Deel 1: Cistanoside van Cistanche Herba verbetert door hypoxie veroorzaakte mannelijke reproductieve schade door onderdrukking van oxidatieve stress

Neem voor meer informatie contact op met: Tinatina.xiang@wecistanche.com

Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, He Wang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1

1 Afdeling Urologie, Tang Du Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi, China;

2 Ziekenhuis voor urologie en nefrologie, Xi'an People's Hospital, Xian 710100, Shaanxi, China;

3Instituut voor medische basiswetenschappen, de vierde militaire medische universiteit, Xi'an 710032, Shaanxi, China;

4 Afdeling Radiotherapie, Tang Du Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi, China. * Gelijke bijdragers. Ontvangen 1 september 2020;

Geaccepteerd op 18 januari 2021; Epub 15 mei 2021; Gepubliceerd 30 mei 2021

Abstract: Toenemend bewijs toont aan dat hypoxie een oorzaak is vanmannelijke onvruchtbaarheiden hypoxie kan verband houden metoxidatieve stress(OS). Cistanoside (Cis) is een fenylethanoïde glycosideverbinding die kan worden geëxtraheerd uit:Cistanches Herbaen heeft verschillende biologische functies. Deze studie had tot doel de beschermende effecten van Cis op veroorzaakte reproductieve schade te onderzoeken door hypoxie en de specifieke onderliggende mechanismen onderzoeken. Experimentele modellen voor cel- en dierhypoxie werden geconstrueerd en de beschermende effecten van verschillende subtypes van Cis op het mannelijke voortplantingssysteem werden zowel in vitro als in vivo beoordeeld. De resultaten gaven aan dat hypoxie de levensvatbaarheid van GC-1-cellen aanzienlijk verminderde door stopzetting van de celcyclus en apoptose-activering, die geassocieerd waren met een verhoogde OS. Bovendien vertoonde Cis sterke antioxidatieve effecten, zowel in vitro als in vivo, waardoor de antioxidant-enzymactiviteiten aanzienlijk werden hersteld en de niveaus van reactieve zuurstofspecies (ROS) werden verlaagd, terwijl de levensvatbaarheid van de cellen werd verhoogd en apoptose werd verminderd. Belangrijk is dat de hierin bestudeerde Cis-subtypes (Cis-A. Cis-B, Cis-C en Cis-H) allemaal bepaalde antioxiderende effecten vertoonden, waarvan de effecten van Cis-B het meest significant waren. Deze studie toont aan dat Cis de schadelijke effecten van hypoxie-geïnduceerde OS aanzienlijk verzacht door de antioxiderende enzymactiviteiten in teelballen en GC-1-cellen te beïnvloeden.

Trefwoorden: Cistanoside, hypobare hypoxie, mannelijke onvruchtbaarheid, oxidatieve stress, reproductieve bescherming

Invoering

Momenteel worden wereldwijd ongeveer 48,5 miljoen (15 procent) paren in de vruchtbare leeftijd getroffen door onvruchtbaarheid [1], waarvan 40-50 procent van de gevallen wordt toegeschreven aanmannelijke onvruchtbaarheid[2], een aandoening die sterk geassocieerd is met omgevings- en leefstijlfactoren. Er zijn aanwijzingen dat de gevoeligheid van de testis van zoogdieren voor lage zuurstofdruk een oorzakelijke factor is van sommige vormen vanmannelijke onvruchtbaarheid[3]. Zoals aangetoond in eerdere studies, wordt de spermatogenese verminderd en verminderd bij blootstelling aan:hypobare hypoxie [4-7].

Om het onderliggende mechanisme te onderzoeken, hebben onderzoeken aangetoond dat blootstelling aan:hypobare hypoxieverhoogt de reactieve zuurstofspecies (ROS) pro-

ductie [8, 9].ROS speelt een belangrijke rol in het mannelijke voortplantingssysteem. Bij lage niveaus zijn ze nodig voor de capacitatie van sperma, de acro-sommige reactie en spermatozoa-0celfusie [10]. Overmatige ROS kan echter nucleaire / mitochondriale DNA-schade en plasmamembraan van sperma veroorzakenperoxidatieve schade, die op hun beurt belangrijke etiologische factoren zijn voor het verhoogde risico op mannelijke onvruchtbaarheid [11,12]. De accumulatie van door hypoxie geïnduceerde ROS kan dus een oorzaak zijn van mannelijke onvruchtbaarheid.

Cistanches Herba, een meerjarige parasitaire medicinale plant, wordt wijd verspreid in droge gebieden [13]en wordt veel gebruikt vanwege zijn farmacologische activiteiten [14-17]. Van alle effectieve inhoud vanCistanches Herba, zijn PhG's beschouwd als de belangrijkste actieve component. Tot op heden zijn 34 PhG's geïsoleerd uit Cistanches-planten [13]. Cistanoside (Cis), een actieve PhG geïsoleerd uit Cistanches Herba, heeft aandacht gekregen vanwege zijn antioxiderende effecten.

Gezien de antioxiderende effecten van Cis en de rol van ROS bij door hypoxie geïnduceerdmannelijke onvruchtbaarheid, Cis wordt beschouwd als een potentieel kandidaat-geneesmiddel voor de behandeling van door hypoxie veroorzaaktemannelijke onvruchtbaarheid. Er zijn echter maar weinig rapporten die de antioxiderende effecten van Cis, gewonnen uit Cistanches Herba bij de behandeling van door hypoxie veroorzaaktemannelijke onvruchtbaarheidof de betrokken signaalroutes. In deze studie werden in vitro en in vivo hypoxie-experimentele modellen geconstrueerd en werden de effecten van verschillende Cis beoordeeld.

materialen en methodes

Celcultuur en reagens

De muis spermatogonia cellijn GC-1spg (GC-1) werd gekocht bij de American Type Culture Collection (ATCC) en gekweekt in DMEM (Invitrogen, VS) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum, 1 procent L-glutamine (100 mM), penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 ug/mL) bij 37 graden in een bevochtigde incubator met 5 procent CO, Cis (Cis-A, B, C, H) werd gekocht van Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China).

Levensvatbaarheidstest van de cel

De levensvatbaarheid van de cellen werd getest door middel van een celtelkit{{0}}-assay (CCK-8). In het kort werden GC-1-cellen uitgezaaid in 96-putjesplaten bij 1, 5 x 10 3 per putje en 24 uur gekweekt bij 37 graden. Vervolgens werden de cellen behandeld met verschillende concentraties (20 procent, 15 procent, 10 procent, 5 procent) zuurstof of verschillende concentraties （2 M, 0,2 μM, 0,02 μM） van Cis （Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) voor de vereiste tijd. Vervolgens werd het supernatant weggegooid en werd de levensvatbaarheid van de cellen gedetecteerd met behulp van een CCK-8-kit (Dojindo Japan). De absorptie van elk putje werd gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer (BioRad USA). Tenslotte werden de cellevensvatbaarheid berekend volgens de volgende formule: Cellevensvatbaarheid=(ODexperimentele groep - ODblank-groep)/ (ODcontrolegroep - ODblank-groep) × 100 procent. Western-blot-analyse Geoogste cellen of weefsels werden gehomogeniseerd in RIPA-buffer om eiwitten te extraheren (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Zwitserland). Supernatanten werden verzameld en de concentratie van eiwitten werd getest met de BCA-methode (Beyotime). Ongeveer 40 ug van de geëxtraheerde eiwitten van elk monster werd gescheiden door SDS-PAGE en elektrisch overgebracht op nitrocellulose (NC) filtermembraan (Beyotime China). NC-filtermembranen werden gedurende 1,5 uur geblokkeerd met 5% magere melk en geïncubeerd met specifieke antilichamen (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti- Bax 1:1000, anti-GAPDH 1:1000; alle antilichamen werden overnacht bij 4 graden gekocht van Cell Signaling Technology, VS). Vervolgens werden alle NC-membranen gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het overeenkomstige met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichaam en afgebeeld met een beeldvormingssysteem (Tannon, China).

Detectie van celcyclus

Een flowcytometrische test (FCM) werd uitgevoerd om de celcyclus te analyseren. Cellen werden 72 uur onder verschillende omstandigheden behandeld en geoogst. De cellen werden vervolgens gewassen met PBS, gefixeerd in 75 procent ethanol en gekleurd met propidiumjodide (PI). Voor elk monster werden 1 x 104 cellen verzameld en geanalyseerd met flowcytometrie (FACS Calibur, BD Biosciences). Vervolgens werd het aandeel G1/S/G2-fasecellen en de proliferatie-index [Fase (S plus G2)/Fase (G1 plus S plus G2) x 100 procent berekend.

Ki-67 kleuring

Cellen werden gekweekt in een confocale schaal en gedurende 72 uur behandeld met hypoxie of verschillende subtypes van Cis. Nadat alle cellen met 4 procent paraformaldehyde waren gefixeerd, werden ze geïncubeerd met het anti-Ki-67 antilichaam (1:200, Cell Signaling Technology). Vervolgens werden alle cellen geïncubeerd met een overeenkomstig CY-3-geconjugeerd anti-konijn IgG-antilichaam (1:200, Boster, China) en DAPI-oplossing (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorescentie werd waargenomen met een Fluoview FV1000 confocale microscoop (Olympus, Japan).

Detectie van ROS

FCM werd geïntroduceerd om intracellulaire ROS-niveaus te meten met behulp van DCFH-DA. Gesuspendeerde cellen werden uitgezaaid in 6-putjesplaten en onderworpen aan verschillende behandelingen. Na 72 uur behandeling werden cellen gesuspendeerd in serumvrij DMEM met 10 M DCFH-DA (Beyotime). De ROS-inhoud werd vervolgens bepaald door fluorescentie-geactiveerde celsortering op een Beckman Coulter Flow Cytometry-systeem met een excitatiegolflengte van 488 nm en een emissiegolflengte van 525 nm [18].

Bepaling van lipideperoxidatie (LPO)

De thiobarbituurzuur reactieve stoffen (TBARS) test werd uitgevoerd om LPO te detecteren. Alle bedieningsstappen werden uitgevoerd in overeenstemming met de instructies (Sigma USA). De concentraties werden berekend met een molaire extinctiecoëfficiënt van 1,56 x 105/(M-cm), die werd verkregen met malondialdehyde als standaard. De resultaten worden uitgedrukt als nmol MDA-equivalenten/mg eiwit.

Bepaling van enzymactiviteiten

De enzymactiviteiten werden getest met behulp van testkits, waaronder glutathionreductase (GR), glutathionperoxidase (GPx) en superoxidedismutase (SOD). Alle bedieningsstappen werden uitgevoerd in overeenstemming met de meegeleverde instructies (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Dieren en experimenteel protocol

Volwassen mannelijke Wistar-ratten (180-220 g, 8 w oud) werden verkregen van het dierencentrum van de Vierde Militaire Medische Universiteit, Xi'an, China. Toestemming voor het gebruik van de dieren is verkregen van de Universitaire Ethische Commissie (Referentienummer: 20190506). De dierproef is uitgevoerd volgens universitaire richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

Alle ratten mochten zich ongeveer 1 week voor aanvang van het experiment aanpassen. Na acclimatisatie werden de ratten willekeurig verdeeld in 6 groepen met 5 dieren in elke groep. De ratten in de controlegroep werden grootgebracht onder normale druk (PO.:20 procent; luchtdruk:101,3 kPa), terwijl de ratten in de model- en Cis-behandelde groepen werden grootgebracht in een lagedruk zuurstofkamer (interne druk van 61,6 kPa , gelijk aan een hoogte van 4000 meter boven zeeniveau; PO: 14,55 procent) om een ​​hypoxische omgeving op grote hoogte te simuleren. Alle ratten hadden vrije toegang tot voedsel en water in plastic kooien bij 22 ± 2 graden en vochtigheid met een automatische 12- uur licht/donker cyclus. De ratten in de met het model en met Cis behandelde groepen bleven onder hypobare omstandigheden, maar werden elke 96 uur overgebracht naar normobare omstandigheden, waarna voedsel en water aan hen werden verstrekt en de kooien werden schoongemaakt. De duur van de overgang van hypobaar naar hypobaar was ongeveer 2 uur. Alle behandelingsgroepen werden gedurende 8 weken via orale sondevoeding behandeld met het overeenkomstige Cis (8 mg/kg/d), terwijl de controle- en modelratten werden behandeld met een gelijk volume water.

Na 8 weken werden ratten onder verdoving opgeofferd. Testes, epididymis en zaadblaasjes werden gescheiden en gewogen, en de orgaanindex werd berekend volgens de volgende formule: (gewicht van orgaan/diergewicht)

t) × 100 procent . Vervolgens werden sperma in de epididymis verzameld en hun beweeglijkheid en acrosoom-enzymactiviteit getest. Evenzo werden testiculaire weefsels verzameld voor histopathologische onderzoeken en detectie van ROS-, LPO- en antioxidant-enzymactiviteit.

Evaluatie van de snelheid van levend sperma

De epididymis werd ingesneden met een chirurgische schaar en de spermasuspensie werd bereid in normale zoutoplossing. Om de snelheid van levend sperma te evalueren, werd 5 L van de spermasuspensie zorgvuldig gemengd met een gelijk volume eosine-Y-kleuring. Het sperma werd vervolgens geteld onder een lichtmicroscoop. De tarieven van levend sperma werden beoordeeld door zowel gekleurd (dood sperma) als ongekleurd sperma (levend sperma) te berekenen.

Bepaling van de activiteit van het acrosoomenzym in het sperma

De sperma-acrosoom-enzymactiviteitstest werd gebruikt om sperma-acrosoom-enzymen te evalueren [19]. De resultaten in elke groep werden berekend met behulp van de volgende formule: Acrosoom-enzymactiviteit (μIU)=(ODExperimentgroep - ODBlank-groep)/(247,5×10) × 106.

statistische analyse

Alle kwantitatieve gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD en zijn geanalyseerd met SPSS 22.0-software. De t-test van Independent Student werd gebruikt om de gegevens tussen twee groepen te vergelijken. "P<0.05>< 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">

Resultaten

Effecten van hypoxie op GC-1-cellen

Om de effecten van hypoxie op kiemcellen te bepalen, onderzochten we eerst de veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen na hypoxiebehandeling met verschillende zuurstofconcentraties (20 procent, 15 procent, 10 procent ,5 procent) gedurende 1, 3,5 en 7 dagen. , respectievelijk. De resultaten van de CCK-8-assay toonden aan dat, vergeleken met de controlegroep (20 procent zuurstofconcentratie), cellen die waren blootgesteld aan hypoxie een significante afname in levensvatbaarheid vertoonden (P<0.01; figure="" 1a).="" moreover,="" their="" survival="" rate="" was="" inversely="" proportional="" to="" the="" oxygen="" concentration="" and="" further="" decreased="" with="" induction="" time.="" to="" avoid="" an="" excessive="" cytotoxic="" effect,="" a="" 10%="" oxygen="" concentration="" and="" 3-day="" induction="" time="" were="" selected="" as="" the="" hypoxic="" model="" criteria="" for="" subsequent="" in="" vitro="">

Vervolgens werden FCM- en immunofluorescentiekleuring uitgevoerd om de proliferatieverandering van GC-1-cellen onder hypoxiebehandeling verder te evalueren. De resultaten toonden aan dat hypoxie GC-1-celarrestatie in de G1-fase kan induceren, waardoor de celinvoer in de S-fase wordt verminderd en DNA-replicatie wordt geremd. Hypoxie verminderde dus significant de proliferatie-index van GC-1-cellen (P<0.01; figure="" 1b).="" positive="" ki-67="" staining="" is="" another="" specific="" biomarker="" of="" proliferating="" cells.="" therefore,="" we="" also="" examined="" the="" ratio="" of="" ki-67-positive="" cells="" with="" or="" without="" hypoxia="" treatment.="" compared="" with="" the="" control="" group,="" hypoxia="" treatment="" remarkably="" reduced="" ki-67-positive="" cells,="" as="" shown="" in="" figure="">

Vervolgens wilden we de modus van remming van de levensvatbaarheid van GC-1-cellen, geïnduceerd door hypoxie, onderzoeken. Zoals gerapporteerd in de literatuur, nam het niveau van ROS toe naarmate ratten werden blootgesteld aan een hypo-barische hypoxische omgeving [8,20]. Daarom werden endogene ROS-niveaus in GC-1-cellen gemeten met behulp van de FCM-assay. De resultaten toonden hogere ROS-niveaus onder hypoxie in vergelijking met de normale zuurstofgroep (P< 0.01;="" figure="" 1d).="" accumulated="" ros="" cause="" marked="" dna="" impairment,="" which="" in="" turn="" causes="" cell="" apoptosis="" pathway="" activation="" and="" might="" be="" the="" major="" etiological="" factor="" for="" the="" increased="" risk="" of="" male="" infertility="" [21,22].="" next,="" we="" detected="" the="" apoptotic="" activation="" effect="" of="" hypoxia="" on="" gc-1="" cells="" by="" tunelstaining.="" as="" shown="" in="" figure="" 1e,="" treatment="" with="" hypoxia="" resulted="" in="" an="" increase="" in="" tunel="" fluorescence="" compared="" with="" the="" control="" group,="" indicating="" an="" increase="" in="" apoptosis="" in="" the="" model="">

Omdat ROS-geïnduceerde celbeschadiging meestal wordt veroorzaakt door het besturingssysteem, hebben we het besturingssysteem van GC-1-cellen verder getest. Zoals weergegeven in figuur 1F, waren de LPO-niveaus van GC-1-cellen in de modelgroep aanzienlijk

verhoogd vergeleken met de LPO-niveaus van GC-1-cellen in de controlegroep. Deze bevindingen suggereren dat door hypoxie geïnduceerde GC-1-celbeschadiging mogelijk verband houdt met OS, dat wordt veroorzaakt door ROS-accumulatie.

Effecten van Cis op door hypoxie geïnduceerde levensvatbaarheid van GC-1-cellen in vitro.

Om te onderzoeken of Cis de remmende effecten van hypoxie op de levensvatbaarheid van GC{{0}} cellen kan voorkomen, werd een CCK-8-assay uitgevoerd. GC-1-cellen werden behandeld met verschillende subtypes (Cis-A, B, C, H） en concentratiebereiken （0,02 M, 0,2 M, 2 μM） Cis gedurende 72 uur. Vergelijking van de modelgroep met de DMSO-groep toonde aan dat DMSO de levensvatbaarheid van GC -1 niet direct bevorderde (Figuur 2A). De levensvatbaarheid van de cellen werd echter duidelijk hersteld (P< 0.05)="" with="" cis="" treatments.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" cis-a,="" cis-b,="" cis-c,="" and="" cis-h="" all="" showed="" certain="" protective="" effects="" on="" hypoxia-induced="" damage="" to="" gc-1="" cell="" viability,="" and="" cis-b="" showed="" the="" most="" significant="" effect(figure="" 2a).="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.2="" μm="" were="" significantly="" higher="" than="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.02="" μm,="" while="" the="" difference="" between="" 2="" μm="" and="" 0.2="" um="" was="" not="" obvious,="" indicating="" that="" the="" restored="" gc-1="" cell="" viability="" induced="" by="" cis="" demonstrated="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" the="" concentration="" range="" from="" 0.02-0.2="" μm="" （figure="" 2a）.="" therefore,="" according="" to="" the="" experimental="" needs,="" 0.2="" m="" cis="" was="" selected="" as="" the="" optimal="" concentration="" in="" the="" following="" in="" vitro="" experiments.="" to="" further="" confirm="" whether="" germ="" cells="" were="" indeed="" protected="" by="" cis,="" fcm,="" and="" ki-67="" staining="" were="" performed="" to="" assess="" the="" alteration="" of="" the="" proliferation="" of="" gc-1="" cells="" after="" treatment="" with="" cis.="" upon="" cis="" treatment,="" the="" proportion="" of="" gc-1="" cells="" in="" the="" g1="" phase="" was="" reduced.="" in="" contrast,="" more="" cells="" entered="" s-phase,="" suggesting="" that="" cis-treatment="" could="" increase="" the="" germ="" cell="" proliferation=""><0.01; figure="" 2b).="" the="" statistics="" for="" the="" gc-1="" cell="" cycle="" are="" shown="" in="" figure="" 2bb.="" the="" ki-67="" staining="" results="" also="" showed="" that="" cis-a,="" cis-b,="" cis-cand="" cis-h="" treatment="" significantly="" improved="" the="" ki-67-positive="" cell="" ratio="" of="" hypoxia-induced="" gc-1="" cells="" in="" vitro(figure="">

Het mechanisme van Cis beschermt kiemcellen in vitro tegen hypoxie.

Om te onderzoeken of de beschermende effecten van Cis op GC-1-cellen verband hielden met de verwijdering van overmatige ROS, werd de fluorescerende kleurstof DCFH-DA gebruikt om ROS-niveaus in elke groep te detecteren. Zoals getoond in figuren 3A, 3B, veranderde behandeling met DMSO het intracellulaire ROS-gehalte of LPO-niveau niet in vergelijking met de modelgroep. De ROS-niveaus in GC -1-cellen waren echter aanzienlijk verminderd in de met Cis behandelde groepen (Figuur 3A). Bovendien werd ook een afname van LPO waargenomen in GC-1-cellen die werden onderworpen aan Cis (Figuur 3B).

Om het mechanisme waarmee Cis kiemcellen beschermt tegen hypoxische schade verder te onderzoeken, werden TUNEL-kleuring en Western-blot-analyses uitgevoerd om apoptose te evalueren. TUNEL-kleuring (Figuur 3C) toonde significante apoptose in het model en DMSO-groepen. Er werden echter minder apoptotische cellen waargenomen met Cis-behandeling, wat erop wees dat Cis-behandeling de apoptose van GC-1-cellen verminderde. Bovendien werd de expressie van PARP, Caspase-3, Bax en Bcl-2 gemeten om het moleculaire mechanisme te bevestigen. Zoals weergegeven in figuur 3D, werden Caspase-3 en PARP geactiveerd in GC-1-cellen onder hypoxie, en deze activering werd geremd door behandeling met Cis. Bovendien was de verhouding van Bax/Bcl-2 hoger in de modelgroep dan in de controlegroep en verminderde behandeling met Cis de verhouding van Bax/Bcl-2(Figuur 3D). Deze gegevens gaven aan dat Cis een potentieel vermogen had om door hypoxie geïnduceerde schade aan oxidatiemiddelen te verminderen, en dit beschermende effect zou kunnen worden bereikt door ROS-accumulatie te verminderen en Caspase-gerelateerde apoptose-route-activering te remmen.

Het enzymatische mechanisme dat OS remt, omvat vrije radicalenvangers zoals glutathionreductase (GR), glutathionperoxidase (GPx) en superoxide dismutase (SOD) [23]. Het enzymatische mechanisme dat OS remt, speelt een essentiële rol bij het voorkomen vanroestschadein cellen en weefsels [23]. Om het potentiële mechanisme van Cis-remming van door hypoxie geïnduceerd OS in GC-1-cellen verder te valideren, werden de activiteiten van GR, GPx en SOD gemeten. De resultaten onthulden dat GR-, GPx- en SOD-activiteiten allemaal significant (P < 0.01,="" figuur="" 3e)="" afnamen="" onder="" hypoxie="" in="" vergelijking="" met="" de="" controlegroepen,="" en="" cis-behandeling="" herstelde="" hun="" activiteiten="" in="" gc="" aanzienlijk{{6}="" }="" cellen="" blootgesteld="" aan="" hypoxie="">< 0.05,="" figure="" 3e),="" suggesting="" that="" these="" compounds="" could="" activate="" the="" powerful="" endogenous="" antioxidant="">

Klik op de onderstaande link voor informatie over deel 2
https://www.xjcistanche.com/news/part2-cistanoside-of-cistanche-herba-ameliorat-54370494.html