Therapeutisch effect en mechanisme van cistanche-fenylethanolglycosiden op door cyclofosfamide geïnduceerde spermatogenese bij muizen

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Overzicht]

Doel:Onderzoek naar het therapeutisch effect vanCistanche fenylethanoïde glycosidenop muizen met door cyclofosfamide geïnduceerde spermatogenese en om voorlopig het werkingsmechanisme ervan te verduidelijken.Methode:Ethanolextractiemethode om te extraherenCistanche fenylethanoïde glycosiden. Veertig BALB/C-muizen werden willekeurig verdeeld in een controlegroep, een modelgroep, een lage dosisCistanche fenylethanoïde glycosidegroep (50 mg·kg-1), en een groep met een hoge dosis (100 mg·kg-1), met 10 muizen in elke groep. Behalve de controlegroep werden muizen in de andere groepen gedurende 5 opeenvolgende dagen elke dag geïnjecteerd met cyclofosfamide (80 mg·kg-1) om muismodellen voor spermatogenese-stoornissen te bereiden. Na de laatste toediening, muizen in de laaggedoseerde en hooggedoseerde groepen vanCistanche fenylethanoïde glycosidenkregen de overeenkomstige doses via sondevoeding en de muizen in de controlegroep en de modelgroep kregen hetzelfde volume normale zoutoplossing via sondevoeding, eenmaal per dag gedurende 30 dagen. Vierentwintig uur na de laatste sondevoeding werd het testisweefsel van de muis afgenomen. Een enzymgebonden immunosorbenstest werd gebruikt om het niveau van testosteron in homogenaat van muistestisweefsel te bepalen. De spermadichtheid, de beweeglijkheid van het sperma en de mate van afwijking van het sperma van elke groep werden vergeleken. De morfologische veranderingen van testiculaire weefsel werden waargenomen door HE-kleuring. Resultaten: Vergeleken met de controlegroep namen de spermadichtheid en de beweeglijkheid van het sperma van de modelgroep af (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche fenylethanoïde glycosidenwaren aanzienlijk verhoogd (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche fenylethanoïde glycosidegroep aanzienlijk toegenomen, De lagen zijn verschillend, de spermatogene cellen zijn netjes, strak en regelmatig gerangschikt, en sperma kan worden gezien in het lumen.Conclusie: Cistanche fenylethanoïde glycosidenhebben een significant therapeutisch effect op de spermatogenese-stoornis veroorzaakt door cyclofosfamide bij muizen, en het mechanisme ervan kan verband houden met de verbetering van de testosteronniveaus in testisweefsels.

[Trefwoorden]Cistanche fenylethanoïde glycosiden; cyclofosfamide; spermatogenese stoornis; muizen, BALB/C

Klik om de producten van Cistanche te bekijken

Door de versnelling van het sociale ritme, slechte leefgewoonten en milieuvervuiling, en andere factoren, zijn abnormale spermakwaliteit zoals oligospermie en asthenospermie de belangrijkste oorzaak van mannelijke onvruchtbaarheid geworden [1]. Op dit moment zijn er minder medicijnen voor de behandeling van oligospermie en asthenospermie, en het therapeutische effect is niet duidelijk. Voorschriften voor traditionele Chinese geneeskunde of actieve ingrediënten hebben goede effecten bij het verbeteren van de mannelijke voortplantingsfunctie [2-6]. Vanwege de grote verscheidenheid aan geneesmiddelen op recept is de relatie tussen de farmacologische effecten en de effectieve ingrediënten van het medicijn echter niet duidelijk, wat de promotie en toepassing van spermatogene geneesmiddelen beperkt. Het onderzoek en de ontwikkeling van de effectieve ingrediënten van de Chinese geneeskunde en de studie van de therapeutische effecten ervan bij reproductieve schade hebben een goede toepassingswaarde.Cistanche fenylethanoïde glycosidenzijn een van de belangrijkste actieve ingrediënten inCistanche deserticola. Het zijn meestal natuurlijke glycosiden die esterbindingen en oxo-glycosidische bindingen bevatten met -glucose als de kern. Ze worden veel aangetroffen in tweezaadlobbige planten [7]. Studies [8] hebben aangetoond datCistanchefenylethanoïdeglycosidenkan rattensperma in vitro beschermen tegen oxidatieve schade, maar er zijn geen rapporten over de spermatogenese. Dit experiment bestudeert het therapeutische effect van Cistanche-fenylethanoïde-glycosiden op de spermatogene functie van muizen met door cyclofosfamide geïnduceerde spermatogenese en biedt een experimentele en theoretische basis voor de toepassing vanCistanche fenylethanoïde glycosidenbij de behandeling van spermatogenesestoornissen.

1. Materialen en methoden

1.1. Proefdieren, hoofdreagentia en instrumenten

40 volwassen BALB/C-muizen van SPF-klasse, 6-8 weken oud, met een lichaamsgewicht van 20-22g, werden gekocht bij het Animal Experimental Center van Jilin University School of Basic Medicine, en het diercertificaatnummer : SCXK (Kirgizië) 2008-005. De muizen werden 5 dagen vóór het experiment adaptief gefokt. Voedingsomstandigheden: 22 graden ~ 25 graden, circadiaans ritme (12u/12u), gratis drinkwater en voedsel. Cistanche is een product van Xinjiang Dakang Trading Company. Cyclofosfamide voor injectie werd gekocht bij Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (partijnummer 11061921). Testiculaire weefselhomogenaat testosteron-enzymgekoppelde immunoassay-kit werd gekocht bij Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (batchnummer) 20120812), andere reagentia zijn allemaal in eigen land geproduceerde analytische kwaliteiten. PLUS384 microplaatlezer (MDC in de Verenigde Staten), TE2000U omgekeerde microscoop (Nikon, Japan) en J-26XP-centrifuge (Nanodrop, Verenigde Staten).

1.2 Bereiding van cistanche fenylethanolglucoside

10 g cistanchepoeder werd geëxtraheerd door koken onder terugvloeikoeling met 70% ethanol, tweemaal, telkens 2 uur, om het fenethylalcoholglycosideconcentraat te verkrijgen. De geconcentreerde oplossing werd gechromatografeerd op de D101 macroporeuze harskolom en geëlueerd met 70% ethanol om Cistanche phenecoside alcohol te verkrijgen. De UV-spectrofotometer identificeerde het extract bij een golflengte van 333 nm.

1.3 Bereiding van diermodel en toedieningsmethode voor geneesmiddelen

Nadat 40 mannelijke BALB/C-muizen gedurende 5 dagen adaptief waren gevoerd, werden de muizen willekeurig verdeeld in 4 groepen (10 muizen in elke groep): controlegroep, modelgroep, CistancheCistanche fenylethanoïde glycosidengroep met een lage dosis, enCistanche fenylethanoïde glycosidenhooggedoseerde groep. Behalve de controlegroep kregen de andere drie groepen muizen een intraperitoneale injectie van cyclofosfamide 80 mg·kg-1 voor elke muis gedurende 5 opeenvolgende dagen om diermodellen van spermatogenese-stoornissen voor te bereiden. Nadat het model was voorbereid, werden muizen in de lage en hoge dosis groepen vanCistanchefenylethanoïde kregen respectievelijk 50 en 100 mg·kg-1·d-1. De muizen in de controlegroep en de modelgroep kregen gelijke volumes normale zoutoplossing. Een keer per dag gedurende 30 dagen. Alle muizen werden 24 uur na de laatste geneesmiddeltoediening opgeofferd en er werden bilaterale tests uitgevoerd. De rechter testis werd gefixeerd met formaldehyde. De epididymis en testis werden van de linkerkant genomen. De testis werd gehomogeniseerd en gedurende 10 minuten bij 3,000 minuten gecentrifugeerd. Het supernatant werd genomen en opgeslagen in een koelbox op -20 graden voor testen. De linker epididymis werd getest op spermadichtheid, spermamotiliteit en misvormingspercentage.

1.4 Bepaling van de spermadichtheid, de beweeglijkheid van het sperma en de mate van misvorming

Plaats een reageerbuis met 10 ml sperma-voedingsoplossing [9] in een waterbad met constante temperatuur om het voor te verwarmen tot 37 graden, neem een ​​eenzijdige epididymis om bindweefsel en vet te verwijderen, snijd het weefsel af en doe het in een reageerbuis op 37 graden gedurende 10 minuten Nadat het sperma volledig vrij is, neemt u 1 druppel op de bloedceltelplaat en berekent u de spermadichtheid volgens de celtelmethode. Het resultaat wordt uitgedrukt als het aantal zaadcellen per milliliter; neem daarnaast 5 L spermasuspensie en dezelfde hoeveelheid eosine-Y uit de reageerbuis. Goed mengen, gedurende 10 minuten op kamertemperatuur plaatsen, een dekglaasje toevoegen en observeren met een lichtmicroscoop. Dood sperma wordt roze gekleurd, levend sperma wordt niet gekleurd en het cytoplasma is transparant. Elk monster telt 200 zaadcellen, berekent de levensvatbaarheid van het sperma, het resultaat wordt uitgedrukt als een percentage, de levensvatbaarheid van het sperma=een aantal levend sperma / het totale aantal sperma × 100 procent. Nog eens 5 L spermasuspensie werd gedurende 5 minuten in methanol gefixeerd, gedroogd en gekleurd met een waterige oplossing van 2 procent eosine gedurende 1 uur, gespoeld en geföhnd. Zoek naar onderdelen met minder overlapping van sperma onder een lens met een laag vermogen en gebruik een lens met een hoog vermogen om de morfologie van het sperma op volgorde te controleren. Elke muis inspecteerde 1,000 compleet sperma. De zaadkoppen zonder haken, banaanvormige, amorfe, dikke koppen en dubbele koppen werden als misvormingen beoordeeld. De mate van misvorming van het sperma werd berekend en de resultaten werden uitgedrukt als een percentage. Vervormingspercentage van het sperma=een aantal misvormde zaadcellen / totaal aantal zaadcellen × 100 procent.

1.5 Bepaling van reproductieve hormonen

De testis werd van het membraan gepeld en in een flesje geplaatst, en het voorgekoelde homogenisatiemedium (0.01mol·L-1 sucrose, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1 mmol·L-1 EDTA-Na2-oplossing, pH 7,4), knip het testisweefsel af met een oogheelkundige schaar, giet het in een glazen homogenisatiebuis en centrifugeer bij 4, 000×g gedurende 10 minuten bij lage temperatuur en neem het supernatant. Gebruik een enzymgekoppelde immunosorbent-assaykit om het testosteronniveau in het testisweefselhomogenaat te meten en test 3 parallelle monsters voor elk monster. De experimentele stappen en methoden werden voltooid in overeenstemming met de instructies van de kit.

1.6 Morfologische observatie van testis

Neem paraffinesecties van muistestis, gekleurd met HE, en observeer de verdeling van spermatogonia en spermatogene cellen in testisweefsel onder een lichtmicroscoop.

1.7 Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS17.0 statistische software. De spermadichtheid, de beweeglijkheid van het sperma, de misvorming van het sperma en het testiculaire testosteronniveau van muizen in elke groep werden uitgedrukt als x ± s, en de vergelijking tussen groepen werd uitgevoerd door variantieanalyse met één factor.

2. resultaten

2.1. Spermadichtheid, spermamotiliteit en spermavervormingssnelheid van elke groep muizen

In vergelijking met de controlegroep namen de spermadichtheid en de levensvatbaarheid van het sperma van de modelgroep af (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche fenoxyethanol glycosideverhoogd (P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Testosteronniveaus in testisweefsels van muizen in elke groep

De testosteronniveaus in de testisweefselhomogenaten van de controlegroep en de modelgroep waren (10.26±0.57) en (5.33±0.84) nmol·L-1, respectievelijk. De testosteronspiegel van de modelgroep was significant lager dan die van de controlegroep (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistanchecistanche fenethylglycoside hooggedoseerde groep was significant hoger dan die van de laaggedoseerde groep (P<>

2.3 Morfologie van muistestis in elke groep

Waargenomen met een lichtmicroscoop, waren de tubuli seminiferi in de testikels van de normale groep dicht gerangschikt, het niveau en het aantal kiemcellen was groot, het seminiferous-epitheel was netjes gerangschikt en de tubuli seminiferi werden allemaal gezien met spermavorming. In de modelgroep waren de tubuli seminiferi in de testikels van muizen geatrofieerd en gedegenereerd, het seminiferous epitheel was significant dunner, het aantal epitheliale lagen was verminderd, de opstelling was ongeordend en het aantal sperma in de holte was verminderd. Vergeleken met de modelgroep is de lage dosisCistanche fenethylalcohol glycoside.

In de groep nam het aantal seminifereuze epitheellagen van tubuli seminiferi toe, was de rangschikking van het epitheel regelmatiger en was de beschadiging van tubuli seminiferi duidelijk verbeterd; de structuur van tubuli seminiferi in de hoge dosisCistanche fenylethanoïde glycosidegroep verbeterde significanter, en het aantal en het aantal seminiferous epitheellagen nam significant toe. Netjes gerangschikt, er zijn volwassen sperma in de tubuli seminiferi en de structuur is in principe weer normaal. Zie afbeelding 1 (inzet 6).

3 Discussie

Cyclofosfamide is een veelgebruikt antitumorgeneesmiddel en immunosuppressivum, dat voornamelijk interfereert met een verscheidenheid aan intracellulaire biologische functies door de alkylering van DNA. Reproductietoxiciteit is een van de belangrijkste bijwerkingen van cyclofosfamide [3], dat gemakkelijk kan leiden tot DNA-beschadiging van sperma en abnormale ontwikkeling van sperma. Klinische studies [10-11] geven aan dat de reproductietoxiciteit van cyclofosfamide azoöspermie of oligospermie kan veroorzaken. , Wat leidt tot onvruchtbaarheid of het optreden van genetische defecten of misvormingen bij het nageslacht.

Cistanche tubulosais een meerjarige parasitaire plant uit de Leidse familie. Het is een bekend Chinees medicijn dat de nieren en yang voedt, het bloed voedt en de darmen voedt. Het is een veelgebruikt receptgeneesmiddel voor de traditionele behandeling van mannelijke reproductieve disfunctie [12].Fenylethanoide glycosidenzijn een van de belangrijkste actieve componenten vanCistanche[13] en hebben een breed scala aan farmacologische effecten, zoals anti-oxidatie, anti-veroudering en anti-tumor [14].

In deze studie werd cyclofosfamide gebruikt om een ​​muismodel van spermatogenesestoornis voor te bereiden, en het therapeutische effect van Cistanche-fenylethanoïdeglycosiden op spermatogenesestoornis veroorzaakt door cyclofosfamide werd bestudeerd. De resultaten toonden aan dat in vergelijking met de normale groep de spermadichtheid van de modelgroep afnam, het overlevingspercentage afnam en het misvormingspercentage toenam. In vergelijking met de modelgroep kunnen alle dosisgroepen van Cistanche-fenoxyethanolglycosiden de spermadichtheid effectief verhogen, de beweeglijkheid van het sperma verbeteren en de misvorming van het sperma verminderen. De bovenstaande resultaten geven aan dat de cistanche fenoxyethanolglycosiden de spermatogenese kunnen bevorderen en de beschadigde testis kunnen beschermen. De resultaten van de testismorfologie toonden aan dat na behandeling metCistanche fenylethanoïde glycoside, het aantal seminiferous epitheel in de testis van de modelmuizen was significant verhoogd, de lagen waren verschillend, de spermatogene cellen waren netjes, strak en regelmatig gerangschikt, en sperma kan worden gezien in het lumen, wat suggereert datCistanche fenylethanoïdekan veranderen Shanhe herstelt de structuur en morfologie van seminiferous epitheel na reproductieve schade.

Testosteron reguleert de differentiatie van mannelijke geslachtscellen en is een noodzakelijke voorwaarde voor de normale ontwikkeling van de testis en het normaal optreden van sperma. Sommige studies [15] meldden dat de selectieve knock-out van androgeenreceptoren in Sertoli-cellen van de testis stoornissen in de spermaontwikkeling en mannelijke steriliteit veroorzaakte. In deze studie werd cyclofosfamide gebruikt om spermatogeen te produceren.

Na het obstakelletselmodel was de testosteronspiegel in het testisweefsel van de muizen significant lager dan in de normale groep. Na de werking van Cistanche-fenylethanoïde-glycosiden namen de testosteronspiegels in elke dosisgroep toe en was de testosteronspiegel in de hooggedoseerde groep significant hoger dan die in de laaggedoseerde groep. Er wordt gesuggereerd dat de cistanche-fenoxyethanol-glycosiden de spermatogenese kunnen bevorderen door het niveau van testosteron in het testisweefsel te verhogen om spermatogene disfunctie te behandelen, maar het mechanisme van het effect ervan op testosteron moet verder worden onderzocht en besproken.

Testosteron reguleert de differentiatie van mannelijke geslachtscellen en is een noodzakelijke voorwaarde voor de normale ontwikkeling van de testis en het normaal optreden van sperma. Sommige studies [15] meldden dat de selectieve knock-out van androgeenreceptoren in Sertoli-cellen van de testis stoornissen in de spermaontwikkeling en mannelijke steriliteit veroorzaakte. In deze studie werd cyclofosfamide gebruikt om spermatogeen te produceren.

Na het obstakelletselmodel was de testosteronspiegel in het testisweefsel van de muizen significant lager dan in de normale groep. Na de actie vanCistanche fenylethanoïde glycosiden, namen de testosteronniveaus in elke dosisgroep toe en was het testosteronniveau in de hooggedoseerde groep significant hoger dan dat in de laaggedoseerde groep. Er wordt gesuggereerd dat de cistanche-fenoxyethanol-glycosiden de spermatogenese kunnen bevorderen door het niveau van testosteron in het testisweefsel te verhogen om spermatogene disfunctie te behandelen, maar het mechanisme van het effect ervan op testosteron moet verder worden onderzocht en besproken.

[referenties]

[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. Nieuwe vooruitgang in onderzoek naar mannelijke onvruchtbaarheid [J]. Chinees tijdschrift voor andrologie, 2006, 12(9): 771-774.

[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming, et al. Effect van Guilingji-capsule op modelratten met oligospermie. De rol van spermaproductie en de impact op geslachtshormonen [J]. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2011, 28(6): 621-623.

[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, et al. Epimedium totale flavonoïden zorgen voor minimalisering van cyclofosfamide Onderzoek naar de beschermende werking van bij ratten geboren spermabarrière [J]. Chinese octrooigeneeskunde, 2010, 32 (12): 2052-2055.

[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing, et al. Shengjing-korrels op cyclofosfamide-geïnduceerde spermastoornissen Belemmer het therapeutisch effect van muizen [J]. Journal of Zhengzhou University: Medical Science Edition, 2008, 43(2): 267-270.

[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing, et al. Effect van Shengjing-korrels van Chinese geneeskunde op muizen met verminderde spermatogenese Experimenteel onderzoek naar therapeutische effecten [J]. Chinees tijdschrift voor andrologie, 2008, 14 (11): 1046-1049.

[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun, et al. Effect van Heshouwu-afkooksel op testisweefsel van ouder wordende ratten De invloed van de Rb/p53-signaaltransductieroute van cellen [J]. Anatomy Journal, 2010, 41(3): 435-439.

[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Effect van refluxextractie van cistanche fenylethanolglucoside met ethanolfactoronderzoek [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2009 (1): 250-251.

[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei, et al. Effecten van Cistanche Phenylethanol Glucoside op rattensperma Onderzoek naar het beschermende effect van externe oxidatieve schade [J]. Lishizhen Traditionele Chinese Geneeskunde en Materia Medica, 2010, 21 (9): 2205-2207.

[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong, enz. Anti-semen-antilichamen op de mitochondriale functie van sperma De impact van [J]. Dagboek van Shantou University Medical College, 2008, 21(1): 4-6.

[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD, et. Hoog risico op info Highdoseccyclophamiddeforsarcomeduringkindertijd [J].Cancer, 2001, 91(3): 613-621.

[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, et. Testiculaire functie en vruchtbare conservering bij kankerpartijen [J]. BestPrect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.

[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. Het vermogen van Cistanche om vermoeidheid door inspanning bij ratten te weerstaan ​​En de invloed van vrije radicalen in de hersenen [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9592-9595.

[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian, et al. Fenylethanolglycosiden in gecultiveerde Cistanche-cistanche Extractie- en zuiveringsonderzoek [D]. Wuxi: Jiangnan Universiteit, 2006, 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. Vooruitgang in farmacologisch onderzoek van fenoxyethanolglycosiden Tentoonstelling [J]. Lishizhen Medicine en Materia Medica, 2006, 17 (3): 440-441.

[15] ChangC, ChenYT, YehSD, et. Infomedia lente Theandrogeenreceptorin Sertolicellen [J]. ProcNatlAcadSci VS, 2004, 101 (18): 6876-6881.