in het donker gedurende 20 minuten, werden cellen gefilterd door een nylon gaas (Falcon, BD Bioscience, San Jose, CA, VS), geladen in de FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de ModFit-software (Topsham, ME, VS).

3.6. Apoptose-analyse

Cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten met 1 x 104 cellen per putje gedurende 12 uur en vervolgens geïncubeerd in aanwezigheid vanEchinacosideof 0,01 procent DMSO gedurende 24 uur. Uiteindelijk werden cellen onderzocht met behulp van een Annexin V-FITC Apoptosis-detectiekit (Best, Shanghai, China) volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden tweemaal gewassen met PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in bindingsbuffer. 5 L van elk Annexin V-FITC en Propidiumjodide (PI) (Roche) werden achtereenvolgens toegevoegd en de cellen werden gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. De cellen werden op de FACSCalibur-stroomcytometer (BD Biosciences) geladen. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Cell Quest-software (BD Biosciences).

3.7. Immunofluorescentiekleuring van 53BP1

SW480-cellen werden uitgezaaid op ronde dekglaasjes in 24-putjesplaten. Na behandeling metEchinacosideof {{0}},01 procent DMSO gedurende 24 uur, cellen werden gedurende 20 minuten gefixeerd met 4 procent PFA en geblokkeerd met 15 procent FBS (0,1 procent Triton X-100) ​​gedurende 1 uur op kamer temperatuur. Vaste cellen werden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met konijnen-anti-53BP1-antilichaam (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, VS) 1:1000 verdund in de blokkerende oplossing, gevolgd door kleuring met Cy3-geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, VS) 1:500 verdund in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na 3 x 5 minuten wassen in PBS werden de dekglaasjes verzegeld op glasplaatjes in VECTASHIELD-montagemedium met DAPI. Beelden werden genomen door een Zeiss LCM 510 confocale microscoop (Carl Zeiss, Jena, Duitsland).

3.8. 8-oxoG Incorporation Assay

Intracellulair 8-oxoG werd gemeten door kleuring met Alexa 488-geconjugeerd avidine (Invitrogen) [25]. Cellen werden gezaaid op ronde dekglaasjes in 12-putjesplaten. Na behandeling metEchinacosideof {{0}}.01 procent DMSO gedurende 24 uur, cellen werden 20 minuten gefixeerd met ijskoude methanol gevolgd door incubatie in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) (Fisher Scientific, Rockford, IL, VS) met 0,1 procent Triton X -100 (Sigma-Aldrich) gedurende 15 minuten. De monsters werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd in TBS met 0,1 procent Triton X-100 en 15 procent FBS en vervolgens gedurende 1 uur gekleurd met Alexa 488-geconjugeerd avidine (0,5 ug/ml) in blokkeeroplossing. op 37 graden. Na 3 x 5 minuten wassen in PBS werden de dekglaasjes verzegeld op glasplaatjes in VECTASHIELD-montagemedium met DAPI (Vector Laboratories). Beelden werden genomen en geanalyseerd door een Zeiss LCM 510 confocale microscoop.

3.9. Western Blot Analyse

Cellen gekweekt en behandeld in {{0}}putjesplaten werden geschraapt in RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1.0 procent IGEPAL CA-630, {{12 }} 0,5 procent natriumdeoxycholaat, 0,1 procent SDS en 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0) (Sigma). De totale eiwitconcentratie werd gemeten met BCA-kit (Dingguo, Changchun, China) volgens de instructies van de fabrikant. Monsters werden gedurende 10 minuten bij 95 graden gedenatureerd, gescheiden op 4 procent -12 procent SDS-PAGE-gel en vervolgens overgebracht naar PVDF-membranen (Millipore, Billerica, MA, VS). Membranen werden gedurende 2 uur geblokkeerd in 5 procent vetvrije melk in TBST en geïncubeerd met primaire antilichamen (Bcl-2, sc-492, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, VS; Bax, Santa Cruz , sc-493; naar c, Santa Cruz, sc-7159; p21, ab109520, Abcam, Cambridge, MA, VS; caspase 3, Abcam, ab32042; PARP, Bioss, bs-2318 R;53BP1, Bethyl Laboratories, A300-272A) 's nachts bij 4°C. Na wassen met PBS werden membranen geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (Jackson ImmunoResearch Laboratories) en gevisualiseerd met ECL Western blotting-detectiekit (Transgen Biotech, Changchun, China). Foto's werden gemaakt en geanalyseerd door een Imager (Tanon, Shanghai, China).

3.10. Meting van mobiel ROS

Intracellulaire ROS werd gemeten door flowcytometrie met behulp van een celgebaseerde ROS-assaykit (Beyotime Biotechnology, Haimen, China; S0033). Aan het einde vanEchinacosidebehandeling werden de cellen tweemaal gewassen met PBS en gedurende 30 minuten bij 37 graden geïncubeerd met 10 μM dichloorfluoresceïnediacetaat (DCFH-DA). De cellen werden vervolgens getrypsiniseerd en geanalyseerd door de FACCaliber-flowcytometer (BD Biosciences). Intracellulaire ROS-niveaus werden uitgedrukt als de gemiddelde DCF-fluorescentie-intensiteit van de cellen.

3.11. Meting van mitochondriaal membraan Potentieel

Het mitochondriaal membraanpotentieel werd gemeten met behulp van de JC-1-kleurstof (Beyotime Biotechnology, C2006) volgens de instructies van de fabrikant. Controle enEchinacoside-behandelde cellen werden 20 minuten geïncubeerd met JC-1 en vervolgens onderzocht met een Olympus fluorescentiemicroscoop.

3.12. Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism Software. Significantie werd berekend met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) enp < 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" results="" were="" expressed="" as="" mean="" ±="">

Echinacosideincistanche: NeuroprotectieEffecten

4. conclusies

In deze studie hebben we de effecten vanEchinacosideop verschillende menselijke kankercellijnen. Verrassend genoeg vonden we dat

Cistanchedeserticola heeft veel effecten, klik hier voor meer informatie

remde de proliferatie van menselijke SK-HEP-1 hepatoom, MCF-7 borstkanker en SW480 colorectale kankercellen. Verdere analyses vonden dat Echinacoside SW480-cellen in de G1-fase arresteerde en caspase-afhankelijke apoptose induceerde door de mitochondria-geassocieerde intrinsieke apoptose-route te activeren. Het stoppen van de celcyclus was gerelateerd aan opregulatie van de G1/S-CDK-blokker en DNA-syntheseremmer CDKN1B (p21), en apoptose was geassocieerd met neerwaartse regulatie van het anti-apoptotische eiwit Bcl-2 en opregulatie van pro-apoptotische Bax, evenals verlies van mitochondriale membraanpotentiaal. De significante toename van de intracellulaire geoxideerde vorm van guanine, 8-oxoG, suggereert dat er een verhoogde oxidatie van dNTP's en/of DNA-moleculen was, wat de celcyclusstilstand en apoptose in SW480-kankercellen kan hebben veroorzaakt. Terwijl de onderliggende mechanismenEchinacosideAangezien de effecten op oxidatieve schade en apoptose nog moeten worden gekarakteriseerd, ondersteunen deze resultaten Echinacoside als een nieuwe chemische basis voor de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen kanker.

Dankbetuigingen

Deze studies werden ondersteund door een subsidie ​​van de provincie Jilin (subsidienummer: 20130101120JC) en door een onderzoeksfonds van de Jilin University (projectnummer: 450091099029).

Bijdragen van auteurs

Liwei Dong voerde het meeste experimentele werk uit, analyseerde de gegevens en schreef het manuscript; Debin Yu en Nuoting Wu deden de MTT en kolonievormingstest; Hongge Wang en Jiajing Niu deden de immunokleuring en Western blot-experimenten; Ye Wang hielp met celcyclus- en apoptose-experimenten; en Zhihua Zou ontwikkelde het concept, analyseerde de data en begeleidde de uitvoering van deze studie en het schrijven van het manuscript. Alle auteurs hebben het ingediende manuscript goedgekeurd.

Belangenverstrengeling

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Echinacosideincistanchekanontstekingsremmend

Referenties

1. Jiang, Y.; Tu, PF Analyse van chemische bestanddelen in Cistanche-soorten.J. Chromatogr.2009,

1216, 1970–1979.

2. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W.Cistanche deserticolaYC Ma, "woestijn ginseng": een recensie.Ben. J. Kin. Med.2012, 40, 1123–1141.

3. Freeman, C.; Spelman, K. Een kritische evaluatie van geneesmiddelinteracties metEchinacea spp.

Mol. Nutr. Voedsel res.2008, 52, 789–798.

4. Hudson, JB Toepassingen van de fytogeneeskundeEchinacea purpurea(Paarse zonnehoed) bij infectieziekten.J. Biomed. Biotechnologie.2012, 2012, 769896.

5. Zhang, D.; Li, H.; Wang, JB Echinacoside remt amyloïde fibrillatie van HEWL en beschermt tegen A-geïnduceerde neurotoxiciteit.Int. J. Biol. Macromol.2015, 72, 243–253.

6. Wu, Y.; Li, L.; Ging.; Li, YQ Beschermende effecten van echinacoside op door tetrachloorkoolstof geïnduceerde hepatotoxiciteit bij ratten.Toxicologie2007, 232, 50–56.

7. Li, X.; Gou, C.; Yang, H.; Qiu, J.; Gu, T.; Wen, T. Echinacoside verbetert D-galactosamine plus door lipopolysaccharide geïnduceerde acute leverbeschadiging bij muizen via remming van apoptose en ontsteking.Scannen. J. Gastro-enterol.2014, 49, 993–1000.

8. Xie, H.; Zhu, H.; Cheng, C.; Liang, Y.; Wang, Z. Echinacoside vertraagt ​​cellulaire veroudering van menselijke fibroblastische cellen MRC-5.apotheek2009, 64, 752–754.

9. Wang, S.; Zheng, G.; Tian, ​​S.; Zhang, Y.; Shen, L.; Pak, Y.; Shen, Y.; Qian, J. Echinacoside verbetert de hematopoëtische functie bij 5-FU-geïnduceerde myelosuppressie-muizen.Levenswetenschap.2015, 123, 86–92.

10. Jia, Y.; Guan, Q.; Guo, Y.; Du, C. Echinacoside stimuleert celproliferatie en voorkomt celapoptose in intestinale epitheliale MODE-K-cellen door opregulatie van transformerende groeifactor- 1-expressie.J. Pharmacol. Wetenschap.2012, 118, 99–108.

11. Morikawa, T.; Ninomiya, K.; Imamura, M.; Akaki, J.; Fujikura, S.; Pan, Y.; Yuan, D.; Yoshikawa, M.; Jia, X.; Li, Z.;et al.Geacyleerde fenylethanoïde glycosiden, echinacoside en acteoside vanCistanche tubulosa, verbetering van de glucosetolerantie bij muizen.J. Nat. Med.2014, 68, 561–566.

12. Yang, X.; Li, F.; Yang, Y.; Shen, J.; Zou, R.; Zhu, P.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Werkzaamheid en veiligheid van echinacoside in een osteopeniemodel bij ratten.Evid. Gebaseerd complement. alternatief. Med.2013, 2013, 926928.

13. Kuang, R.; Zon, Y.; Zheng, X. Onderdrukking van stikstofmonoxide betrokken bij het beschermende effect van echinacoside op H2O2-geïnduceerde PC12-celbeschadiging.nat. Prod. gemeenschappelijk2010, 5, 571–574.

14. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Antioxidatieve effecten van fenylethanoïden van:

Cistanche deserticola. Biol. apotheek Stier.1996, 19, 1580–1585.

15. Zhang, Y.; Du, Y.; Le, W.; Wang, K.; Kieffer, N.; Zhang, J. Redox controle van de overleving van gezonde en zieke cellen.antioxidant. Redox-signaal.2011, 15, 2867–2908.

16. Russo, MT; Blasi, MF; Chiera, F.; Fortini, P.; Degan, P.; Macpherson, P.; Furuichi, M.; Nakabeppu, Y.; Karran, P.; Aquilina, G.;et al.De geoxideerde deoxynucleoside-trifosfaatpool levert een belangrijke bijdrage aan genetische instabiliteit in cellen met een mismatch-reparatie.Mol. Cel. Biol.2004, 24, 465–474.

17. Ventura, I.; Russo, MT; de Luca, G.; Bignami, M. Geoxideerde purine-nucleotiden, genoominstabiliteit en neurodegeneratie.Mutaat. Onderzoek2010, 703, 59–65.

18. Rajendran, P.; Nandakumar, N.; Rengarajan, T.; Palaniswami, R.; Gnanadhas, EN; Lakshminarasaiah, U.; Gopas, J.; Nishigaki, I. Antioxidanten en ziekten bij de mens.clin. Chim. Acta2014, 436, 332–347.

19. Rai, P.; Onder, TT; Jong, JJ; McFaline, JL; Pang, B.; Dedon, pc; Weinberg, RA Continue eliminatie van geoxideerde nucleotiden is noodzakelijk om een ​​snel begin van cellulaire veroudering te voorkomen.Proc. nat. Acad. Wetenschap. Verenigde Staten van Amerika2009, 106, 169–174.

20. DeNicola, GM; Karreth, FA; Humpton, TJ; Gopinathan, A.; Wei, C.; Frese, K.; Mangal, D.; Yu, KH; Ja, CJ; Calhoun, ES;et al.Oncogen-geïnduceerde Nrf2-transcriptie bevordert ROS-ontgifting en tumorigenese.Natuur2011, 475, 106–109.

21. Santos, MA; Faryabi, RB; Ergen, AV; Dag, AM; Malachowski, A.; Canela, A.; Onozawa, M.; Lee, JE; Callen, E.; Gutiérrez-Martinez, P.;et al.Door DNA-schade geïnduceerde differentiatie van leukemische cellen als een barrière tegen kanker.Natuur2014, 514, 107–111.

22. Sayin, VI; Ibrahim, MX; Larsson, E.; Nilsson, JA; Lindahl, P.; Bergo, MO Antioxidanten versnellen de progressie van longkanker bij muizen.Wetenschap. Vert. Med.2014, 6, 221–215.

23. Harris, IS; Treloar, AE; Inoue, S.; Sasaki, M.; Guerrini, C.; Lee, KC; Yung, Kentucky; Brenner, D.; Knobbe-Thomsen, CB; Cox, MA;et al.Glutathion- en thioredoxine-antioxidantroutes werken samen om de initiatie en progressie van kanker te stimuleren.kanker cel2015, 27, 211–222.

24. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimuleert cellulaire glutathion-redoxcycli door reactieve zuurstofspecies gegenereerd uit mitochondriale ademhaling in H9c2-cardiomyocyten.apotheek Biol.2013, 51, 64–73.

25. Struthers, L.; Patel, R.; Clark, J.; Thomas, S. Directe detectie van 8-oxo deoxyguanosine en 8-oxoguanine door avidine en zijn analogen.Anaal. Biochem.1998, 255, 20–31.

26. Brug, G.; Rashid, S.; Martin, SA Reparatie van DNA-mismatches en oxidatieve DNA-schade: implicaties voor de biologie en behandeling van kanker.kankers2014, 6, 1597–1614.

27. Caldecott, KW Enkelstrengs breukherstel en genetische ziekte.nat. ds. Genet. 2008, 9, 619–631.

28. Afdeling, IM; Minn, K.; van Deursen, J.; Chen, J. p53 Bindingseiwit 53BP1 is vereist voor DNA-schadereacties en tumoronderdrukking bij muizen.Mol. Cel. Biol.2003, 23, 2556–2563.

29. Nakabeppu, Y. Cellulaire niveaus van 8-oxo-guanine in DNA of de nucleotidepool spelen een cruciale rol bij de carcinogenese en overleving van kankercellen.Int. J. Mol. Wetenschap.2014, 15, 12543–12557.

30. Colussi, D.; Brandi, G.; Bazzoli, F.; Ricciardiello, L. Moleculaire routes die betrokken zijn bij colorectale kanker: implicaties voor ziektegedrag en preventie.Int.J. Mol. Wetenschap.2013, 14, 16365–16385.

31. Satelli, A.; Mitra, A.; Brownlee, Z.; Xia, X.; Bellister, S.; Overman, MJ; Kopetz, S.; Ellis, LM; Meng, QH; Li, S. Epitheliaal-mesenchymale overgeschakelde circulerende tumorcellen vangen voor het detecteren van tumorprogressie.clin. Kanker onderzoek.2015, 21, 899–906.

32. Liao, X.; Lochhead, P.; Nishihara, R.; Morikawa, T.; Kuchiba, A.; Yamauchi, M.; Imamura, Y.; Qian, ZR; Baba, Y.; Shima, K.;et al.Aspirinegebruik, tumor PIK3CA-mutatie en overleving van colorectale kanker.N. Engl. J. Med.2012, 367, 1596–1606.

33. Domingo, E.; Kerk, DN; Sieber, O.; Ramamoorthy, R.; Yanagisawa, Y.; Johnstone, E.; Davidson, B.; Kerr, DJ; Tomlinson, IP; Midgley, R. Evaluatie van PIK3CA-mutatie als voorspeller van het voordeel van niet-steroïde anti-inflammatoire medicamenteuze behandeling bij colorectale kanker.J. Clin. Oncol.2013, 31, 4297–4305.

34. Ahmed, D.; Eide, PW; Eilertsen, IA; Danielsen, SA; Eknaes, M.; Hektoen, M.; Lind, GE; Lothe, RA Epigenetische en genetische kenmerken van 24 darmkankercellijnen.oncogenese2013, 2, doi:10.1038/oncsis.2013.35.