Interferentie van fenylethanoïde glycosiden van Cistanche Tubulosa met de MTT-assay

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu en Yu-Qi Gao

Abstract:

De MTT-assay, als screeningsmethode, is op grote schaal gebruikt om de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen te meten. Er moet echter worden opgemerkt dat de MTT-assay mogelijk niet nauwkeurig het effect vanCistanche tubulosaethanolisch extract op de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen. Om de componenten die verantwoordelijk zijn voor de tegenstrijdige waarnemingen van de MTT-assay, echinacoside en acteoside, te onderzoeken en te identificeren, werden twee belangrijke fenylethanoïde glycosiden uit C. tubulosa ethanolisch extract geïsoleerd. De gegevens afkomstig van CCK-8, Hoechst 33342 en annexine V-FITC/PI-assays suggereren dat de caffeoylgroep die aanwezig is in beide geïsoleerde verbindingen verantwoordelijk was voor de tegenstrijdige resultaten van de MTT-assay. Deze gegevens benadrukken de noodzaak om een ​​verscheidenheid aan verschillende methoden te gebruiken om het effect van medicinale middelen op de levensvatbaarheid van cellen te bepalen om het genereren van misleidende resultaten te voorkomen.

Trefwoorden: MTT-test;fenylethanoïde glycoside; cafeïne zuur; levensvatbaarheid van de cellen; interferentie

Invoering

De parasitaire plantCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceae-familie) is wijd verspreid in Noord-Afrikaanse, Arabische en Aziatische landen [1]. De stamt uitCistanche tubulosaenCistanche deserticolazijn belangrijk in de traditionele Chinese geneeskunde, omdat ze zijn gebruikt voor de behandeling van impotentie, onvruchtbaarheid, lumbago en constipatie als gevolg van inertie van het colon [2]. Bovendien is aangetoond dat het ethanolische extract van Cistanche tubulosa een significant beschermend effect heeft tegen cerebrale hypoxie bij muizen [3].

Endotheelcellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van hypoxische pulmonale hypertensie. De EA.hy926-endotheelcellijn is aanzienlijk vergelijkbaar met primaire endotheelcellen. Tijdens ons eigen onderzoek naar het antihypoxische effect vanCistanche tubulosaethanolisch extract op EA.hy926-endotheelcel, merkten we dat de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) test, die vaak wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen in onderzoeken naar cytotoxiciteit en cytostatische activiteit, genereerde tegenstrijdige resultaten door een verhoogde levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen na behandeling aan te tonen.

Nauwkeurige beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen is essentieel om mogelijke cytotoxische of cytoprotectieve effecten van een geneesmiddel te identificeren. We hebben daarom onderzocht welke componenten aanwezig in C. tubulosa ethanolisch extract verantwoordelijk kunnen zijn voor de tegenstrijdige resultaten die zijn waargenomen met de MTT-assay. We hebben twee belangrijke fenylethanoïde glycosiden (PhG's) geïsoleerd uit C. tubulosa ethanolisch extract, echinacoside (hierna verbinding 1) en acteoside (hierna verbinding 2), en bepaalden hun effect op de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen met behulp van verschillende methoden. Om verder te verduidelijken welke substituent van verbindingen 1 en 2 verantwoordelijk kan zijn voor de tegenstrijdige resultaten, hebben we hun aglyconen, cafeïnezuur (hierna verbinding 3) en 3,4-dihydroxylfenylethanol (hierna verbinding 4) getest, op de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen met behulp van dezelfde methoden.

Resultaten en discussie

Identificatie van verbindingen

De structuren van de twee verbindingen geïsoleerd uit C. tubulosa ethanolisch extract werden geïdentificeerd door kernmagnetische resonantie (NMR) en massaspectrometrie (MS) analyses en worden getoond in figuur 1. Verbinding 1 werd geïdentificeerd als echinacoside in vergelijking met eerder gerapporteerde NMR (tabel 1) en MS (m/z 785 [M−H]−) gegevens [4]. Verbinding 2 NMR-spectra waren zeer vergelijkbaar met die van verbinding 1, behalve de afwezigheid van een -D-glucopyranosylgroep (Tabel 1). Verbinding 2 (m/z 623 [M−H]− ) werd geïdentificeerd als acteoside [5]. Belangrijk is dat beide verbindingen hetzelfde aglycon hebben, waaronder cafeïnezuur (verbinding 3) en 3,4-dihydroxylfenylethanol (verbinding 4).

Levensvatbaarheidstests voor cellen

MTT- en CCK{{0}}-assays werden gebruikt om het effect van verbindingen 1-4 op de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen te analyseren. De MTT-assay toonde aan dat de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen significant toenam na behandeling met 25 en 50 μM verbinding 1, 2 of 3 (166,3 procent en 174,1 procent voor verbinding 1, 205,8 procent en 224,3 procent voor verbinding 2, en 164,8 procent en 189,6 procent voor verbinding 3, respectievelijk; p <0,05), in="" vergelijking="" met="" controlecellen="" (figuur="" 2a).="" bovendien="" heeft="" een="" morfologische="" inspectie="" van="" de="" cellen="" vastgesteld="" dat="" behandeling="" met="" 50="" m="" verbinding="" 1,="" 2="" of="" 3="" de="" vorming="" van="" paarse="" formazankristallen="" verhoogde,="" die="" worden="" beschouwd="" als="" een="" directe="" indicatie="" van="" het="" aandeel="" levende="" cellen="" (figuur="" 3).="" omgekeerd="" suggereerde="" de="" cck-8-assay="" dat="" de="" levensvatbaarheid="" van="" de="" cellen="" significant="" afnam="" na="" behandeling="" met="" 12,5,="" 25="" en="" 50="" μm="" verbinding="" 1,="" 2="" of="" 3="" (75,5="" procent,="" 45,1="" procent="" en="" 43,7="" procent="" voor="" verbinding="" 1,="" 85,5="" procent,="" 51,8="" procent="" en="" 34,3="" procent="" voor="" verbinding="" 2="" en="" 64,5="" procent,="" 48,2="" procent="" en="" 36,4="" procent="" voor="" verbinding="" 3,="" respectievelijk="" p="">< 0,05),="" vergeleken="" met="" controlecellen="" (figuur="" 2b).="" verbinding="" 4="" had="" geen="" invloed="" op="" de="" levensvatbaarheid="" van="" de="" cellen="" in="" de="" mtt-="" of="" cck-8-assay.="" de="" discrepantie="" tussen="" de="" resultaten="" die="" met="" de="" twee="" tests="" zijn="" verkregen,="" suggereert="" dat="" een="" van="" de="" twee="" tests="" de="" effecten="" van="" verbindingen="" 1="" en="" 2="" op="" de="" levensvatbaarheid="" van="" ea.hy926-cellen="" mogelijk="" niet="" nauwkeurig="">

Beoordeling van apoptose door Hoechst-kleuring

Hoechst 33342 is een celdoorlatende DNA-kleuring die wordt geëxciteerd door ultraviolet licht en blauwe fluorescentie uitzendt bij 460 tot 490 nm. Het gecondenseerde chromatine van apoptotische cellen kleurt helderder dan het chromatine van normale cellen [6]. Terwijl controlecellen uniform gedispergeerde chromatine, normale organellen en intacte celmembranen vertoonden, vertoonden cellen geïncubeerd met 50 μM verbindingen 1, 2 of 3 gedurende 48 uur de typische kleuring van apoptotische cellen (Figuur 4A). Omgekeerd verhoogde blootstelling van cellen aan 50 M verbinding 4 het aantal apoptotische kernen niet in vergelijking met de controlebehandeling.

Flowcytometrische analyse van apoptotische cellen

De annexine V-FITC/PI dubbele kleuringstest identificeert apoptotische cellen door de binding met hoge affiniteit van annexine V-FITC aan fosfatidylserine, dat wordt geëxternaliseerd in cellen die apoptose ondergaan [7]. In deze test binden levensvatbare cellen niet aan annexine V of PI en worden daarom niet gekleurd (kwadrant linksonder), vroege apoptotische cellen worden groen gekleurd door de binding van annexine V-FITC (kwadrant rechtsonder) en late apoptotische cellen zijn groen en rood gekleurd door de binding van annexine V-FITC aan respectievelijk fosfatidylserine en PI aan necrotische cellen (kwadrant rechtsboven). Zoals getoond in figuur 4B, nam het percentage apoptotische cellen toe van respectievelijk 3,74 procent (controlecellen) tot 10,32 procent, 12,95 procent en 11,30 procent. Vergeleken met controlecellen verhoogde verbinding 4 het percentage apoptotische EA.hy926-cellen niet.

In overeenstemming met de resultaten verkregen met de CCK-8-assay en door Hoechst 33342-kleuring, toonde de flowcytometrie-assay aan dat verbindingen 1, 2 en 3 apoptose induceerden in EA.hy926-cellen. Al met al suggereren deze waarnemingen dat de toename van de levensvatbaarheid van EA.hy926-cellen die werd waargenomen met de MTT-assay na behandeling met verbindingen 1-3 een vals-positief resultaat vertegenwoordigde.

Discussie

In 1983 ontwikkelde Mosmann een colorimetrische MTT-microtiterplaattest voor het meten van celproliferatie en cytotoxiciteit [8]. Deze eenvoudige test, en modificaties ervan, wordt nu op grote schaal gebruikt in celbiologische laboratoria over de hele wereld. Fractioneringsonderzoeken in zoogdiercellen gaven aan dat de gereduceerde pyridinenucleotide-cofactor, NADH, verantwoordelijk is voor de meeste MTT-reductie. Dit werd ondersteund door studies met hele cellen [9]. MTT-reductie wordt daarom geassocieerd met metabolisch actieve cellen en is niet alleen gekoppeld aan mitochondriale ademhaling, maar ook met het cytoplasma en niet-mitochondriale membranen, waaronder het endosoom/lysosoomcompartiment en het plasmamembraan [10]. De netto positieve lading op het MTT-molecuul is de primaire factor voor de cellulaire opname ervan via de plasmamembraanpotentiaal.

Met name kan de MTT-assay soms niet nauwkeurig het werkelijke effect weergeven dat een geteste verbinding op specifieke cellen heeft. De chemische structuren of groepen die tegenstrijdige resultaten kunnen veroorzaken in de MTT-assay zijn echter niet geïdentificeerd. Recente studies hebben aangetoond dat de MTT-assay het antiproliferatieve effect van (−)-epigallocatechine-3-gallaat, het meest voorkomende polyfenol in groene thee, kan onderschatten [11]. In onderzoeken die de MTT-assay gebruikten om chemogevoeligheid van tumoren te detecteren, vertoonden chemotherapeutische middelen tegen kanker, zoals epirubicine, paclitaxel, docetaxel en imatinibmesylaat (Gleevec), een verhoogde levensvatbaarheid van de cellen [12,13]. Bovendien hebben een aantal onderzoeken gemeld dat bepaalde plantenextracten en redox-actieve polyfenolen de MTT-assay zouden kunnen verstoren, omdat ze het MTT-tetrazoliumzout direct verminderen in afwezigheid van cellen [14].

De noodzaak om de MTT-formazankristallen op te lossen voorafgaand aan spectrofotometrische analyse in een microplaatlezer en de inherente eindpuntaard van de reactie beperken het gebruik van de MTT-assay tot bepaalde toepassingen. Dit leidde tot de ontwikkeling van tetrazolium-analogen waarin de fenylgroepen waren versierd met negatief geladen sulfonaatgroepen, zoals 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5- sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxamide (XTT), een negatief geladen inwendig zout [15] en 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS), een zwak zuur inwendig zout dat nauw verwant is aan MTT [16] . Deze modificaties resulteerden in de productie van in kweekmedium oplosbare formazanproducten die de vereiste van een solubilisatiestap voorafgaand aan kwantificering elimineerde. Dienovereenkomstig, aangezien de verhoogde negatieve lading op deze moleculen hun vermogen om door celmembranen te bewegen [17] verminderde, werden intermediaire elektronenacceptoren (IEA), zoals 1-methoxy-5-methylfenaziniummethylsulfaat ({{25 }}methoxy PMS) nodig waren om de reductie van tetrazolkleurstof te vergemakkelijken of om de reductiesnelheid te verhogen.

Meer recentelijk is een nieuwe generatie in water oplosbare tetrazoliumzouten ontwikkeld waarvan WST-1 het prototype is [18]. WST-1, een negatief geladen gedisulfoneerd inwendig zout dat een jodiumresidu bevat, is stabieler dan XTT en MTS in aanwezigheid van 1-methoxy PMS, het verplichte IEA. Dit leidde tot het op de markt brengen van WST-1/1-methoxy PMS als een handige proliferatiekit voor enkelvoudige reagenscellen. Er zijn verschillende andere tetrazoliumzouten in de WST-reeks ontwikkeld, waarvan WST misschien wel de meest bruikbare is-8 [19]. WST-8 lijkt cellulaire reductie-eigenschappen te hebben die sterk lijken op WST-1 en wordt onafhankelijk op de markt gebracht als de CCK-8-assay. WST-8 is ondoordringbaar voor cellen en wordt daarom extracellulair gereduceerd, via elektronentransport van intracellulair NADH naar WST-8 over het plasmamembraan gemedieerd door 1-methoxy PMS. Hoewel zowel MTT- als WST-8/1-methoxy-PMS-reductie wordt aangedreven door intracellulair NADH, lijkt de bron van NADH binnen deze twee methoden te verschillen. WST-8/1-methoxy PMS-reductie is sterker afhankelijk van de malaat/aspartaat-shuttle die de mitochondriale tricarbonzuurcyclus-NADH verbindt met de extramitochondriale ruimte [20].

In voorlopige experimenten hebben we bevestigd dat verbindingen 1, 2, 3 en 4 het MTT-tetrazoliumzout (niet getoond) niet direct konden verminderen. In de huidige studie werd de directe invloed van de verbindingen zelf met het reagens geëlimineerd door de microplaten zorgvuldig te wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat MTT- of CCK-8-oplossing werd toegevoegd, zoals aangegeven in de protocollen van de fabrikant. Desalniettemin waren de resultaten verkregen met behulp van de twee methoden nog steeds tegenstrijdig (Figuur 2). Zoals verwacht verhoogde incubatie van cellen met verbindingen 1, 2 en 3 de reductie van het tetrazoliumzout tot paars formazan, vergeleken met de controlegroep (Figuur 3), wat suggereert dat louter reductie van het tetrazoliumzout in aanwezigheid van een specifieke verbinding is niet voldoende om het vermogen van de verbinding om te interfereren met de MTT-assay te beoordelen.

Om te bepalen of verbindingen 1, 2, 3 en 4 apoptose in EA.hy926-cellen zouden kunnen induceren, werden cellulaire morfologische veranderingen en externalisatie van fosfatidylserine beoordeeld. In overeenstemming met de afname in cellulaire levensvatbaarheid die werd waargenomen met de CCK-8-assay, suggereerden de resultaten van Hoechst-kleuring en flowcytometrie-analyse met behulp van annexine V-FITC/PI dat de groeiremming die werd waargenomen na behandeling met verbinding 1, 2 en 3. ten minste gedeeltelijk te wijten aan apoptose van EA.hy926-cellen. Onze resultaten ondersteunden ook het idee dat de caffeoylgroep die aanwezig is in zowel verbindingen 1 als 2 verantwoordelijk was voor de tegenstrijdige resultaten verkregen met de MTT-assay.

Net als onze bevindingen vertoonde Rottlerin, een krachtige kaliumkanaalopener met groot geleidend vermogen, in vitro geen reactiviteit tegen MTT. Het versterkte echter sterk de vorming van formazankristallen in cellen, een resultaat dat duidelijk in strijd was met Rottlerin-remming van NF-KB en celproliferatie waargenomen door analyse van [3H]-thymidine-opname in DNA [21]. Het mechanisme waarmee Rottlerin de MTT-reductie verbeterde, werd toegeschreven aan het mitochondriale ontkoppelingseffect [22]. Rottlerin heeft een cinnamoylzuursubstituentgroep. Vergeleken met cinnamoylzuur heeft verbinding 3 twee extra hydroxylresten, die zich op C-3 en C-4 bevinden. Daarom speculeren we dat het mechanisme waarmee verbindingen 1 en 2 tegenstrijdige resultaten veroorzaken in de MTT-assay ook geassocieerd kan zijn met hun mitochondriale ontkoppelingseffecten. Om deze hypothese te testen, zijn vergelijkende studies tussen verbindingen 1, 2 en een chemische ontkoppelaar, zoals trifluorcarbonylcyanidefenylhydrazon (FCCP), nodig.

Experimentele Sectie

Reagentia en chemicaliën

Verbinding 3 (cafeïnezuurpoeder, zuiverheid=98,6 procent) werd gekocht bij Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). Verbinding 4 (3,4-dihydroxylfenylethanol-olie, zuiverheid=98,5 procent) werd verkregen van Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). MTT en dimethylsulfoxide (DMSO) werden verkregen van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). De CCK-8-assay werd gekocht bij Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan). Hoechst 33342 en annexine V-FITC/PI apoptose-detectiekits werden gekocht bij het Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China)

Plantaardig materiaal

C. tubulosa-stengels werden verzameld in de prefectuur Yutian, de autonome regio Xinjiang Uygur, China. Vouchermonsters werden gedeponeerd in het Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, China) en geauthenticeerd door Yi Zhang van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, China)

Extractie en isolatie van plantaardig materiaal

Aan de lucht gedroogde C. tubulosa (0,6 kg) stengels werden verpoederd en geëxtraheerd met 50 procent ethanol gedurende 2 uur bij 70 graden. Na verwijdering van het oplosmiddel onder verminderde druk, werd het ethanolische extract (212,5 g) opgelost en gesuspendeerd in water (2 L) en geëxtraheerd met n-butanol (2 L x 3). Het n-butanolextract (110 g) werd gechromatografeerd op een polyamidekolom en geëlueerd met ethanol/water (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), waarbij vijf fracties (A–E) werden verkregen. . Fractie B (65 g) werd gefractioneerd op een ODS-kolom; elutie met ethanol: water (1:9) afgescheiden verbinding 1 (3 g). Fractie D (10,5 g) werd gefractioneerd op een ODS-kolom; elutie met ethanol/water (1:4) gescheiden verbinding 2 (1 g).

NMR-spectra werden opgenomen op een Bruker Avance 600-spectrometer in CD30D met tetramethylsilaan (TMS) als interne standaard. Massaspectra werden uitgevoerd op een BioTOF-Q massaspectrometer.

Cel cultuur

EA.hy926-cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA, VS). Cellen werden gekweekt in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum en 1% (v/v) penicilline-streptomycine in een bevochtigde omgeving met 5% C02 bij 37 graden.

levensvatbaarheid van de cel

De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld met behulp van de MTT- en CCK{{0}}-assays. Verbindingen 1 en 2, en hun aglyconen, cafeïnezuur (3) en 3, 4-dihydroxylfenylethanol (4) werden opgelost in DMSO tot de uiteindelijke DMSO-concentratie < 0,1="" procent="" (v/v)="" in="">

EA.hy926-cellen werden gezaaid op 96-putjesplaten bij 4 x 103 cellen/putje. Na 24 uur incubatie werden cellen gedurende 24 uur behandeld met 6,25-50 M verbinding 1, 2, 3 of 4. Het kweekmedium werd verwijderd en de cellen werden tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Porties (10 L) voorraad MTT-oplossing (5 mg·mL−1) werden toegevoegd aan elk putje dat 100 L medium bevat en gedurende 4 uur met cellen geïncubeerd. Na incubatie werd het medium verwijderd en werden porties van 150 L DMSO aan elk putje toegevoegd om de formazankristallen op te lossen. Absorptie werd gemeten bij 490 nm met behulp van een microplaatlezer (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, VS). De levensvatbaarheid van de cellen werd uitgedrukt als het percentage MTT-reductie, waarbij de waarde van 100 procent werd toegekend aan de absorptie van de controlecellen. Alle experimenten werden drie keer uitgevoerd en gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).

De CCK-8-assay werd uitgevoerd volgens de literatuur met kleine aanpassingen [23]. In het bijzonder werden cellen gedurende 24 uur behandeld met 6,25-50 M verbindingen 1, 2, 3 of 4 en tweemaal gewassen met PBS vóór de toevoeging van 10 μL CCK -8-oplossing en 100 μL kweekmedia. Na 2 uur incuberen van de microplaat bij 37 graden, werd de absorptie gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer. De levensvatbaarheid van de cellen werd uitgedrukt als het percentage levensvatbare cellen ten opzichte van controlecellen (100 procent). Alle experimenten werden driemaal uitgevoerd en uitgedrukt als gemiddelde ± SD.

Beoordeling van apoptose door Hoechst 33342 Kleuring

Apoptotische morfologische veranderingen werden waargenomen door Hoechst 33342-kleuring. In het kort werden EA.hy926-cellen gezaaid op 48-putjesplaten (2 x 104 cellen / putje) en behandeld met 50 μM verbinding 1, 2, 3 of 4 gedurende 48 uur bij 37 graden, tweemaal gewassen met PBS, en gefixeerd met 4 procent (v/v) paraformaldehyde gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Na tweemaal spoelen met PBS werden de cellen 5 min bij kamertemperatuur gekleurd met Hoechst 33342 (10 ug.ml) en tweemaal gewassen met PBS. Hoechst-gekleurde kernen werden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Olympus, Tokyo, Japan).

Apoptose-analyse door flowcytometrie

Apoptotische cellen werden gedetecteerd door annexine V-FITC/PI dubbele kleuring en flowcytometrie-analyse. In het kort, na behandeling met 50 M verbinding 1, 2, 3 of 4 gedurende 48 uur, werden cellen geoogst en opnieuw gesuspendeerd in PBS bij 1 x 105 cellen·mL−1. Na centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 25 graden, werden 195 L annexine V-FITC-bindingsbuffer en 5 μL annexine V-FITC toegevoegd. Na voorzichtig mengen met de vortex werd het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Na centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 25 graden, werden 190 L FITC-geconjugeerde annexine V-bindingsbuffer en 10 μL PI toegevoegd. Na voorzichtig vortexmengen werden monsters binnen 30 minuten geanalyseerd met behulp van een FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, VS).

Statistische analyse

Alle experimentele gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. De significantie van de verschillen tussen experimentele monsters en de bijbehorende controle werd beoordeeld door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met behulp van de SPSS-software (versie 11.5). Statistische significantie werd vastgesteld op p <>

conclusies

Onze resultaten suggereren dat de overschatting van het aantal levensvatbare cellen waargenomen in de MTT-test de cytotoxiciteit van bepaalde verbindingen zou kunnen maskeren. Daarom raden we aan om tijdens het screenen van geneesmiddelen verschillende methoden te gebruiken om het effect van de specifieke verbinding op de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen (zoals CCK-8- en 3 H-TdR-assays) om te voorkomen dat er misleidende resultaten worden gegenereerd.