Deel 2:Verbascoside beschermt alvleeskliercellen tegen ER-stress
Mar 05, 2022
Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus, Paola Marciani 1, plus, Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 en Carla Perego 1,*
Pls Klik hier terug naar deel 1
3.4 Verbascoside moduleert - cellen mitochondriale activiteit en dynamiek
MTT-levensvatbaarheidstesten suggereren een mogelijke impact vanwoordelijkdirect op mitochondriën die zorgt voor de koppeling van insulinesecretie aan de voedingstoestand en de celoverleving in dit celtype. Vorm en membraanpotentiaal zijn markers van mitochondriale gezondheid [42]. We evalueerden eerst het mitochondriale membraanpotentieel door de cellen te labelen met MitoSpyw Orange CMTMRos, een permeabele kleurstof waarvan de concentratie afhangt van het binnenste mitochondriale membraanpotentieel, terwijl MitoSpyw Green FM werd gebruikt om gegevens naar de mitochondriale massa te normaliseren (Figuur 4A, B). De membraanpotentiaal van mitochondriën inwoordelijk-behandelde cellen was verhoogd in vergelijking met controle in zowel basale als stressomstandigheden. interessant,woordelijkmetabolieten oefenden verschillende effecten uit. Cafe-zuur verbeterde het mitochondriale potentieel niet, terwijl hydroxytyrosol een dosisafhankelijke verslechtering van de mitochondriale functie veroorzaakte, in overeenstemming met gegevens over de levensvatbaarheid van de cellen, een dergelijk effect was duidelijker na blootstelling aan H2O2 (Figuur S3).
Omdat de functie strikt gerelateerd is aan de morfologie, hebben we de diameter, het gebied en de cirkelvormigheid van de mitochondriën van de Feret gemeten. Acute oxidatieve stress bevordert een uitgebreide mitochondriale splitsing, wat resulteert in kleinere, circulaire mitochondriën [42]. Onder H2O2-stressomstandigheden waren mitochondriën van met verbascoside behandelde cellen meer langwerpig en vertoonden ze een groter oppervlak dan controlecellen (Figuur 4C, D en Figuur S4). Mitochondriale circulariteit was lager in met verbascoside behandelde cellen dan in controles en verschillen waren duidelijker in met H202 behandelde cellen (Figuur S3), wat opnieuw de beschermende rol van het polyfenol bevestigt.
Het vermogen van deze organellen om hun vorm aan te passen als reactie op voedingstoestanden of stressvolle omstandigheden staat onder controle van fusie- en splijtingsgebeurtenissen en vereist mitochondriale motiliteit [39]. Het volgen van mitochondriënbewegingen bracht ons ertoe de cumulatieve afgelegde afstand te berekenen en de analyse onthulde een significante toename van de mitochondriëndynamiek in de met verbascoside behandelde cellen in vergelijking met controle, al in basale omstandigheden (Figuur 4E, F en Video's S1-S4). Het effect was meer uitgesproken na H2O2-behandeling, inderdaad de voorbehandeling met verbascoside deed de impact van oxidatieve stress op de mitochondriale dynamiek bijna volledig ongedaan maken.
Samengevat ondersteunen deze gegevens sterk een sleutelrol van verbascoside bij het waarborgen van de dynamiek van mitochondriën, wat cruciaal is om de snelle aanpassing van dit organel aan stressomstandigheden te bevorderen.
3.5 Verbascoside-impact op de overleving en functie van de mens van Langerhans
Gezien het translationele potentieel vanwoordelijktoepassing in de menselijke gezondheid, hebben we de impact ervan op menselijke geïsoleerde eilandjes van Langerhans geverifieerd, een relevanter model voor fysiopathologische en farmacologische studies op -cellen. Geïsoleerde eilandjes werden gedurende 5 dagen behandeld met 16 uM verbascoside en het mitochondriale membraanpotentieel werd geëvalueerd. Zoals vermeld in figuur 5A, nam het organelpotentieel van menselijke controle-eilandjes na blootstelling aan H2O2 weliswaar af, maar het binnenmembraanpotentieel van mitochondriën in voorbehandelde eilandjes met verbascoside nam niet significant af, wat de hypothese ondersteunt van een beschermende rol van verbascoside tegen ROS-geïnduceerde - cel disfunctie. Analyse van de expressie van ER-stressmarkers toonde een belangrijke vermindering van de P-eIF2-fractie in de twee verschillende eilandjespreparaten die in 16 uM verbascoside werden gehouden, wat de neerwaartse regulatie van deze route ook in menselijke monsters bevestigt (Figuur 5D). De gunstige effecten van de polyfenolbehandeling werden bevestigd door het verhoogde insulinegehalte dat werd waargenomen in met verbascoside behandelde eilandjes in vergelijking met controles (Figuur 5B). Gegevensdispersie in onze experimenten maakte het niet mogelijk om enig significant verschil van glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) in met verbascoside behandelde eilandjes aan te tonen, hoewel een positieve trend duidelijk lijkt onder zowel basale als stressomstandigheden (Figuur 5C).
4. Discussie
Oxidatieve stress en ontsteking zijn de basis van celdisfunctie die optreedt tijdens T2D [43,44] als zodanig zijn functionele voeding, nutraceuticals en fytochemicaliën onderzocht als hulpmiddelen om diabetes type 2 te voorkomen [45]. In dit werk hebben we ons gericht op verbascoside, waarvan bekend is dat het ontstekingsremmende en antioxiderende activiteiten in neuronen uitoefent [18]. Ondanks de hoge structurele complexiteit zijn verbascoside en isoverbascoside gevonden in het bloedplasma van ratten die werden gevoed met Lippia citriodora-extract samen met enkele metabolieten [20]. Bovendien is celaccumulatie van verbascoside en isoverbascoside gedetecteerd in een borstkankercellijn SKBR3 [23] en onderzoeken uitgevoerd op Caco-2-cellen tonen aan dat matige hoeveelheden verbascoside en isoverbascoside intact en biologisch toegankelijk blijven na in vitro vertering werkwijze. Bovendien kan Caco-2 beide moleculen opnemen via een snel en lineair transport in een bereik van 10 tot 100 uM [22]. Er zijn geen gegevens gerapporteerd over de biologische beschikbaarheid van verbascoside bij mensen, en toch suggereren de bovengenoemde onderzoeken dat het mogelijk is voor niet-gemetaboliseerd verbascoside om de darmbarrière te passeren, in bloedplasma te circuleren en antioxiderende effecten uit te oefenen op endocriene cellen van de alvleesklier.
We vonden een dosisafhankelijke (0.8–16 uM) beschermende rol van verbascoside op klonale en menselijke cellen, zowel onder basale als onder stressomstandigheden. Dit effect is te wijten aan verbascoside zelf en niet aan zijn metabolieten cafeïnezuur en hydroxytyrosol, die in feite cytotoxisch lijken bij een concentratie van 16 uM. De concentraties die in onze experimenten actief zijn gebleken, komen overeen met die beschreven bij dieren die verbascoside kregen [20].
Hoewel we niet weten of verbascoside extracellulair werkt door te binden aan een membraanreceptor of wordt geïnternaliseerd door endocytose en intracellulair werkt, bevestigen onze gegevens dat verbascoside antioxiderende en ontstekingsremmende eigenschappen heeft en cellen beschermt tegen ER-stress-gerelateerde disfuncties door de UPR en het bevorderen van mitochondriale dynamiek.
We hebben inderdaad een significante afname van het ROS-gehalte gedetecteerd in met verbascoside behandelde cellen, wat verder wordt bevestigd door de afname van lipideperoxidatie gemeten door HNE- en acroleïne-expressies. In tegenstelling tot de meeste plantaardige polyfenolen, volgt de verbascoside ROS-opruimingsactiviteit voornamelijk indirecte (via opregulatie van ROS-verwijderende enzymen) in plaats van directe routes. In feite verhoogt het de gentranscriptie van sommige antioxidante enzymen door de activering van Nrf2 (NF-E2-gerelateerde factor 2)-route en via AhR (arylkoolwaterstofreceptor)-afhankelijk mechanisme [24,29]. Als zodanig vonden we verhoogde expressie van SOD1 in met verbascoside behandelde cellen.
ROS-homeostase is uiterst relevant in de pathologie van cellen. Vanwege het tekort aan antioxidante enzymen kan een verhoogde productie van ROS niet worden geneutraliseerd en wordt ER-stressbevorderende eiwitmisvouwing geïnduceerd. ER-stress leidt tot een vermindering van insulinetranscriptie en -translatie door de activering van de UPR [44,46]. Deze route heeft als hoofddoel het herstellen van de ER-functie door de herprogrammering van genexpressie, maar bij overstimulatie veroorzaakt het apoptose. Onze gegevens suggereren dat een belangrijke actie van verbascoside is om de UPR te verminderen, waardoor de aanpassingen mogelijk zijn die nodig zijn om ER-disfunctie te herstellen, zonder apoptose te veroorzaken. Volgens deze mogelijkheid was de expressie van BIP-, HSP70- en PERK-eiwitten verlaagd in met verbascoside behandelde cellen, en de activering van de PERK-route werd verzwakt als reactie op door tunicamycine geïnduceerde ER-stress. Een vergelijkbare werking werd gemeld voor tyrosol in de insulinoma NIT-1 cellijn [47].
Bijzonder interessant is het vermogen van verbascoside om de activering van de PERK-tak van de UPR te moduleren. In -cellen is deze route vereist om de basale secretoire homeostase en -celoverleving te handhaven, en het is ernstig gedereguleerd bij diabetes [41,48]. Nog meer intrigerende, veel voorkomende varianten bij PERK dragen bij aan het risico op prediabetes en recessieve mutaties in het EIF2AK3-gen (dat codeert voor PERK) liggen ten grondslag aan de gevoeligheid voor het Wolcott-Rallison-syndroom dat wordt gekenmerkt door permanente neonatale insulineafhankelijke diabetes [49,50].
Downregulatie van de IKB-NFKB ontstekingsroute werd ook gedetecteerd in ons systeem in aanwezigheid van verbascoside. NFKB vertegenwoordigt de belangrijkste ontstekingsroute in -cellen en de aanhoudende activering ervan initieert een cascade van gebeurtenissen die culmineert in celdood. In gestresste cellen beschermt de reductie van NFKB-expressie pancreascellen tegen diabetogene middelen [27,51], wat de toepassing van verbascoside bij diabetespreventie verder ondersteunt. Interessant is dat PERK-signalering de transcriptiefactoren NFR2 (betrokken bij de redoxhomeostase) en NFKB activeert, wat de antioxiderende en ontstekingsremmende effecten van verbascoside verklaart [40,52].
Onze gegevens onthullen ook een belangrijke rol van verbascoside op mitochondriale activiteit en dynamiek.
Marker van mitochondriale operationele kwaliteit is hun dynamiek, een proces dat wordt gekenmerkt door gecoördineerde cycli van fusie- en splijtingsgebeurtenissen die het mitochondriale aantal, de distributie, morfologie en membraanpotentiaal reguleren [39]. In overeenstemming met deze mogelijkheid verbetert verbascoside het tc3 mitochondriale membraanpotentieel, zowel onder basale als stressomstandigheden. Nogmaals, het effect is te wijten aan verbascoside en niet aan zijn metabolieten, aangezien cafeïnezuur de mitochondriale functie niet verbetert en hydroxytyrosol het organelpotentieel aanzienlijk vermindert. Verhoogde mitochondriale dynamiek en veranderingen in hun morfologie werden waargenomen door mitochondriale bewegingen te volgen, wat suggereert dat verbascoside een mito-morfoseprogramma bevordert. Het hervormen van het cellulaire mitochondriale netwerk beïnvloedt de assemblage van de supercomplexen van de ademhalingsketen, waardoor niet alleen het celmetabolisme verandert, maar ook de redoxtoestand ervan en cellen in staat stellen oxidatieve stress en ontsteking beter tegen te gaan [5,37,39].
Hoewel het moleculaire mechanisme nog onbekend is, kunnen we veronderstellen dat verbascoside, net als andere polyfenolen, het mitochondriaal DNA beschermt door de ROS-concentratie [53] te verlagen en de opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie [54] voorkomt, waardoor de fysiologische mitochondriale activiteit wordt gewaarborgd. Een andere intrigerende mogelijkheid is dat wijziging van de dynamiek en activiteit van mitochondriën opnieuw wordt gemedieerd door de werking van verbascoside op de UPR. Een recent onderzoek op mitochondriaal gebied geeft inderdaad aan dat plaatsen van ER-mitochondriën-interactie een sleutelrol spelen bij de controle van mitochondriale dynamiek en activiteit als reactie op oxidatieve stress en PERK is betrokken bij het fenomeen [55]. De meeste in vitro-onderzoeken met polyfenolen werden uitgevoerd in cellijnen, vaak van tumorale oorsprong, die verschillen van de oorspronkelijke cellen in termen van metabolisme en ROS-productie. We leveren hier bewijs dat verbascoside ook een beschermend effect uitoefent op geïsoleerde menselijke eilandjes van Langerhans, het laatste doelwit van interventie bij diabetes. Interessant is dat het polyfenol de PERK-signaleringsactivering al onder basale omstandigheden vermindert, waardoor het insulinegehalte wordt verhoogd en oxidatieve stress-gemedieerde mitochondriale disfuncties worden voorkomen. Het moet nog worden opgehelderd of het polyfenol-efect op het insulinegehalte een weerspiegeling is van het vermogen van de verbinding om celdood te voorkomen, ER-stress te verminderen of om de genexpressie van insuline direct te regelen, zoals aangetoond voor andere polyfenolische verbindingen [56]. Deze gegevens zijn met name relevant gezien het mogelijke gebruik van verbascoside als aanvullende therapie bij de behandeling van diabetes.
5. Conclusies
De hier gerapporteerde in vitro-onderzoeken op klonale en menselijke cellen geven aan dat verbascoside beschermende effecten uitoefent tegen ER-stress-geassocieerde disfuncties, waardoor de activering van de PERK-tak van de UPR wordt verminderd en de dynamiek van mitochondriën wordt verbeterd. Aangezien verstoring van ER-homeostase leidt tot celbeschadiging en diabetes, bieden deze gegevens een reden voor het mogelijke gebruik van verbascoside als nutraceutica bij ziektepreventie en -behandeling. Toch moeten er veel problemen worden opgelost voor een effectieve klinische toepassing van verbascoside. Ondanks de rijkdom aan laboratoriumonderzoeken, zijn betrouwbare klinische onderzoeken die de gezondheidseffecten van verbascoside in vivo bevestigen, beperkt. Bovendien is het verhogen van de stabiliteit en biologische beschikbaarheid verplicht voor de toekomstige toepassing van deze verbinding in de menselijke gezondheid. Vanaf dit punt is verbascoside een interessant molecuul omdat de steiger verschillende reactieve plaatsen heeft die kunnen worden gewijzigd door combinatorische chemie. We verwachten dat de informatie die uit deze onderzoeken voortkomt, wegen zal openen voor therapeutische modulatie van oxidatieve stress en ontsteking in pathologische omstandigheden door gebruik te maken van natuurlijke verbindingen.
Aanvullend materiaal: het volgende is online beschikbaar op http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Figuur S1: Effecten van cafeïnezuur en hydroxytyrosol op de levensvatbaarheid van cellen. Figuur S2: effecten van verbascoside op door tunicamycine geïnduceerde ER-stress. Figuur S3: Effecten van cafeïnezuur en hydroxytyrosol op mitochondriaal membraanpotentieel. Figuur S4: Kwantitatieve beeldanalyses van mitochondriën in cellen die zijn behandeld met cafeïnezuur en hydroxytyrosol. Video S1, S2 Video's: Mitochondria-dynamiek opgenomen onder basale omstandigheden, bij afwezigheid (S1) of aanwezigheid (S2) van verbascoside. Video S3, S4: Mitochondria-dynamiek opgenomen onder oxidatieve stressomstandigheden, bij afwezigheid (S3) of aanwezigheid (S4) van verbascoside.
Auteursbijdragen: Conceptualisatie, AG, PM en CP; gegevensbeheer, AG en PM; formele analyse, AG en PM; financiering acquisitie, CP; onderzoek, MC; methodologie, AM en SG; middelen, FB, RR en ADG; toezicht, CP; validatie, AM, SG en MC; visualisatie, AG en AM; schrijven-origineel ontwerp, AG; schrijven - recensie en redactie, PM, AM, FB, RR, ADG, MC en CP Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.
Financiering: Dit onderzoek heeft geen externe financiering gekregen.
Dankbetuiging: We willen Carlo Corino en Mario Dell'Agli bedanken voor de reagentia en de nuttige discussie.
Belangenverstrengeling: De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Referenties
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: wereldwijde schattingen van diabetesprevalentie voor 2017 en projecties voor 2045. Diabetes Res. clin. Praktijk. 2018, 138, 271-281. [Kruisref]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Diabetes op het kruispunt: relevantie van ziekteclassificatie voor pathofysiologie en behandeling. Diabetologie 2016, 59, 13-20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. De celbiologie van de systemische insulinefunctie. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273-2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Cholesterolmetabolisme, pancreascelfunctie en diabetes. Biochim. en Biophys. Acta (BBA) Mol. Basis Dis. 2019, 1865, 2149-2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Algerije, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Vormgeven van pancreas-celdifferentiatie en werking: de invloed van mechanotransductie. Cellen 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabetes Mellitus en de cel: de laatste tien jaar. Cel 2012, 148, 1160-1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ME; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Verminderde insuline-exocytose in menselijke pancreascellen met genvarianten die verband houden met diabetes type 2. Diabetes 2012, 61, 1726-1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Dynamiek van insulinesecretie bij obesitas en diabetes. Int. J. Obes. 2000, 24, S29-S31. [Kruisref]
9. Roden, M.; Shulman, GI De integratieve biologie van type 2 diabetes. Natuur 2019, 576, 51-60. [Kruisref]
