Deel 1: Effect van acteoside als celbeschermer om een ​​gekloonde hond te produceren

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Division of Animal & Dairy Science, College of Agriculture and Life Science, Chungnam National University, Daejeon, Republiek Korea,

2 Afdeling Biologie Onderwijs, College van Onderwijs,Chonnam National University, Gwangju, Republiek Korea

Contact:joanna.jia@wecistanche.com

Pls klik hier om deel 2

Abstract

Somatische celkernoverdracht (SCNT) is een bekende laboratoriumtechniek. Het principe van de SCNT omvat het herprogrammeren van een somatische kern door een somatische cel te injecteren in een ontvangende eicel waarvan de kern is verwijderd. Daarom worden de kerndonorcellen beschouwd als een cruciale factor in SCNT. Synchronisatie van de celcyclus van kerndonorcellen in het G0/G1-stadium kan worden geïnduceerd door contactremming of serumverhongering. In dit onderzoek,acteoside, een fenylpropanoïde glycosideverbinding, werd onderzocht om te bepalen of het toepasbaar is voor het induceren van celcyclussynchronisatie, cytoprotectie en het verbeteren van SCNT-efficiëntie in foetale fibroblasten van honden. Primaire foetale fibroblasten van honden werden behandeld metacteoside(10, 30, 50 M) voor verschillende tijdsperioden (24, 48 en 72 uur). Synchronisatie van de celcyclus in het G0/G1-stadium verschilde niet significant met de inductiemethode:acteosidebehandeling, contactremming of serumgebrek. Van deze drie behandelingen resulteerde serumhongering echter in een significant verhoogd niveau van reactieve zuurstofspecies (ROS) (99,5 ± 0,3 procent) en apoptose. De resultaten lieten ook zien datacteosideverminderde ROS- en apoptose-processen, waaronder necrose in foetale fibroblasten van honden, en verbeterde celoverleving. Canine foetale fibroblasten behandeld metacteosidewerden met succes gearresteerd in de G0/G1-fase. Bovendien produceerden de gereconstrueerde embryo's met behulp van kerndonorcellen die waren behandeld met acteoside een gezonde gekloonde hond, maar niet de embryo's die werden geproduceerd met behulp van kerndonorcellen die waren onderworpen aan contactremming. Tot slot,acteosidegeïnduceerde celcyclussynchronisatie van kerndonorcellen zou een alternatieve methode zijn om de efficiëntie van honden-SCNT te verbeteren vanwege de cytoprotectieve effecten.

Cistanche-acteoside kan de immuniteit verbeteren

Invoering

SCNT-techniek is gebruikt om genetisch superieure of gemanipuleerde dieren te produceren voor landbouwdoeleinden en als biomedische middelen. Met de toenemende behoefte aan diermodellen van ziekten, het redden van met uitsterven bedreigde dieren, stamcellen voor regeneratieve geneeskunde, orgaantransplantatie, enz., is de interesse in het klonen van dieren met SCNT de laatste tijd toegenomen [1-5]. Hoewel de productie van gekloonde dieren succesvol is geweest, is de efficiëntie van SCNT nog steeds erg laag [6]. De oorzaken van de lage ontwikkelingscompetentie van het SCNT-embryo omvatten vele factoren die verband houden met de kwaliteit van de ontvangende eicellen, de kwaliteit van de kerndonorcellen en de toestand van de draagmoeder [7-10].

Van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en apoptose is bekend dat ze betrokken zijn bij vrouwelijke voortplantingsprocessen, waaronder de ontwikkeling van eicellen in vivo en in vitro [11-14]. ROS onderbreekt de embryo-ontwikkeling door cytoplasmatische condensatie, DNA-schade en apoptose in embryo's te induceren. Ondersteunende studies hebben gemeld dat het verminderen van ROS de ontwikkeling van SCNT-embryo-ontwikkelingscompetenties tijdens in vitro kweek [15-17] verbetert. Apoptose is een fysiologisch proces dat spontaan optreedt tijdens de normale pre-implantatie embryo-ontwikkeling om de cellulaire homeostase te handhaven door DNA-beschadigde/niet-functionerende cellen te verwijderen. ROS veroorzaakt DNA-fragmentatie en verhoogt apoptotische blastomeren die de embryonale ontwikkeling verstoren. Het optreden van ROS en apoptose wordt vaker waargenomen na SCNT dan na in-vitrofertilisatie [18, 19]. Veel studies meldden dat SCNT-embryo-ontwikkelingscompetentie wordt gered door de niveaus van ROS en apoptose te verminderen door antioxidanten zoals selenium [20], insuline-transferrine-selenium [17, 21], melatonine [22] en glutathion [23] te gebruiken.

Eerdere studies meldden dat het gebruik van donorcellen die werden gestopt in het G{{0}}/G1-stadium de efficiëntie van SCNT verbeterde [7, 9, 24-28]. Het chromatine in de donorcellen in het G0/G1-stadium wordt als het meest effectief beschouwd voor de competentie van SCNT-embryo-ontwikkeling. Om de donorcelcyclus te synchroniseren, zijn contactremming, serumverhongering en chemische behandelingen vaak gebruikt [7, 25, 29, 30]. Serumverhongering verminderde echter de celoverleving en verhoogt de DNA-fragmentatie, wat leidt tot apoptose [31]. Chemische remming is een andere strategie om de celcyclus in het G0/G1-stadium te stoppen met behulp van remmers zoals roscovitine [29, 32], dimethylsulfoxide (DMSO) [33] en cycloheximide (CHX) [34]. De efficiëntie van de methode die wordt gebruikt voor synchronisatie wordt beïnvloed door de typen en soorten van de donorcellen. Voor een optimale synchronisatie van donorcellen moeten verschillende aspecten van de gebruikte methoden zorgvuldig worden geëvalueerd.

Acteoside(ook bekend als verbascoside) [{{0}}(3, 4-dihydroxyfenylethyl)-1-OaL-rhamnopyranosyl-(1 / 3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside] wordt geïsoleerd uit de violette bloemen van Syringa vulgaris. Van planten die acteoside bevatten, is bekend dat ze antimicrobiële en schimmeldodende activiteiten hebben [35-37] en ontstekingen voorkomen. Acteoside vertoont inderdaad verschillende biologische activiteiten in vitro en in vivo, zoals antioxidatieve activiteit, anti-apoptotische activiteit, cytotoxiciteit tegen verschillende tumorcellen en celcyclussynchronisatie in het G0/G1-stadium als een cycline-afhankelijke kinase (CDK)-remmer [38]. Bijvoorbeeld Lee et al.[38] rapporteerde dat behandeling met acteoside de proliferatie van humane promyelocytische HL-60-leukemiecellen kan remmen door de celcyclusstop in het G0/G1-stadium te induceren. Het effect van met acteoside behandelde donorcellen op de efficiëntie van SCNT bij honden moet echter nog worden bestudeerd.

In deze studie zijn de effecten vanacteosideop de celcyclussynchronisatie, ROS, enapoptoseop honden werden foetale fibroblasten onderzocht. De analyse van celcyclussynchronisatie, ROS en apoptose werd uitgevoerd met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Om de efficiëntie van de met het acteoside behandelde donorcellen aan te tonen, werden SCNT-embryo's gekweekt en overgebracht naar een ontvangende hond, en produceerden met succes een gezonde gekloonde hond.

cistanchekan behandelennierziekte verbeterennierfunctie

Materialen en methodes

Ethische uitspraak

In deze studie werden 44 vrouwelijke bastaardhonden (1-6 jaar oud) gebruikt als eiceldonoren en surrogaten voor embryotransfer, en een vrouwelijke beagle (van 2 jaar oud) werd gebruikt voor het opzetten van foetale fibroblastcellijnen. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Chungnam National University (goedkeuringsnummer: CNU-00487) en uitgevoerd volgens "The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", gepubliceerd door IACUC van de Chungnam National University. Honden werden binnenshuis grootgebracht in aparte kooien met een temperatuur- en ventilatiesysteem. Honden kregen eenmaal daags een commercieel dieet en kregen ad libitum water. In alle dierproeven werden honden aanvankelijk verdoofd met 6 mg/kg ketamine en xylazine en in verdoofde toestand gehouden met 2 procent isofluraan. Aan het einde van de operatie werden antibiotica (Procaine Penicilline G, Benzathine Penicilline G en Dihydrostreptomycinesulfaat) toegediend om infectie te voorkomen. Na de operatie werden de honden overgebracht naar hun eigen individuele kooien met zoet water, gecontroleerd en kregen ze speciale zorg van de verantwoordelijke dierenarts, zodat de nodige behandelingen konden worden toegediend als de dieren dat nodig hadden.

Chemicaliën

Alle chemicaliën werden gekocht bij Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, VS), tenzij anders vermeld. Acteoside werd verkregen van Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. in China.

Isolatie van foetale fibroblasten bij honden

Foetale fibroblasten van honden werden verkregen van {{0}}dag oude foetussen. In het kort, een vrouwelijke beagle werd kunstmatig geïnsemineerd met het sperma van een mannelijke beagle. Na 28 dagen werd zwangerschap bij de vrouwelijke beagle bevestigd en werden 5 foetussen verkregen door celiohysterectomie. Foetussen werden driemaal gewassen in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, VS). Het hoofd, de inwendige organen en de ledematen van de foetussen werden verwijderd met een chirurgisch mes en de overige lichaamsdelen werden fijngehakt in PBS. Stukjes foetussen werden tweemaal gewassen door centrifugeren bij 400 x gedurende 5 minuten en gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco) aangevuld met 1 procent penicilline-streptomycine (productnr. P4458) en 20 procent foetaal runderserum (FBS; Gibco) bij 39 graden in een bevochtigde atmosfeer van 5 procent CO2 en 95 procent lucht. Toen cellen na 5-7 dagen samenvloeiing bereikten, werden ze gedurende 2 minuten behandeld met 0, 25 procent trypsine-EDTA (Gibco) en geoogst. Twee foetale fibroblastcellijnen van honden werden vastgesteld van twee individuele foetussen. De cellen werden ingevroren in 10 procent DMSO in FBS en bewaard in vloeibare stikstof bij -196 graden totdat ze werden gebruikt.

cel behandeling

De bevroren hondenfibroblasten werden ontdooid en gekweekt tot 80 procent confluentie. Cellen werden geoogst en 4 tot 7 keer gepasseerd voor daaropvolgende experimenten. Cellen werden gezaaid in een concentratie van 106/ml in kweekschalen van 60 mm. De cellen werden gekweekt in (1) DMEM aangevuld met 10 procent FBS en 1 procent penicilline-streptomycine gedurende vijf dagen (contactremming), (2) DMEM aangevuld met 0,5 procent FBS en 1 procent penicilline-streptomycine gedurende vijf dagen (serumverhongering) of (3) DMEM aangevuld met 10 procent FBS en 1 procent penicilline-streptomycine met acteoside bij 10 M, 30 M of 50 M gedurende 24 uur, 48 uur en 72 uur (behandeling met acteoside).

Celcyclusanalyse door flowcytometrie

Voor analyse van de stadia van de celcyclus werden cellen geoogst met behulp van {{0}},25% trypsine-EDTA en driemaal gewassen met PBS door middel van centrifugatie. Na de laatste wasbeurt werden de supernatanten weggegooid en werden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 0,3 ml PBS. Voor fixatie werd {{10}},7 ml koude absolute ethanol druppelsgewijs toegevoegd aan de celsuspensie, gemengd door voorzichtig te vortexen en overnacht bewaard bij 4 graden. De gefixeerde cellen werden gecentrifugeerd en tweemaal gewassen met koude PBS. De cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 0,25 ml PBS aangevuld met 5 L 10 mg/ml RNase en gedurende 1 uur bij 37 graden geïncubeerd. Vervolgens werd 10 L van 1 mg/mL propidiumjodide (PI) toegevoegd. De celcyclus werd geanalyseerd door kwantificering van het DNA-gehalte in celpopulaties op G0/G1 (2n), S (tussen 2n en 4n) en G2/M (4n) fasen met behulp van een FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA).

ROS-detectie door flowcytometrie

ROS in levende cellen werd beoordeeld met behulp van een Image-iT ™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, VS). In het kort, cellen werden gewassen in PBS na verwijdering van het kweekmedium en 2 ml van de 100 M tert-butylhydroperoxide (TBHP) werkoplossing werd toegevoegd. Na 1 uur incubatie bij 37°C werd de TBHP-werkoplossing verwijderd en werden de cellen 3 keer voorzichtig gewassen in warme Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS; Gibco). Cellen werden vervolgens geïncubeerd in 25 μM 5-(en-6)-carboxy-2,7-dichloordihydro-fluoresceïnediacetaat (carboxy-H2DCFDA) werkoplossing bij 37 graden gedurende 30 minuten in het donker . Wanneer geoxideerd, straalt carboxy-H2DCFDA groene fluorescentie uit, wat de beoordeling van ROS door flowcytometrie vergemakkelijkt. TBHP, dat een inductor is van ROS-productie, werd gebruikt als een positieve controle. De kernen van de cellen werden gekleurd met Hoechst 33342. Na 3 keer wassen met PBS werden cellen geoogst door trypsinisatie, gesuspendeerd in PBS en gebruikt voor het detecteren van ROS met behulp van een FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, VS ). De snelheid van ROS-vorming werd berekend door het aantal ROS-positieve cellen te delen door het totale aantal cellen en de waarden om te zetten in percentages.

Apoptose-analyse door flowcytometrie

Apoptose-analyse werd uitgevoerd met behulp van een Vybran1 Apoptosis Assay Kit # 2 (Molecular Probes, Eugene, OR, VS). In het kort werden de cellen geoogst door trypsinisatie en 2 keer gewassen met koude PBS. Daarna werden 100 L 1 × annexine-bindende buffer, 5 μL Alexa Fluor 488 annexine V en 1 μL PI aan de cellen toegevoegd. Na incubatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur werd 400 L 1 x annexine-bindende buffer toegevoegd en werd de celsuspensie voorzichtig gemengd. Annexine V, een Ca2 plus-afhankelijk fosfolipide-bindend eiwit, heeft een hoge affiniteit voor fosfatidylserine (PS). In levende cellen bevindt PS zich op het binnenste cytoplasmatische membraan en verplaatst naar het buitenste cytoplasmatische membraan in apoptotische cellen. Apoptotische cellen worden onderscheiden door annexine V gelabeld met Alexa Fluor 488 binding aan PS op het buitenmembraan. Bovendien kleurt PI, een nucleïnezuurbindende kleurstof, necrotische cellen met rode fluorescentie. Daarom werden apoptotische cellen met groene fluorescentie, necrotische cellen met rode fluorescentie en levende cellen met weinig of geen fluorescentie in de cellen geanalyseerd met behulp van een FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, VS). De tarieven werden berekend door de celaantallen van levende, necrotische of apoptotische cellen te delen door het totale aantal cellen en de berekende waarden om te zetten in percentages.

Verzameling van in vivo gerijpte eicellen

Om de ovulatie bij elke hond te detecteren, werd de serumprogesteron (P4)-concentratie gemeten met behulp van een DSL-3900ACTIVE progesteron Coated-tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, VS). Zoals eerder beschreven [39, 40], werd de dag waarop de P4-concentratie 4 ng/ml overschreed beschouwd als de dag van de eisprong. 72 uur na de ovulatie werden oöcyten teruggewonnen door laparotomie met behulp van aseptische chirurgische procedures. De fimbria van de eileider werd benaderd door de bursale spleet en gecanuleerd met behulp van een omgekeerde stalen flensnaald (18 gauge, 7,5 cm). Een 24 gauge intraveneuze (IV) katheter (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Korea) werd ingebracht in de landengte van de eileider nabij de uterotubale overgang, en medium 199 (Gibco) aangevuld met 1 procent penicilline-streptomycine en 5 procent FBS werd via de IV-katheter in de eileider gebracht. Eicellen werden onmiddellijk naar het laboratorium getransporteerd. In totaal werden 316 eicellen verzameld van 31 honden.

Somatische celkernoverdracht en embryotransfer SCNT werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [39]. In het kort, om cumuluscellen uit in vivo gerijpte eicellen te verwijderen, werden cumulus-oöcytcomplexen (COC) herhaaldelijk gepipetteerd in 0,1 procent hyaluronidase. Het eerste poollichaampje en de metafase-II-chromosomen werden verwijderd door aspiratie. Enucleatie werd bevestigd door kleuring met Hoechst 33342 (bisbenzimide). Foetale fibroblasten van honden werden 48 uur behandeld met 30 μM acteoside en vervolgens geoogst met 0,25 procent trypsine-EDTA. Een enkele cel, die een glad celmembraan heeft, werd overgebracht naar de perivitelline-ruimte van elke ontkernde eicel. De coupletten waren geëquilibreerd infusiemedium, namelijk 0,26 M mannitolmedium met 0,1 mM HEPES, 0,5 mM MgSO4 en 0,05 procent BSA, en gefuseerd door twee pulsen van gelijkstroom (69-75 V gedurende 15 μs) van een Electro-Cell Fusion-apparaat (NEPA-gen Co., Chiba, Japan). Deze coupletten werden gedurende 1 uur en 30 minuten geïncubeerd in medium 199 aangevuld met 10% FBS. De gefuseerde SCNT-embryo's werden gecontroleerd en chemische activering werd geïnduceerd door ze gedurende 4 minuten in 10 μM calciumionofoor (productnr. C7522, Sigma) te incuberen. SCNT-embryo's werden gewassen en vervolgens gedurende 3 uur en 30 minuten in een gemodificeerd synthetisch oviductaal vloeibaar medium (mSOF) [41] met 1,9 mM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) geplaatst. De gemanipuleerde embryo's werden binnen 4 uur na SCNT operatief overgebracht naar de eileiders van met oestrus gesynchroniseerde surrogaten. Zwangerschap werd bevestigd door echografie 26 dagen (ten vroegste) na embryotransfer.

actief ingrediëntacteosideincistanche

In vitro kweek van gekloonde embryo's

Na SCNT werden gekloonde embryo's gekweekt in 40 μL microdruppels van een gemodificeerd synthetisch oviductaal vloeibaar medium (mSOF) (10 gekloonde embryo's per microdruppel) bedekt met minerale olie bij 38,5 graden in 5 procent CO2 en 95 procent lucht. SCNT-embryo-ontwikkeling werd waargenomen van dag 2 tot dag 8.

Microsatelliet- en mitochondriaal DNA-analyse van een gekloonde hond

Totaal DNA werd geëxtraheerd uit de nucleaire donorcellen en de huid van de eiceldonorhonden, surrogaathonden en de gekloonde hond door de G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) volgens de richtlijnen van de fabrikant, en werd vervolgens geëlueerd in 100 L TE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). De hoeveelheid DNA werd gemeten met de BioSpec-nano Spectrofotometer (Shimadzu Corp., Japan).

Voor microsatellietgenotypering werden de volgende 7 specifieke genen geselecteerd: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 en FH2079. PCR werd uitgevoerd met initiële denaturatie gedurende 10 min bij 95 graden, 20 cycli bestaande uit denaturatie gedurende 30 sec bij 95 graden, 30 sec annealing bij 58 graden (-0.1 graad/cyclus), 1 min verlenging bij 72 graden en nog 15 cycli bestaande uit denaturatie gedurende 30 sec bij 95 graden, 30 sec uitgloeien bij 56 graden, 1 minuut verlenging bij 72 graden en uiteindelijke verlenging bij 72 graden gedurende 10 minuten.

Voor mitochondriale DNA-sequencing, met behulp van de volledige nucleotidesequenties van honden-mtDNA (GenBank-toegangsnr.: U96639), werden de volgende oligonucleotide-primers gesynthetiseerd: Cytochroom b-regio (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG,R: AGTTCCGATATAAGGGATGGCAGAG; Cytochroom-c-oxidase-subeenheid II (L7,054-L7.465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S-rRNA (L2.033 –L2.472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; D-lusgebied (L15.622 – L16.030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. De PCR-cycli voor deze analyse omvatten: 95 graden initiële denaturatie gedurende 5 min, 5 denaturatiecycli gedurende 30 sec bij 95 graden, 40 sec annealing bij 60 graden (-1 graden/cyclus), 1 min verlenging bij 72 graden, en de volgende 30 denaturatiecycli gedurende 30 sec bij 95 graden, 40 sec gloeien bij 55 graden, 1 minuut verlenging bij 72 graden en uiteindelijke verlenging bij 72 graden gedurende 10 minuten. PCR-fragmenten van de verschillende experimenten werden geanalyseerd met behulp van een ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., VS). Sequentie-assemblage, meerdere uitlijningen en uitlijning trimmen voor controlegebieden werden uitgevoerd met de BioEdit-software (v.7.0.5.3).

acteosideincistanchekan het immuunsysteem versterken