DEEL: Effecten en moleculair mechanisme van pachymisch zuur op renale ischemie-reperfusieschade
Mar 25, 2022
Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO, L-LI HUANG, XU-JIAZENG & XIAO-HUI LIAO
Invoering
Acuut nierletsel (AKI)is een veel voorkomende klinische ziekte die wordt veroorzaakt door meerdere etiologieën en een complex pathofysiologisch proces kent(1). De morbiditeits- en mortaliteitscijfers voor AKI zijn hoog bij volwassenen en kinderen, wat resulteert in aanzienlijke ziekenhuisopnamekosten (2,3). Een meta-analyse van de wereldwijde incidentie van AKI. De incidentiecijfers van AKI waren 21,6 procent bij volwassenen en 33,7 procent bij kinderen en de aan AKI gerelateerde sterftecijfers waren 23,9 procent bij volwassenen en 13,8 procent bij kinderen (4). AKI komt voor bij ~20 procent van de gehospitaliseerde patiënten, van wie 10 procent nierfunctievervangende therapie nodig heeft, en bij maar liefst 50 procent van de patiënten op intensive care-afdelingen, waardoor de duur en de kosten van ziekenhuisopname aanzienlijk toenemen (5). AKI wordt gekenmerkt door een scherpe afname van de glomerulaire filtratiesnelheid op korte termijn, die gepaard gaat met een toename van serumcreatinine, oligurie of beide; deze veranderingen kunnen leiden tot chronische nierziekte of nierziekte in het eindstadium (6). Vanwege de variabiliteit van nierbeschadiging, het ontbreken van betrouwbare vroege biomarkers en de heterogeniteit van paden die betrokken zijn bij pathofysiologie, zijn er momenteel geen effectieve middelen voor preventie en interventie behalve conservatieve behandeling en nierfunctievervangende therapie (7). Het identificeren van nieuwe behandelingsregimes en medicijnen voor AKI is dus bijzonder belangrijk. Het afgelopen decennium heeft een schat aan onderzoek de traditionele kijk op necrose uitgebreid. Recent onderzoek heeft traditionele opvattingen over celdood op de proef gesteld door nieuwe wegen te identificeren waarin cellen op een gereguleerde manier afsterven, maar de morfologische kenmerken van necrose vertonen (7-9). Deze gereguleerde necrose neemt verschillende vormen aan: Necroptosis, ferroptosis, pyroptosis, mitochondriale permeabiliteit transitie-gedreven necrose en parthanatos (10). Necroptose en ferroptose zijn de meest bestudeerde vormen van gereguleerde necrose in de nier(11). Een eerdere studie toonde aan dat het remmen van ferroptosis AKI effectief verbetert (12).
cistanche pharma specialvoornier
Ferroptose is een nieuw type regulerende celdood, dat voor het eerst werd voorgesteld door Dixon et al in 2012(13). Dit type celdood is ijzerafhankelijk en gaat gepaard met massale ijzeraccumulatie en lipideperoxidatie tijdens celdood(13). Ferroptose speelt een belangrijke regulerende rol bij het optreden en de ontwikkeling van verschillende ziekten, waaronder tumoren, neurologische ziekten en AKI (14). In een in vivo onderzoek werd ferrostatine 1 of 16-86 15 minuten vóór ischemie toegediend aan muizen met erge, ernstigeischemie-reperfusie letsel(IRI)-AKI, en nierweefselbeschadiging, serumcreatinine en ureum namen allemaal af bij de muizen 48 uur na ischemie, wat suggereert dat ferroptose een cruciale rol speelt in de pathogenese van IRI (ischemie-reperfusie letsel)(15). Daarom kan het reguleren van de ijzerhomeostase, het weerstaan van lipideperoxidatie en het remmen van ferroptose een veelbelovende therapeutische strategie voor AKI bieden.
Pachydermic zuur(PA), een lanostaan-type triterpenoïde van Poria cocos, heeft verschillende farmacologische effecten, zoals antitumorale, ontstekingsremmende, antioxidatieve, hypoglycemische, kalmerende en hypnotische activiteiten (16-20). Een eerdere studie heeft gemeld dat PA(Pachymisch zuur)kan nierbeschadiging tijdens sepsis bij ratten verbeteren door ontstekingsreacties te remmen en de van kernfactor erytroïde afgeleide 2 zoals 2 (NRF2) / heemoxygenase 1 (HO-1) route door antioxidantstress te activeren (21). Bovendien verbetert Poricoic acid A effectief de remming van melatonine bij de overgang van AKI naar chronische nierziekte na nierischemie/reperfusieschade(22). VADER(Pachymisch zuur)beschermt tegen AKI, maar dit beschermingsmechanisme moet nog verder worden onderzocht. VADER(Pachymisch zuur)is gemeld dat het NRF2 activeert in een onderzoek naar nierbeschadiging bij sepsis (21). Met name de eerste twee ferroptose-inducerende middelen (RSL-3 en elastine) die in ferroptose-onderzoeken zijn geïdentificeerd, initiëren de ferroptose-cascade via remming van glutathionperoxidase 4 (GPX4) en het cystine/glutamaattransportsysteem (xC-/xCT), respectievelijk, die beide stroomafwaartse doelen van NRF2 zijn (23). VADER(Pachymisch zuur)wordt verondersteld de stroomafwaartse eiwitten, GPX4 en xCT te reguleren door NRF2 te activeren en ferroptosis in AKI te verstoren. De huidige studie was gericht op het onderzoeken van het effect van PA(Pachymisch zuur)over ferroptosis bij muizen met ischemie-reperfusie nierbeschadiging en het bepalen van het onderliggende moleculaire werkingsmechanisme om nieuwe ideeën te bieden voor de behandeling van klinische AKI.
materialen en methodes
Reagentia en dieren.
VADER(Pachymisch zuur)(wit kristallijn poeder met een zuiverheid groter dan of gelijk aan 99,9 procent) werd gekocht bij MedChemExpress (cat.nr. HY-N0371) en bij 4C uit het licht bewaard. Een totaal van 30 C57BL/6 mannelijke muizen (8-10 weken; 20-25g lichaamsgewicht) werden gekocht bij Chongqing Medical University (Chongqing, China). De huisvestingsomstandigheden waren als volgt: 12 uur licht/12 uur donker, ~60 procent luchtvochtigheid, 25 graden, gratis toegang tot drinkwater en voedsel en elke 3 dagen vervanging van beddengoed; het drinkwater en het beddengoed werden voor gebruik gedesinfecteerd. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, uitgegeven door de National Institutes of Health in 1996(24). De huidige studie is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Chongqing Medical University (Chongqing, China; goedkeuringsnr. 2018-019).
Ischemie-reperfusie letsel-AKI-model.
Muizen werden gedurende 1 week onder dezelfde omstandigheden gevoerd om het niermodel te producerenischemie-reperfusie letsel, zoals eerder beschreven (25). De muizen werden verdoofd met 50-60 mg/kg pentobarbital-natrium (cat.nr. P3761; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) door middel van intraperitoneale injectie; de huid op het operatiegebied werd afgeveegd met 70 procent alcohol. De incisie bevond zich aan de linker- en rechterkant van de wervelkolom (0,5 cm), en de lengte van de incisie was 1-1,5 cm langs de rug. De nieren werden vervolgens uit de incisie getrokken om de nierpedikel bloot te leggen. Een microaneurysma-clip werd gebruikt om de pedikel vast te klemmen om de bloedstroom naar de nier te blokkeren en nierischemie te induceren. Volledige ischemie zoals aangegeven door een verandering in de kleur van de nier van rood naar donkerpaars binnen enkele seconden. Na 40 minuten ischemie werden de microaneurysma-clips losgelaten om elke nier in staat te stellen te beginnen met reperfusie, wat werd aangegeven door de verandering van de nierkleur naar rood. De spierhuid werd gehecht nadat de nierkleur weer normaal was geworden. De gehele nierischemieprocedure werd voltooid op een thermostatisch kussen en de lichaamstemperatuur van de muizen werd constant op 36.5-37 graden gehouden. In totaal werd aan elke muis 0,8 ml warme steriele zoutoplossing intraperitoneaal toegediend. Elk dier werd op een verwarmingskussen geplaatst totdat het weer volledig bij bewustzijn was en werd vervolgens teruggebracht naar zijn kooi. De muizen werden 24 uur na de operatie opgeofferd via cervicale dislocatie en het bloed werd verzameld uit de orbitale sinus. Een derde van het nierweefsel werd gebruikt voor histopathologische analyses en de resterende tweederde werd snel bewaard bij -80 graad .
Dierlijke groepen.
C57BL/6-muizen werden als volgt in vijf groepen (n=6/groep) verdeeld volgens een tabel met willekeurige getallen: Sham-groep (Sham), modelgroep (IRI), lage dosisgroep (IRI plus PA)) , matige dosisgroep (IRI plus PAw) en hoge dosisgroep (IRI plus PAg). Dieren in de drie experimentele behandelingsgroepen kregen een intraperitoneale injectie met PA(Pachymisch zuur)in doseringen van 5, 10 en 20 mg/kg. maar gedurende 3 dagen, voordat het model werd geïnduceerd. De schijnvertoning en IRI(ischemie-reperfusie letsel) groepen werden geïnjecteerd met hetzelfde volume dimethylsulfoxide gedurende 3 dagen vóór inductie van het model. De modelleringsmethode werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (25). De bilaterale nierstelen van de muizen in de schijngroep werden blootgelegd en behandeld zoals hierboven vermeld, maar werden niet vastgeklemd. De chirurgische incisie werd na 40 minuten gehecht.
Serum biochemische analyse.
De muizen werden 24 uur na de operatie opgeofferd en 0.8-1 ml bloed werd verzameld uit de orbitale sinus, men liet het 30 min rusten en centrifugeerde 10 min bij 900xg bij 4°C. De bovenste serumlaag werd verzameld, verpakt en bewaard bij -80 graden. Serumcreatinine (Scr; cat.no.c011-2-1) en bloedureumstikstof (BUN: cat.no.cO13-2-1) werden beoordeeld met behulp van reagenskits, volgens de instructies van de fabrikant (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute ).
Histopathologisch onderzoek.
24 uur na IRI(ischemie-reperfusie letsel), werden delen van de nierweefsels gefixeerd in 10 procent neutraal gebufferde formaline gedurende 24-48 uur bij kamertemperatuur, routinematig verwerkt door in paraffine in te bedden. De in paraffine gefixeerde weefselmonsters werden in plakjes van 4 m dik gesneden, die op glasplaatjes werden gemonteerd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met hematoxyline en gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur met eosine gekleurd. Een BX51-lichtmicroscoop (Olympus Corporation) werd gebruikt om de histopathologische veranderingen in de nieren te detecteren (vergroting, x200 en x400). De Paller-score werd gebruikt om renale tubulaire necrose te beoordelen in renale IRI(ischemie-reperfusie letsel)(26). Een totaal van 10 niet-overlappende gebieden werden willekeurig geselecteerd onder hoge vergroting met behulp van een optische lichtmicroscoop (vergroting, x400), en 10 niertubuli werden willekeurig geselecteerd in elk gezichtsveld. De secties van nierpathologie van drie muizen in elke experimentele groep werden willekeurig geselecteerd voor observatie. Een totaal van 10 gezichtsvelden werden willekeurig geselecteerd voor elke pathologische sectie en 10 niertubuli werden gescoord in elk gezichtsveld. Een totaal van 100 tubuli werd waargenomen voor elke muis, wat een totaal van 300 niertubuli opleverde die in elke groep werden waargenomen. Hoe hoger de score, hoe ernstiger de mate van beschadiging van niertubuli.
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
Nierweefsel werd 24 uur na de operatie verzameld. Na anesthesie werd 1 mm² nierweefsel in vivo verwijderd en gedrenkt in weefselfixatieoplossing bestaande uit 2,5 procent glutaaraldehyde en fosforzuurbufferoplossing (cat.nr. G7776; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) gedurende 2 uur bij 4 graden, gedehydrateerd in geleidelijke ethanol (50-100 procent) en propyleenoxide, ingebed in Epon 812 (cat.nr. GP18{{20}}10; Bejing Zhongjingkeyi Technology Co.Ltd. gedurende 1 uur bij 35 graden en gestold gedurende 24 uur bij 60 ° Ultradunne secties (dikte, 50-70 nm) werden op 200-mesh koperen roosters geplaatst en gekleurd met 2 procent uranylacetaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en 0,04 procent loodcitraat gedurende 15 min bij kamertemperatuur De monsters werden bekeken onder een elektronenmicroscoop (JEM-1400 plus, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.; vergroting, x5,000 en x10,{{27} }) Beelden werden verkregen met behulp van een SlowScan-ladingsgekoppelde apparaatcamera en TEM analySIS5.0-software (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH).
Antioxidant glutathion (GSH) en lipideperoxidatie malondialdehyde (MDA) detectie.
Nierweefsel (50-100mg) werd verzameld en fysiologische zoutoplossing (cat.nr. B020; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) werd aan het weefsel toegevoegd in een verhouding van 1:9 gewicht (g): volume (ml). Het weefsel werd gehomogeniseerd om 10 procent weefselhomogenaat te produceren, dat gedurende 15 minuten bij 13.800 xg bij 4 graden werd gecentrifugeerd. Het supernatant werd verwijderd en het totale eiwitgehalte van het supernatant werd bepaald met behulp van de bicinchoninezuurmethode (21). GSH(cat.no.A006-2-1) en MDA(cat.no.A003-2-2) werden beoordeeld met behulp van de reagenskits, volgens de instructies van de fabrikant (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).
Western-blotting.
Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit nierweefsels van muizen met behulp van RIPA-cellysisbuffer (cat.nr. WO{{0}}; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) en de eiwitconcentraties werden bepaald via BCA-assay (cat.nr. A{ {1}}; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute）. Gelijke hoeveelheden eiwitten （50μug） werden gescheiden via SDS-PAGE(Cox-2,10.0 ;NRF2,10.0;xCT,12.5;HO-1, 12.5; GPx4.15.0 procent) en overgebracht op PVDF-membranen (GE Healthcare Life Sciences). De membranen werden vervolgens geblokkeerd met 5 procent magere melkpoeder gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, en geïncubeerd met primaire antilichamen tegen: Cyclo-oxygenase 2(COX-2;1:1,000; cat. no.ab179800;Abcam), GPX4( 1:5,000;cat.no.ab125066;Abcam),xCT(1:2,000;cat.no.ab175186;Abcam), HO-1(1:1 ,000 cat.no.101147;Gentex) en NRF2 (1:1,000;cat.no.D1Z9C;CST) 's nachts bij 4 graden. Membranen werden vervolgens gewassen met TBST (0,1 procent Tween -20) drie keer. Na de primaire inc ubatie werden de membranen geïncubeerd met aan mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichamen (1:10,000;40295G; BIOSS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De membranen werden drie keer opnieuw gewassen met TBST en gevisualiseerd met BeyoECLPlus (cat.nr. P00185; Beyotime Institute of Biotechnology), met behulp van een Chemi Doc Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Inc.). De intensiteit van eiwitbanden werd bepaald met ImageJ v1.8.0-software (National Institutes of Health). Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.
Reverse transcriptie-kwantitatieve (RT-g) PCR.
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de nieren van muizen in verschillende groepen met behulp van TRIzol-reagens (Takara Bio, Inc.) en cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van de PrimeScript RT Reagent-kit met gDNA Eraser (cat.nr. RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) Relatieve niveaus van de doelgenen werden bepaald via qPCR met behulp van Ultra SYBR Mixture (Takara Biotechnology Co., Ltd.). RT-qPCR werd uitgevoerd in een volume van 25 ul met 2 ul cDNA, 400 nM elke sense en antisense-primer en 12,5 ul Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Takara Bio, Inc. op een ABI PRISM 7000-systeem (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). De reactie werd uitgevoerd gedurende 40 cycli van denaturatie bij 95 graden gedurende 30 sec, annealing bij 53 graden gedurende 30 sec en verlenging bij 72 graden gedurende 10 sec. De volgende primersequenties werden gebruikt voor qPCR:GPX4 forward ,5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT-3' en achteruit,5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3';NRF2 vooruit,5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT-3' en achteruit,5'-GTTGAAACTGAGCGAAAA AGGC{ {28}}';xCT vooruit, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G-3' en achteruit,5-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3';COX-2 vooruit,5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC{{ 37}}'en achteruit,5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3';HO-1 vooruit.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3' en achteruit,5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; en -actine vooruit,5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' en achteruit,5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT-3'.
Een gemiddelde waarde van genexpressie na -actine-normalisatie werd gebruikt als kalibrator om de relatieve niveaus van de doelgenen te bepalen. Relatieve expressieniveaus van de doelgenen werden berekend met behulp van de 2-△C-methode (27).
Statistische analyse.
Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software, Inc.) en SPSS 23-software (IBM Corp.. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± standaarddeviatie van drie onafhankelijke herhalingen, tenzij anders vermeld. ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc-test werd gebruikt om verschillen tussen meerdere groepen te vergelijken<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultaten
VADER(Pachymisch zuur)vermindert nierschade bij muizen met IRI(ischemie-reperfusie letsel). Scr en BUN zijn twee belangrijke indicatoren van de nierfunctie(5). De niveaus van Scr en BUN waren significant hoger in de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep vergeleken met die in de schijngroep (P<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Pachymisch zuur)verminderde significant de verhogingen van serumcreatinine en ureum in vergelijking met de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep (P<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Pachymisch zuur)behandelgroep en de IRI(ischemie-reperfusie letsel) group (P>0.05; Afb. 1A en B).
Zoals weergegeven in Fig. 1D, vertoonde H & E-kleuring van nierweefsels in de schijngroep geen significante veranderingen in de nierweefselstructuur. Omgekeerd, de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep vertoonde oedeem en verlies van renale tubulaire epitheelcellen, tubulaire dilatatie, interstitiële ontsteking, infiltratie van ontstekingscellen, collageenafzetting en afzettingsbuisnecrosemateriaal (figuur 1D). De Paller-score, een indicator van nierweefselbeschadiging(26), was significant hoger in de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groepen vergeleken met de schijngroep (P<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Pachymisch zuur)therapie verbeterde deze laesies significant en de Paller-score was significant lager in vergelijking met die in de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep (P<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(ischemie-reperfusie letsel) model group and the low-dose group (P>0.05; Afb. 1C).
Figuur 1. PA(Pachymisch zuur)verlicht nierschade na ischemie-reperfusie.(A) BUN en (B) serumcreatinine werden gemeten bij muizen in de Sham, IRI(ischemie-reperfusie letsel), IRI plus PAL-, IRI plus PAM- en IRI plus PAH-groepen (40 min nierischemie gevolgd door 24 uur reperfusie; n=6/groep). (C) Paller-scores werden gebruikt om niertubulaire schade te beoordelen in de Sham-, IRI-, IRI-plus-PAL-, IRI-plus PAM- en IRI-plus PAH-groepen (n=3/groep). (D) Hematoxyline- en eosinebeelden van de nieren van muizen in de Sham, IRI(ischemie-reperfusie letsel), IRI plus PAL, IRI plus PAM en IRI plus PAH-groep. Schaalbalk, 50 µm. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Pachymisch zuur), pachydermic zuur; BUN, bloedureum stikstof; IRI,ischemie-reperfusie letsel; L, lage dosisgroep; M, matige dosisgroep; H, hoge dosis groep.
Effecten van PA(Pachymisch zuur)over de morfologische veranderingen in mitochondriën in het nierweefsel van muizen na renale IRI(ischemie-reperfusie letsel). TEM toonde geen significante veranderingen in de mitochondriale structuur van het nierweefsel in de sham-groep. In de modelgroep werden ferroptosis-geassocieerde mitochondriale veranderingen, zoals verminderd mitochondriaal volume, verhoogde membraandichtheid en verminderde of afwezige mitochondriale cristae, waargenomen in nierweefsel (Fig. 2A). Vergeleken met die in de modelgroep vertoonden de mitochondriën van de groep met een matige dosis voornamelijk oedeem en waren de specifieke veranderingen die kenmerkend zijn voor ferroptosis zeldzaam (Fig. 2A). In de hooggedoseerde PA(Pachymisch zuur)groep werden geen karakteristieke veranderingen van ferroptosis waargenomen in de mitochondriën van het nierweefsel en werd alleen mild oedeem vertoond (Fig. 2A). De veranderingen in de mitochondriën in de laaggedoseerde groep waren dezelfde als die in de modelgroep (Fig. 2A).
Effecten van PA(Pachymisch zuur)op GSH- en MDA-expressie in renale IRI(ischemie-reperfusie letsel). GSH is een noodzakelijke cofactor voor de GPX4-functie. De GSH-synthese heeft een directe invloed op de GPX4-activiteit. MDA is een product van lipide-oxidatie, die de mate van intracellulaire lipideperoxidatie weerspiegelt en indirect het optreden van ferroptosis weerspiegelt (28,29). Zoals weergegeven in Fig. 2B, hadden de nierweefsels significant lagere niveaus van GSH in de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep vergeleken met de schijngroep. Onder de medicamenteuze behandelingsgroepen was de GSH-expressie significant hoger in de IRI plus PA- en IRI plus PAn-groepen vergeleken met de IRI(ischemie-reperfusie letsel)modelgroep (P<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Omgekeerd, zoals weergegeven in Fig. 2C, was de weefsellipideperoxidatie groter (op basis van MDA-niveaus) in de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep vergeleken met de schijngroep. Onder de medicamenteuze behandelingsgroepen waren de MDA-niveaus significant lager in de IRI plus PA- en IRI plus PAu-groepen vergeleken met de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep (P<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
Figuur 2. PA(Pachymisch zuur)vermindert ferroptosis in IRI(ischemie-reperfusie letsel)‑acuut nierletsel.(A) Transmissie-elektronenmicroscopiebeelden in de Sham, IRI(ischemie-reperfusie letsel), IRI plus PAL-, IRI plus PAM- en IRI plus PAH-groepen (40 min renale ischemie gevolgd door 24 uur reperfusie). Vergroting, x20,000; schaalbalk, 1 µm. De zwarte pijlen geven aan dat het mitochondriale volume afnam, de membraandichtheid toenam en afnam, of dat mitochondriale cristae werden waargenomen in nierweefsel. De blauwe pijlen geven mitochondriaal oedeem aan. De niveaus van (B) GSH en (C) MDA in nierweefsels werden beoordeeld (n=6/groep). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ischemie-reperfusie letsel)groep. VADER(Pachymisch zuur), pachydermic zuur; IRI,ischemie-reperfusie letsel; L, lage dosisgroep; M, matige dosisgroep; H, hoge dosisgroep; GSH, glutathion; MDA, malondialdehyde.
VADER(Pachymisch zuur)reguleert de expressie van ferroptosis-gerelateerde eiwitten in renale IRI(ischemie-reperfusie letsel). In de huidige studie werden de expressieniveaus van de ferroptosis-gerelateerde eiwitten GPX4, xCT en HO-1 gedetecteerd via western blotting (Fig. 3A en B) en RT-qPCR (Fig. 3C) analyses. De resultaten toonden aan dat de eiwitniveaus van GPX4, xCT en HO-1 significant waren gedownreguleerd in de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep vergeleken met de schijngroep (P<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Pachymisch zuur)verhoogde de eiwit- en mRNA-expressieniveaus van GPX4, xCT en HO-1 aanzienlijk in vergelijking met de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep (P<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(ischemie-reperfusie letsel)en lage dosis PA(Pachymisch zuur) treatment groups (P>0.05; Afb.3B en C).
Figuur 3. PA(Pachymisch zuur)verhoogt de expressieniveaus van de ferroptosis-gerelateerde eiwitten, GPX4, xCT en HO-1.(A) Western-blotting werd uitgevoerd om de expressieniveaus van de ferroptosis-gerelateerde eiwitten, GPX4, xCT en HO-1 in IRI te detecteren(ischemie-reperfusie letsel)‑acute nierbeschadiging muizen (n=3). (B) Relatieve uitdrukking van grijswaarden voor GPX4, xCT en HO-1. (C) Omgekeerde transcriptie-kwantitatieve PCR-analyse werd uitgevoerd om de mRNA-expressieniveaus van de ferroptosis-gerelateerde eiwitten (n=3) te detecteren. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ischemie-reperfusie letsel)groep. VADER(Pachymisch zuur), dikhuidige zuurd; GPX4, glutathionperoxidase 4; xCT, glutamaattransportsysteem; HO-1, heemoxygenase 1; IRI,ischemie-reperfusie letselj; L, lage dosisgroep; M, matige dosisgroep; H, hoge dosis groep.
De resultaten toonden aan dat de eiwit- en mRNA-niveaus van het ferroptosis-geassocieerde lipideperoxidatie-eiwit, COX-2 significant opgereguleerd waren tijdens IRI.(ischemie-reperfusie letsel)(Afb.4). Behandeling met matige dosis en hoge dosis PA(Pachymisch zuur)significant verminderde COX-2-expressie vergeleken met de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep (P<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(ischemie-reperfusie letsel)en lage dosis PA(Pachymisch zuur) treatment groups (P>0.05; Afb.4).
Figuur 4. PA(Pachymisch zuur)verlaagt de expressieniveaus van het ferroptosis-gerelateerde eiwit, COX-2.(A) Western-blotting werd uitgevoerd om de expressieniveaus van het ferroptosis-lipideperoxidatiemarkereiwit, COX-2, in IRI-acute nierbeschadigingsmuizen te detecteren. (B) Relatieve uitdrukking van grijswaarden voor COX-2. (C) Omgekeerde transcriptie-kwantitatieve PCR-analyse werd uitgevoerd om mRNA COX-2-expressie (n=3) te detecteren. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ischemie-reperfusie letsel)groep. VADER(Pachymisch zuur), pachydermic zuur; COX-2, cyclo-oxygenase 2; IRI,ischemie-reperfusie letsel; L, lage dosisgroep; M, matige dosisgroep; H, hoge dosis groep.
VADER(Pachymisch zuur)bevordert de activering van de NRF2-signaleringsroute in renale IRI(ischemie-reperfusie letsel).Om het effect van PA . te onderzoeken(Pachymisch zuur)op de NRF2-signaleringsroute werden de eiwit- en mRNA-niveaus van NRF2 beoordeeld (Fig. 5). De resultaten toonden aan dat NRF2-expressie significant lager was in de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep vergeleken met de schijngroep. Bovendien was NRF2-expressie significant hoger in de IRI plus PAw- en IRI plus PAH-groepen vergeleken met de IRI(ischemie-reperfusie letsel)groep (P<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Verder behandeling met PA(Pachymisch zuur)verhoogde ook de NRF2-expressie op een dosisafhankelijke manier (Fig. 5).
Afbeelding 5. PA(Pachymisch zuur)activeert de NRF2-signaleringsroute.(A) Western-blotting werd uitgevoerd om NRF2-eiwitexpressie in IRI . te detecteren(ischemie-reperfusie letsel)‑acute nierbeschadiging muizen. (B) Relatieve uitdrukking van grijswaarden voor NRF2 (n=3). (C) Omgekeerde transcriptie-kwantitatieve PCR-analyse werd uitgevoerd om mRNA NRF2-expressie (n=3) te detecteren. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ischemie-reperfusie letsel)groep. VADER(Pachymisch zuur), pachydermic zuur; NRF2, van nucleaire factor afgeleide erytroïde 2 zoals 2; IRI,ischemie-reperfusie letsel; L, lage dosisgroep; M, matige dosisgroep; H, hoge dosis groep.
