Deel 2: Functionalisatie op maat van natuurlijke fenolen om biologische activiteit te verbeteren

Neem voor meer informatie contact op mettina.xiang@wecistanche.com

3. Difenolen

natuurlijkdifenolen, waaronder catechol, resorcinol en hydrochinonderivaten, zijn wijdverbreid in de natuur en worden vaak aangetroffen in verschillende groenten en fruit. Dergelijke natuurlijke verbindingen worden meestal gekenmerkt door eigenaardige antioxidanten enontstekingsremmendwerkzaamheid. Sommigen van hen hebben immunomodulerende en antikanker actieve ingrediënten. Daarom worden natuurlijke difenolen vaak gebruikt als steigers om nieuwe efficiënte biologisch actieve geneesmiddelen te bereiden. Hoewel er in de natuur een wijdverbreide aanwezigheid van bioactieve difenolen is,

Vanuit dit oogpunt wordt de aandacht besteed aan de op maat gemaakte functionalisering van resveratrol, hispolon en hydroxytyrosol, die overvloedige en zeer actieve natuurlijke fenolverbindingen vormen.

Klik hier voor meer informatie over producten

3.1.Resveratrol

Resveratrol (5-[(E)-2-(4-hydroxyfenyl)ethenyl]benzeen-1,3-diol) is een natuurlijk fenolisch stilbeen, dat vaak wordt aangetroffen in verschillende planten en fruit zoals appels, bessen, granaatappels, pistachenoten, maar ook in het zaad en de schil van druiven. Rode wijn is dus een van de belangrijkste bronnen van resveratrol [214]. Er lopen momenteel verschillende onderzoeken naar resveratrol en zijn antibacteriële [215],antiviraal[216] en antitumorale [217-219]-activiteiten. Bovendien zijn de toepassingen ervan bij de behandeling van diabetische nefropathie [220] en huidaandoeningen [221] beoordeeld. De voordelen die verband houden met resveratrol, samen met enkele nadelige effecten, voornamelijk gerelateerd aan de potentiële cytotoxiciteit, zijn onlangs benadrukt [222]. Bovendien leidt het snelle metabolisme van resveratrol tot een lage biologische beschikbaarheid van de werkzame stof. Dergelijke problemen, samen met de lage oplosbaarheid in water, vormen een belangrijke beperking waarmee rekening moet worden gehouden. Om de biologische beschikbaarheid te verbeteren, zijn daarom verschillende resveratrol-afgiftesystemen voorgesteld om de potentiële biomedische toepassingen van een dergelijk interessant natuurlijk product uit te breiden [223].

Vanwege de grote aandacht voor deze actieve stof zijn onlangs verschillende artikelen over de functionalisering ervan gepubliceerd; bovendien werden in 2017 verschillende recensies gepubliceerd over de farmacologische en biologische activiteit van resveratrol-analogen en een speciale uitgave over de functionalisering ervan [224].

Om maar enkele voorbeelden te noemen (Figuur 5), natuurlijke en synthetische resveratrolderivaten en oligomeren zijn effectieve antibacteriële [225] en antivirale [226] middelen; di-, tetra- en hexahydroxyderivaten, evenals di-, tri-, tetra- en pentamethoxy-analogen vertoonden een hogere biologische beschikbaarheid en biologische activiteit met betrekking tot resveratrol[219,225-227]; modificatie van resveratrol met carboxyester-, acetaal-, sulfonaat-, fosfaat-, carbonaat-, carbamaat- en alkylgroepen maakte de modulatie van resveratrolwateroplosbaarheid, biologische beschikbaarheid, absorptie uit het maagdarmkanaal en biologische eigenschappen mogelijk [228-230]. Resveratrolmodificatie op de aromatische ring is ook onderzocht, wat leidt tot lipofiele derivaten, met antioxiderende en neuroprotectieve activiteit [229]. Om de antikankeractiviteit van resveratrol te verbeteren, zijn methoxy, hydroxylderivaten, evenals andere functionele groepen of heterocyclische verestering onderzocht [231.232].

3.2. Hspolon

Zijn polon (6-(3,4-dihydroxyfenyl)-4-hydroxyhexa-3,5-dieen-2-one) is een natuurlijke fenolische verbinding, geëxtraheerd van de medicinale paddenstoel Phellinus linteus. Het wordt gekenmerkt door eigenaardigeantioxidantactiviteit evenals belangrijke farmacologische eigenschappen, omdat het een veelbelovend antikanker-, antidiabetisch, antiviraal en ontstekingsremmend middel is [233-235]. Onlangs zijn verschillende hispolonderivaten onderworpen aan in silico-voorspellingen om hun antikankeractiviteit voorlopig te evalueren. De theoretische analyse bevestigde dat aromatische ringsubstitutie met methoxy- en hydroxygroepen nieuwe his polon-analogen oplevert met een goede antiproliferatieve activiteit, soms zelfs hoger dan die van zijn polo zelf [236.237]. In feite vertoonden de hispolonderivaten dehydroxyhispolon-methylether en hispolon-methylether een hogere in vitro cytotoxiciteit dan hispolon tegen colorectale kanker [238.239]. De laatste was tot 5 keer effectiever tegen cellijnen van colon- en prostaatkanker [239]. Dehydrohispolon is een veelbelovend middel tegen tuberculose dat een lagere MIC tegen M.tuberculosis vertoont ten opzichte van zijn polon [240]. Hispolon en hispolon-methyletherpyrazoolderivaten (Schema 20) vertoonden verbeterde stabiliteit met betrekking tot hun voorlopers, evenals antigenotoxische effecten tegen blootstelling aan straling [241].

Het pyrazoolderivaat is ook effectiever dan hispolon voor het wegvangen van N· en CClO,·radicalen [242]. Onlangs is een familie van palladium(II)-complexen met hispolon-analogen gesynthetiseerd en deze vertoonden een hogere in vitro cytotoxiciteit dan de overeenkomstige vrije liganden tegen verschillende kankercellijnen. In het bijzonder vertoonden Pd-complexen met methoxy-gesubstitueerde hispolon-analogen (Schema 21) verbeterde activiteit in vergelijking met de overeenkomstige hydroxyverbindingen [243].

3.3. HydroxcytyroOsol

Hydroxytyrosol (2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethanol) is een secundaire plantmetaboliet en is aanwezig in veel olijfproducten en is verantwoordelijk voor de meeste van hun voordelen voor de menselijke gezondheid. De veelbelovende farmacologische activiteiten van hydroxytyrosol (als cardioprotectief, antikanker-, neuroprotectief en antimicrobieel middel) zijn onlangs beoordeeld [79.244]. Op analoge wijze wordt hydroxytyrosolacetaat (2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethylacetaat), een fenolbestanddeel van olijfolie, gekenmerkt door bijzondere biologische activiteiten [245-248]. De afgelopen decennia zijn verschillende hydroxytyrosolderivaten onderzocht om hun biologische toepassingen uit te breiden [249-252]. De meest gebruikelijke functionaliseringsstrategieën omvatten echter verestering of verethering aan de alcoholische-OH-groep of een substitutie op de aromatische ring [253].

Om bijvoorbeeld het gebruik in voedingsmiddelen en cosmetica te verbreden,antioxidantlipofiele hydroxytyrosol-esters zijn gesynthetiseerd door verestering aan de alcohol-OH, met verschillende vetzuren [254-257], of door de chemoselectieve omesteringsprocedure [258]. Interessant is dat decanoaat en dodecaan hydroxytyrosolesters resulteerden in goede anti-trypanosomale en anti-leishmanial middelen, actief tegen respectievelijk T. brucei en L. donovani [259]. De antioxidantactiviteit van hydroxytyrosol werd versterkt na verestering tot de overeenkomstige butyraat [260], fenofibraat [261] en nicotinaat [262] esters (respectievelijk HT-1 en HT-2, Schema 22), waarbij de laatste ook een krachtige -glucosidaseremmer.

Evenzo vertoonde een polyacrylaatpolymeer met hydroxytyrosol in zijn zijketen antioxiderende en antimicrobiële activiteit tegen Staphylococcus epidermidis [263]. Bovendien zijn hydroxytyrosolfosfodiesters (schema 23) veelbelovende antioxidanten, geschikt voor de preventie of therapie vanziekte van Alzheimer [264].

Evenzo worden hydroxytyrosolalkylethers gekenmerkt door interessante biomedische eigenschappen. In feite vertoonde hydroxytyrosol-hexylether anti-angiogene [265] en anti-bloedplaatjes [266] effecten, terwijl de ethylether intestinale anti-carcinogene activiteit [267] vertoonde, evenals hoge antioxiderende eigenschappen wanneer toegevoegd aan commerciële olijfolie [268] ]. Bovendien is recentelijk de farmacologische potentiële activiteit van hydroxytyrosolglycosiden onderzocht; daarom zijn neuroprotectieve hydroxytyrosolglycosiden gesynthetiseerd door een duurzame enzymatische reactie, met behulp van een schimmel-xylosidase als katalysator om de regioselectieve trans-xylosyleringsreactie met xylobiose uit te voeren [269].

Nitrohydroxytyrosol, gesynthetiseerd door de reactie van hydroxytyrosol met natriumnitriet in acetaatbuffer (pH 3,8), en nitrohydroxytyrosylesterderivaten (namelijk acetaat, butyraat, hexanoaat, octanoaat, decanoaat, lauraat, myristaat en palmitaat) zijn met succes verkregen in goede opbrengsten [270]. NO,-hydroxytyrosol vertoonde een verbeterde antioxidantactiviteit met betrekking tot de moederverbinding, terwijl de activiteit van de esterderivaten sterk afhankelijk was van de acylketenlengte, maar goede effecten werden gedetecteerd met acetaat en butyraat. Evenzo bleef de antioxidantactiviteit van alkylnitrohydroxytyrosylethers behouden of zelfs verbeterd voor ethyl- en butylethers, terwijl deze met langere zijketens werd verminderd met betrekking tot hydroxytyrosol [271].

De synthese van alkylcarbonaatderivaten van hydroxytyrosol is strategisch om de antioxidantactiviteit van hydroxytyrosol te verhogen [272]. Carbonaatderivaten zijn bereikt door een meerstapsproces waarbij het chloorformiaathydroxytyrosolderivaat (met beschermde fenolische groepen) werd gereageerd met alkylalcoholen of diolen met verschillende ketenlengten [272.273] (Schema24). Hydroxytyrosolcarbonaten vertoonden ook een hogere anti-trypanosoomactiviteit tegen Trypanosoma Brunei met betrekking tot de voorloper [273].

4. Fenolzuren

Fenolzuren zijn hydroxy- of methoxyderivaten van benzoëzuur of van kaneelzuur (3-fenylpropanoïdezuur). Ze zijn verspreid in veel planten (ze behoren bijvoorbeeld tot de meest voorkomende natuurlijke antioxidanten van olijfolie van eerste persing [274]). De meer voorkomende fenolzuren zijn samengevat in figuur 6.

Het voorkomen, biologische en farmacologische functies van monocyclische fenolzuren werden beoordeeld, wat hun brede verspreiding en verscheidenheid aan functies aantoont [275-277]samen met hun veelbelovende therapeutische toepassingen [278-282]. Als voorbeeld werd onlangs de ontwikkeling van galluszuurderivaten als farmacologische middelen [283.284] besproken. Evenzo werden kenmerken en mogelijke toepassing van ferulazuurderivaten[285-289] en natuurlijke en synthetische producten afgeleid van cafeïnezuur [290] beoordeeld.

Daarom worden de aantrekkelijke eigenschappen van fenolzuurderivaten ondubbelzinnig bevestigd. Niettemin worden in het volgende de meest interessante derivaten van natuurlijke fenolzuren besproken.

4.1. Cafeïnezuur

Cafeïnezuur (3,4-dihydroxybenzoëzuur) is te vinden in koffie, wijn en thee. Het wordt gekenmerkt door een antioxiderende, ontstekingsremmende en anticarcinogene activiteit. Esters van fenolzuren zijn van aanzienlijk belang geweest en de meest interessante biologische eigenschappen en synthetische methoden van cafeïnezuurfenethylester en derivaten zijn beoordeeld [291]. Cafeïnezuurfenethylesters behoren inderdaad tot de kleine moleculen met ontstekingsremmende activiteit voor de behandeling van acuut longletsel [292]. Niet-natuurlijke biosynthetische routes werden op maat gemaakt door cafeïnezuur op te nemen in verschillende aromatische alcoholen of amines. Het nieuwe platform maakte de bacteriële productie mogelijk van een bibliotheek van van cafeïnezuur afgeleide fenethylesters of amiden in Escherichia coli [293] (Schema 25).

Er is gebruik gemaakt van enzymatische verestering van cafeïnezuur met fenethylalcohol in aanwezigheid van Novozym 435 in isooctaan bij 70 graden [294]. Het enzym behield meer dan 90 procent van zijn oorspronkelijke activiteit tot de derde run. Het is de moeite waard om te signaleren dat de enzymatische synthese van cafeïnezuurfenethylester met succes ultrageluid werd versneld [295]. Evenzo werd de transverestering van methylcaffeaat tot cafeïnezuurfenethylester-analogen uitgevoerd met Candida Antarctica lipase B, met behulp van de ionische vloeistof 1-butyl-3-methylimidazolium bis(trifluormethylsulfonyl)imide als het oplosmiddel [296]. 2-Cyclohexylethylcaffeaat en 3-cydlohexylpropylcaffeaat vertoonden sterke antiproliferatieve activiteiten. Alkylesters van cafeïnezuur met 2-8 C-atomen werden verkregen uit cafeïnezuur en de juiste alcohol in aanwezigheid van DCC [297]. Een screening op hun antischimmelactiviteit werd uitgevoerd tegen Candida albicans, waarbij propylcaffeaat de beste antischimmelwerking vertoonde. Andere alkylesters van cafeïnezuur (alkyl =methyl, ethyl, butyl, octyl, benzyl en fenethyl) werden bereid om cafeïnezuur te refluxen met alkanol in acetylchloride [298]. In vitro en in vivo experimenten bevestigden de ontstekingsremmende werking van de esters.

Eenentwintig cafeïnezuurfenethylesterderivaten werden gesynthetiseerd, gekarakteriseerd en onderzocht op hun cytoprotectieve effecten [299]. Sommigen van hen vertoonden sterkere cytoprotectieve activiteiten dan de oorspronkelijke fenethylester, dus de auteurs suggereerden een potentieel als functionele voedselingrediënten voor de preventie van neurodegeneratieve ziekten.

Cafeïnezuur en zijn fenylpropylester werden onderzocht op hun vermogen om de proliferatie van menselijke colorectale kankercellen te onderdrukken, zowel in vitro als in vivo [300], wat resulteert in krachtige antikankermiddelen.

Twintig esterderivaten van cafeïnezuur werden gesynthetiseerd om de remmende activiteiten te onderzoeken tegen de stikstofoxideproductie die wordt geïnduceerd door lipopolysacchariden [301]. Ze vertoonden allemaal remmende activiteit.

Halfsynthetische esterderivaten van cafeïnezuur met een triazoolgroep zijn ontworpen als potentiële 5-lipoxygenaseremmers [302].5-Lipoxygenase is betrokken bij de biosynthese van leukotriënen, de bekende ontstekingsmediatoren met implicaties bij verschillende ziekten (astma, allergische rhinitis, hart- en vaatziekten en bepaalde soorten kanker). Structuurgeleid geneesmiddelontwerp leverde verbindingen met uitstekende 5-lipoxygenaseremming, vooral verbindingen die in Schema 26 worden vermeld en die een verhoogde activiteit vertoonden in vergelijking met cafeïnezuur.

Amiden zijn gekozen als bioactieve derivaten van cafeïnezuur: verschillende alkyl- en arylaminen werden gebruikt om antioxidante cafeïnezuurderivaten te bereiden [303]. Aniliden van cafeïnezuren bleken efficiënt te zijn als lipideperoxidatieremmers.

Omdat werd gevonden dat sommige van planten afgeleide polyfenolen antivirale effecten hebben tegen het influenzavirus, waardoor het virale oppervlakte-eiwit neuraminidase wordt geremd, werd een bibliotheek van op cafeïnezuur gebaseerde verbindingen opgebouwd, die op verschillende manieren gesubstitueerde amiden [304] vormden. De amiden vertoonden een matige activiteit op neuraminidases en de verbinding die wordt getoond in figuur 7 is de meest veelbelovende.

Amiden werden bereid uit cafeïnezuur en het heteroaromatische amine-tacrine met alkylafstandhouders van verschillende lengtes (Schema 27) [305]. Alle tacrinederivaten hebben veel meer antioxidantefficiëntie dan cafeïnezuur. Met name de verbinding met a3-klinker en een Cl-atoom in de aromatische ring was de meest selectieve, omdat deze een krachtig neuroprotectief effect had en de amyloïde-aggregatie remde. Deze eigenschappen maken het amide een goede kandidaat voor de ontwikkeling van heilzame therapeutische hulpmiddelen bij de behandeling van de ziekte van Alzheimer.

Een aantal acylhydraziden van cafeïnezuur werden bereid en onderzocht op ontstekingsremmende, analgetische en ulcerogene activiteiten [306]. Cafeïnezuur werd tert-gebutyleerd op positie 5 van de aromatische ring 307]. Zowel cafeïne- als t-gebutyleerde cafeïnezuren vertoonden een sterke antioxidantcapaciteit tijdens squaleenperoxidatie onder directe UVA-straling, maar alleen de laatste kon de vorming van reactieve zuurstofsoorten verminderen.

4.2.Ferulinezuur

Ferulinezuur (4-hydroxy-3-methoxykaneelzuur) is een effectieve antioxidant die meestal wordt aangetroffen in zaden, bladeren en in celwanden van planten. Verschillende ferulinezuurderivaten zijn recentelijk in verschillende gebieden onderzocht. Lipasen van Candida Antarctica (Novozyme 435), Candida rugosa, Chromobacterium viscosum en Pseudomonas sp. werden gebruikt om omesteringen van vinylferulaat te katalyseren met hydroxylsteroïden en arbutine [308] (schema 28). Arbutineferulaat heeft een 19 procent hogere antiradicale activiteit dan ferulazuur.

Andere enzymatische veresteringsreacties maakten de synthese mogelijk van ethylferulaat uit ferulazuur en ethanol, met behulp van Novozym 435 als biokatalysator, die acht keer opnieuw kon worden gebruikt voordat er significant activiteitsverlies plaatsvond [309]. Door lipase gekatalyseerde bereiding van mono- en diesters van ferulazuur werd gerapporteerd 310]. In feite wordt de benutting van de antioxidantcapaciteit van ferulazuur beperkt door de geringe oplosbaarheid ervan in hydrofobe media zoals vetten en oliën. Een strategie om de therapeutische voordelen te maximaliseren is om het zuur om te zetten in esters [31l] (schema 29). Eenmaal bereid, werden esters geëvalueerd op in vitro antioxidantpotentieel. Bovendien gaf moleculaire koppeling aan dat ferula-esters doeleiwitten remmen bij borstkanker en bij oxidatieve stress.

Alkylesters en amiden van ferulazuur werden bereid en geëvalueerd op hun antikankeractiviteit [312]. Volgens de auteurs vertoonden alle gesynthetiseerde amiden een goede cytotoxische activiteit, een kenmerk dat wordt toegeschreven aan lipofiliciteit. Verschillende amiden van gesubstitueerde ferulinezuren werden ook bereid uit O-acetylferuloylchloride met aminen [313]. De meeste amiden vertoonden een significante bevordering van de insulineafgifte door pancreascellen van ratten.

Een aantal amiden werden bereid uit ferulazuur en andere fenolzuren (Schema 30), met als doel hun antioxidantactiviteit te evalueren [314]. De resultaten van vier verschillende in vitro tests wezen op een zeer hoge antioxidantactiviteit, vooral wanneer er OH- of -OMe-groepen in het amide aanwezig waren.

Verschillende ferulazuuramiden en amiden van het overeenkomstige 3-(4-ethoxy-3-hydroxy)fenylpropanoïdezuur werden gesynthetiseerd en getest op antivirale en insecticide activiteit, tegen het tabaksmozaïekvirus [315]. De meeste van de onderzochte amiden vertoonden niet alleen een goede antivirale activiteit, waardoor de virale infectie bij planten werd geremd, maar ook insectendodende efficiëntie tegen de insectenvectoren, waardoor ze helpen bij het voorkomen van virusverspreiding in de gewassen (Figuur 8).

Amiden van gehydrogeneerd ferulazuur,3-(4-hydroxy-3-ethoxy)fenylpropanoïdezuur, werden gesynthetiseerd (Schema 31)[316]. Sommigen van hen vertoonden een uitstekende bescherming en genezende werking tegen het tabaksmozaïekvirus.

De feruloyl- en fenethylgroepen werden gecombineerd om de ester fenethyl trans-3-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)acrylaat en het amide trans-3-(4-hydroxy{ {5}}methoxyfenyl)-N-fenethylacrylamide [317]. Fenethylester en amiden werden onderzocht op biologische activiteit als antikankermiddelen, en bleken effectiever dan de moederverbinding [318].

Veel andere amiden van ferulazuur werden bereid onder oplosmiddelvrije omstandigheden door MW-geassisteerde condensatiereactie [319]. Eenentwintig amiden vertoonden merkbare in vitro activiteit tegen kanker, negen vertoonden in vitro een activiteit om vrije radicalen weg te vangen die hoger was dan die van ferulazuur.

Hexylcaffeaat en ferulaat, evenals caffeovlhexylamide en ferulovlhexylamide, werden getest in menselijke borstkankercellijnen [320]. Anders dan de oorspronkelijke verbindingen remden de nieuwe verbindingen de celproliferatie en induceerden ze celcyclusveranderingen en celdood.

Zevenentwintig ferulinezuurderivaten, met halogenen-acetanilide als nieuwe oppervlakteherkenningseenheid, werden bereid met als doel verbindingen te verkrijgen die kunnen werken als histondeacetylaseremmers. De laatste klasse van verbindingen was belangrijk voor kankertherapie [321]. Gesynthetiseerde verbindingen die aan de onderkant van Schema 32 worden getoond, vertoonden significante enzymatische remmende activiteiten.

Met name het geranyleerde derivaat van ferulazuur, 3-(4O-geranyloxy-3-methoxyfenyl)-2-propenoaat resulteerde in meer activiteit dan het oorspronkelijke ferulazuur als een remmend middel op afwijkende cryptfoci, waardoor de incidentie van adenocarcinomen in de dikke darm [322].

4.3. Diversen

Methyl-, ethyl-, propyl- en butylesters van sinapinezuur (4-hydroxy-3,5-dimethoxykaneelzuur, een bioactieve natuurlijke verbinding die voorkomt in fruit, groenten en geneeskrachtige planten), pre- door zuurgekatalyseerde verestering van alcoholen, vertoonden bijna dezelfde antioxidantactiviteit, die iets lager is dan die van sinapinezuur [323]. Ze hebben echter het voordeel van een hogere lipofiliciteit, wat waardevol is voor antioxidanten die zijn ontworpen om in vivo als membraanbeschermers te fungeren.

Alkylesters van protocatechuïne- en galluszuren (respectievelijk 3,4-dihydroxybenzoëzuur en 3,4,5-trihydroxybenzoëzuur), bereid door het zuur te laten reageren met verschillende alkanolen in aanwezigheid van DCC, bleken de HIV-1 protease dimerisatie [324], met efficiëntie afhankelijk van de lengte van de alkylketen. In feite werd geen remming waargenomen met alkylketens met minder dan acht koolstofatomen. Protocatechuïnezuur en zijn ethyl- en heptylesters werden onderzocht op fotoprotectieve activiteit [325]. De fotoprotectie en anti-verouderingsactiviteit waren hoger met de esters dan met het moederzuur, waarschijnlijk vanwege hun hogere lipofiliciteit. Helaas nam ook de cytotoxiciteit toe.

Alkylesters van galluszuur werden bereid door de klassieke Fisher-verestering, uit zuur en alcoholen in een zuur medium [326]. Naast antikanker, antivirale en antimicrobiële eigenschappen, zijn ze in staat om de vorming van reactieve zuurstofsoorten op te vangen en te verminderen. Bovendien zijn galluszuuresters potentiële remmers van metastase [327]. De propylester van galluszuur werd omgezet in het acylhydrazide dat, na reactie met het geschikte chalcon, werd omgezet in pyrazoolderivaten van galluszuur [328]. De verbindingen werden gescreend op hun ontstekingsremmende werking, met in sommige gevallen goede resultaten.

Nieuwe syringische hydrazonen van het aldehyde verwant aan syringinezuur (4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoëzuur) en gesubstitueerde hydrazinen (met elektronenzuigende of elektronenaantrekkende groepen)[329] waren efficiënt tegen de oxidatieve stress.