Fenylethanoïde glycosiden van paraboea Martinii beschermen ratten feochromocytoom (PC12) cellen tegen waterstofperoxide-geïnduceerde celbeschadiging
Mar 04, 2022
Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baido
Van oxidatieve stress is bekend dat het een essentiële rol speelt in de pathogenese van verschillende ziekten. Het is gekoppeld aan de etiologie van de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), epilepsie en andere ziekten [1-3]. Op dit moment is er voortdurende vooruitgang geboekt in de studie van de pathogenese van AD, PD en andere ziekten. Vanwege de beperkte kennis van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan AD, PD en andere ziekten, zijn er echter geen effectieve preventieve of curatieve strategieën voor deze ziekten gerealiseerd [4]. H2O2 is een belangrijk onderdeel van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Dienovereenkomstig is H2O2-geïnduceerde PC12-celbeschadiging het meest gebruikte model van oxidatieve stress en wordt het veel gebruikt in experimentele studies van neuroprotectieve effecten [5]. Heme-oxygenase 1 (HO-1) en glutamaat-cysteïne-ligase-katalytische subeenheid (GCLC) zijn belangrijke cellulaire antioxidant-enzymen, en beide genen worden stroomafwaarts gereguleerd van nucleaire factor erythroid 2 (Nrf2), die in opkomst is als een veelbelovend therapeutisch middel. doelwit voor neuroprotectie [6,7]. Fenylethhanoïde glycosiden, afgeleid van de C-6-C-3-eenheid, bevatten veel fenolische hydroxylgroepen en hebben significante antioxiderende en antiverouderingsactiviteiten. In de afgelopen jaren hebben onderzoeken aangetoond dat veel medicinale planten fenylethanoïde glycosiden bevatten die een significante antioxiderende activiteit vertonen. Bijvoorbeeld fenylethanoïde glycosiden afgeleid vanHerba cistanchewaarvan bekend is dat ze beschermende effecten uitoefenen op cognitieve stoornissen bij AD. Die studie onderzocht het bijbehorende beschermende mechanisme met behulp van een AD-senescentie-versnelde gevoelige muis 8 (SAMP8)-model. De resultaten gaven aan dat het vermogen van fenylethanoïde glycosiden om cognitieve tekorten bij SAMP8-muizen te verbeteren, verband zou kunnen houden met de bevordering van synaptische plasticiteit waarbij antioxidantprocessen betrokken zijn [8]. In deze studie werden twee fenylethanoïde glycosiden gescheiden en gezuiverd uit Tectona grandis (teak) houtnoesten; deze verbindingen vertoonden opmerkelijke antioxiderende effecten die werden bepaald met een amperometrische methode [9]. Verder oefenen caffeoylfenylethanoïde-glycosideverbindingen van Lindernia ruellioides in vitro dosisafhankelijke antioxidant- en superoxide-anion-vrije radicalen-opruimingseffecten uit [10]. De werkingsmechanismen van fenylethanoïde glycosiden zijn gerelateerd aan de regulatie van de Nrf2 / ARE-signaalroute, die de synthese van SOD, CAT, GSH-PX en andere antioxidante enzymen beïnvloedt [11]. De familie Gesneriaceae, die 150 geslachten en ongeveer 3700 soorten bevat, komt voornamelijk voor in de tropische en gematigde streken van Oost- en Zuid-Azië, Oceanië, Zuid-Amerika, Afrika, Zuid-Europa en Mexico [12].
Gesneriaceae in China. Er werd gemeld dat ongeveer 100 soorten medische werkzaamheid hebben en de meeste hiervan worden voornamelijk verspreid in de provincies Guangxi en Guizhou [13]. In de afgelopen jaren is het onderzoek naar Gesneriaceae-planten in verschillende delen van de wereld geleidelijk toegenomen en zijn er enkele nieuwe bestanddelen met fysiologische activiteiten gevonden [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt behoort tot Parabola (Gesneriaceae) en is een kruidachtige plant. Op basis van "The Chinese Traditional Medicine Resource Records" werd vastgelegd dat de hele plant als medicijn wordt gebruikt. Bovendien kan het veel farmacologische activiteiten uitoefenen op aandoeningen zoals hematemesis, oedeem, dysenterie, traumatisch letsel en fracturen [15]. Bai bewees dat fenylethanoïde glycosiden een van de belangrijkste chemische bestanddelen zijn van Gesneriaceae-planten [16]. Sommige onderzoekers hebben ook ontdekt dat fenylethanoïde glycosiden significante antioxiderende activiteiten hebben [17]. Li toonde aan dat fenylethanoïde glycosiden vanCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 procent) van acht fenylpropanoïde glycosiden werd gemeten met de HPLC-werkwijze voor het normaliseren van het piekgebied. Als voorbeeld worden de chromatografiekaarten van paraboside B en paraboside II getoond in figuur 1, en hun relatieve gehalte bleek respectievelijk 98,23 procent en 99,20 procent te zijn. De slecht gedifferentieerde rattenbijnierfeochromocytoomcellijn (PC12) werd gekocht bij de Cell Bank van de China Academy of Science (Shanghai, China). Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en paardenserum werden gekocht bij Gibco (Gaithersburg, MD, VS). Foetaal runderserum (FBS) werd gekocht bij Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, VS). H202 werd verkregen van Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). Trizol werd gekocht bij Invitrogen (Carlsbad, CA, VS). PrimeScriptTM RT-reagenskit (Perfect Real Time) werd verkregen van TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, China). Primers voor HO -1, GCLC en GAPDH werden gesynthetiseerd door Sangon Biotech (Shanghai, China). De CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (MTS) werd verkregen van Promega Corp. (Madison, VS). Remmers van HO -1 zinkprotoporfyrine (ZnPP) werden gekocht bij Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, VS). Een Thermo311 CO2-incubator (Thermo, VS), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) en xCELLigence RTCA DPlus Analyzer en E-Plate 16 (ACEA Biosciences, VS) werden ook gebruikt .
Cistanche deserticola
Celkweek en behandeling
PC12-cellen werden gekweekt in DMEM dat 5 procent FBS en 5 procent paardenserum bevat bij 37 graden in een bevochtigde 5 procent CO2-atmosfeer. PC12-cellen werden als volgt in drie groepen verdeeld: een controlegroep, een modelgroep en een behandelingsgroep. Acht fenylpropanoïde glycosiden werden opgelost in DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
Bepaling van H2O2
We bepaalden de juiste concentratie H202 met behulp van real-time cellulaire analyse (RTCA). PC12-cellen werden gezaaid in een CIM-plaat-16 microplaat met een volume van 100 µL en vervolgens gedurende 12 uur bij 37 graden in een atmosfeer van 5 procent CO2 geïncubeerd. De PC12-cellen werden verdeeld in controle- en modelgroepen. Vervolgens werd 10 L H2O2 (50, 100, 200 en 400 μM) aan de modelgroepen toegevoegd en werden de controlegroepen behandeld met 10 μL compleet DMEM, opgezet in drie complexe putjes. De E-Plate 16 werd in de xCELLigence RTCA geplaatst, elke 15 minuten gecontroleerd en de resultaten werden gedurende 32 uur geregistreerd. Het effect van H202 op PC12-cellen werd geanalyseerd met behulp van de xCELLigence RTCA-gegevensanalysesoftware. De waarde van de celindex (CI) werd gebruikt om de optimale H2O2-concentratie en werkingsduur te bepalen.
Samengestelde extractie en isolatie
Fracties werden gescheiden op basis van hun polariteit met behulp van eerder beschreven methoden. Aan de lucht gedroogde, poedervormige P. martini (4 kg) werd achtereenvolgens driemaal geëxtraheerd met een 75 procent waterige ethanoloplossing [20]. De verkregen extracten werden vervolgens geconcentreerd met behulp van een roterende verdamper om ethanol te verwijderen, en ruwe extracten werden verkregen. De monsters werden opgelost in gedeïoniseerd water en vervolgens achtereenvolgens geëxtraheerd met petroleumether, ethylacetaat, n-butanol en water. Het n-butanolextract (400 g) werd gefractioneerd met behulp van een AB-8 macroporeuze harskolom en een ethanol-H2O2-oplossing (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 en 95 procent ). Zes fracties (fracties 1-6) werden uiteindelijk verkregen. Fracties 3 en 4 werden gescheiden met behulp van een MCI-kolom met een stapsgewijze gradiënt van MeOH-H2O2 (10-100 procent). Vervolgens werden de producten geïsoleerd met Sephadex LH-20 met 50 procent MeOH als het eluens. Verbindingen 1 (41,0 mg) en 6 (15,6 mg) werden geïsoleerd uit fractie 3. Verbindingen 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) en 8 (26,0 mg) werden verkregen uit fractie 4 met Sephadex LH-20 chromatografie met 50 procent MeOH als het eluens. De laatste isolaties werden uitgevoerd door semi-prep, reversed-phase HPLC (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) met 50 procent MeOH en UV-detectie bij 280 nm om verbindingen op te leveren 4 (39,0 mg) en 5 (9,0 mg) [20].
Levensvatbaarheidstest van de cel
PC12-cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten met een dichtheid van 2 × 1{{10}}4 cellen/putje bij een eindvolume van 100 µL . PC12-cellen werden gedurende 12 uur bij 37 graden met 5 procent CO2 geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen behandeld met verschillende concentraties ruwe extracten (0,025, 0,05, 0,1, 0,2 en 0,4 mg/ml) en verbindingen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8 bij vijf concentraties (3,125, 6,25, 12,5, 25 en 50 M). Na voorbehandeling gedurende 24 uur werd de levensvatbaarheid van de cellen bepaald door MTS-assays. PC12-cellen werden gedurende 30 minuten voorgeïncubeerd met of zonder de HO-1-remmer zonder ZnPP (15 M), vervolgens 12 uur geïncubeerd met of zonder caleolarioside B, paraboside B en paraboside II (3,125 μM) en ten slotte geïncubeerd met 400 M H2O2 voor nog eens 6 uur. Na behandeling werd het aantal overlevende cellen bepaald met een MTS-assay [6].
Beschermende effecten van ruwe extracten en monomere verbindingen op H2O2-behandelde PC12-cellen
De cellen werden gekweekt in een {{0}}well-plaat met een eindvolume van 100 µL. Seriële verdunningen van ruwe extracten (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 en 0,4 mg/ml) werden aan de behandelde groep toegevoegd. Na 12 uur voorbehandeling werd 400 M H2O2-oplossing (optimale concentratie) toegevoegd aan de behandelde groep en de H2O2-groep van elk putje gedurende 6 uur. MTS-oplossing werd vervolgens aan elk putje toegevoegd en de platen werden 3 uur bij 37°C geïncubeerd. De platen werden 5 minuten bij kamertemperatuur op lage snelheid geoscilleerd totdat alle kristallen volledig waren opgelost. Celbescherming werd bepaald op basis van MTS-testresultaten volgens 2204 X. GONG ET AL. Gedownload van https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 door gast op 27 augustus 2021instructies. De optische dichtheid werd bepaald bij een absorptiegolflengte van 490 nm. We volgden verder de activiteit van verbindingen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8 geïsoleerd uit fracties 3 en 4. Seriële verdunningen van verbindingen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8 (3,125, 6,25, 12,5, 25 en 50 M) werden toegevoegd aan de behandelde groep om hun respectieve beschermende effecten op H2O2-geïnduceerde PC12-cellen te bepalen.
fenylethanoïde glycosiden van Cistanche deserticola: Beschermt neuronen en gaat veroudering tegen
Kwantitatieve realtime PCR (qRT-PCR)
PC12-cellen werden 12 uur na behandeling met 3,125 M caleolarioside B, paraboside B en paraboside II geoogst. Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagens en hoeveelheden van totaal RNA werden omgekeerd getranscribeerd met behulp van een Primescript RT Master Kit volgens de instructies van de fabrikant. De volgende primers werden gebruikt voor de experimenten in overeenstemming met een eerder rapport [21]. HO-1: Vooruit 5′ -GC CTGTAGCCTGGTTCAAG-3′, Achteruit 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: vooruit 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, achteruit 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Vooruit 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, Omgekeerde 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3}. Porties van de verkregen cDNA's werden vervolgens geamplificeerd door middel van PCR. De reactieomstandigheden waren als volgt: initiële denaturatie bij 95 graden (30 s), gevolgd door 40 cycli van bij 95 graden (5 s), 60 graden (34 s) en 72 graden (35 s). Alle primers werden getest en het FL-fluorescentiesignaal werd gedetecteerd; vervolgens werd de △Ct-waarde berekend en werden de relatieve waarden vergeleken met die van de controlegroep met behulp van de volgende vergelijking: △Ct=Ct (monster) − Ct (endogene controle), △△Ct {{36} } △Ct (monster) −△Ct (onbehandeld), en vouwverandering=2−△△Ct. Als interne controle werd glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) gebruikt.
Eiwitextractie
PC12-cellen werden gezaaid op 100- mm-schalen met 1 x 107 cellen / schaal. Na hechting werden de cellen respectievelijk 12 uur behandeld met caleolarioside B, paraboside B en paraboside II (3,125 µM). De glycosiden werden vervolgens verwijderd en de cellen werden nog 6 uur met H202 geïncubeerd. Na incubatie werden de cellen tweemaal gewassen met koude PBS en van de schalen geschraapt met 1 ml PBS. Celhomogenaten werden gedurende 10 minuten bij 1500 rpm gecentrifugeerd. Na behandeling werden cellulaire eiwitten geëxtraheerd met behulp van een Beyotime RIPA-cellysisbuffer met 1 mM PMSF volgens de instructies van de fabrikant. Bovendien werden cytoplasmatische en nucleaire eiwitten geïsoleerd zoals beschreven in het Beyotime-protocol voor nucleaire en cytoplasmatische extractiekit. De eiwitconcentraties van de monsters werden gedetecteerd met behulp van een Beyotime BCA-eiwittestkit en alle monsters werden bewaard bij -80 graden voor western-blotting-analyse [6].
Western-blot-analyse
SDS-PAGE-elektroforese werd uitgevoerd na extractie en daaropvolgende denaturatie van totaal eiwit uit verschillende groepen. Na elektroforese werd het eiwit overgebracht naar PVDF-membranen, die vervolgens gedurende 4 uur werden geblokkeerd met 5 procent magere melkpoeder. Na wassen, primair antilichaam (konijn polyklonaal antilichaam GAPDH (1:10,000 verdunning), konijn polyklonaal antilichaam HO-1 (1:1000 verdunning), of konijn polyklonaal antilichaam GCLC (1:1000 verdunning) werd toegevoegd aan de membranen, die een nacht bij 4°C werden geïncubeerd De volgende dag werden de PVDF-membranen driemaal gewassen in TTBS Vervolgens werd een secundair antilichaam (geconjugeerde affiniteit pure geit anti-konijn IgG (1:1000 verdunning) gelabeld met mierikswortelperoxidase werd aan de membranen toegevoegd, die vervolgens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur werden geïncubeerd.De PVDF-membranen werden gewassen en onderworpen aan ECL-chemiluminescentiedetectiereagens voor signalering van blootstelling op röntgenfilm, die vervolgens werd gefixeerd en gescand [22].
statistische analyse
De gegevens zijn geanalyseerd met SPSS 19.0 en de resultaten worden gepresenteerd als de gemiddelden met standaarddeviatie (SD) van drie onafhankelijke experimenten. Waarden van p < 0.05="" werden="" beschouwd="" als="" statistisch="" significante="">
Resultaten Oprichting H2O2-model
Zoals weergegeven in figuur 2, veroorzaakte H2O2 bij 50, 100 en 200 M niet het juiste niveau van celdood. 400 M H2O2 werkte echter binnen 2-6 uur op PC12-cellen en de oxidatieve schade aan cellen was meestal stabiel. Daarom waren we van mening dat inductie met H2O2 in een concentratie van 400 M gedurende 6 uur geschikt was voor het nabootsen van door oxidatieve stress geïnduceerde schade aan PC12-cellen.
Beschermende effecten van ruwe extracten op PC12-cellen behandeld met H2O2
Vergeleken met dat in de H2O2-modelgroep (Figuur 3), extract van n-butanol in concentraties van 0.05, 0.1, {{10} }.2 en 0.4 mg/ml verbeterden de oxidatieve schade aan PC12-cellen, geïnduceerd door H2O2 (p < 0.05)="" significant="" op="" een="" concentratieafhankelijke="" manier.="" deze="" gegevens="" suggereerden="" dat="" de="" n-butanolfractie="" een="" sterkere="" beschermende="" activiteit="" bevatte.="" petroleumether-="" en="" ethylacetaatextracten="" vertoonden="" echter="" alleen="" beschermende="" activiteit="" bij="" hoge="" concentraties="" (petroleumether:="" 0.1="" en="" 0.2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5:="" ethylacetaat:="" 0,2="" en="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" bovendien="" vertoonden="" verschillende="" concentraties="" waterige="" fase-extracten="" geen="" beschermende="" effecten="" (p=""> 0,05). Verder hebben we gegevens toegevoegd van een validatiestudie met behulp van SH-SY5Y humane neuroblastoomcellijnen (SH-SY5Y) in het aanvullende bestand. Behandeling met 250 M H2O2 resulteerde in verminderde levensvatbaarheid van de cellen; behandeling met caleolarioside B, paraboside B en paraboside II (3,125, 6,25, 12,5, 25 en 50 M) verminderde de SH-SY5Y-celdood echter aanzienlijk. De resultaten van het experiment toonden aan dat caleolarioside B, paraboside B en paraboside II SHSY5Y-cellen beschermden tegen H2O2-geïnduceerde celbeschadiging.
Structuren van verbindingen geïsoleerd uit de n-butanolfractie
Om te bevestigen dat het n-butanolextract actieve componenten bevatte, hebben we acht verbindingen uit de extractie verder gefractioneerd. De structuren van verbindingen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8 werden geïdentificeerd door verschillende spectrale gegevens (1H-NMR, 13C-NMR en ESI-MS) op basis van vergelijkingen met gepubliceerde gegevens voor paraboside A , paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B en isonuomioside A, respectievelijk [20]. De gegevens voor paraboside B waren bijvoorbeeld als volgt: bruine gom; ½ 20 D − 55,7 (c 0,05, CH30H) [20]; UVMeOH max nm (logA): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm−1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [20]; voor 1H en 13C NMR spectroscopische gedetailleerde gegevens getoond in referentie 20; HR-ESI-MS (negatief) m/z 741,2231 [MH]− (berekend voor C33H41O19, 741.2242) [20]. De gegevens voor paraboside II waren als volgt: witte amorfe poeders; ½ 20 D − 80,5 (c 0,05, CH30H) [20]; UVMeOH max nm (logA): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm−1 : 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; voor 1H en 13C NMR spectroscopische gedetailleerde gegevens getoond in referentie 20; ESI-MS (negatief) m/z 637
Beschermende effecten van geïsoleerde verbindingen tegen H202-geïnduceerde toxiciteit in PC12-cellen
MTS-assays werden gebruikt om het effect te onderzoeken van geïsoleerde verbindingen op de levensvatbaarheid van PC12-cellen die zijn blootgesteld aan H2O2-geïnduceerde toxiciteit. Zoals weergegeven in figuur 5, vergeleken met die in de controlegroep, werden PC12-cellen voorbehandeld met vijf verschillende concentraties van caleolarioside B, paraboside B, paraboside II of paraboside A (3.125, 6.25, 12.5, 25 en 50 μM) gedurende 24 uur vertoonde geen significante verschillen in levensvatbaarheid van de cellen (p> 0,05). Voorbehandeling van PC12-cellen met caleolarioside B, paraboside B en paraboside II resulteerde dus niet in cytotoxiciteit. Zoals weergegeven in figuur 6, verminderde 400 µM H2O2 de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk in vergelijking met die in de controlegroep. Bovendien nam de cellevensvatbaarheid van met H2O2- behandelde PC12-cellen aanzienlijk toe na voorbehandeling van PC12-cellen met verschillende concentraties van caleolarioside B, paraboside B en paraboside II; bovendien was de levensvatbaarheid van de cellen het hoogst na behandeling met 50 µM caleolarioside B, 50 µM paraboside B en 12,5 µM paraboside II. De andere vijf verbindingen vertoonden geen significante beschermende effecten op met H2O2-behandelde PC12-cellen. Om deze bevinding te illustreren, bespreken we een van deze als voorbeeld, terwijl de andere niet in het manuscript worden beschreven.
Transcriptieniveaus van HO-1 en GCLC
Vervolgens hebben we de transcriptionele niveaus van HO{{0}} en GCLC getest in PC12-cellen die waren behandeld met caleolarioside B, paraboside B en paraboside II. Totaal mRNA werd gedurende 12 uur verzameld uit behandelde en onbehandelde PC12-cellen en vervolgens onderworpen aan expressieanalyse door qRT-PCR. Zoals weergegeven in figuur 7(a,c,e), namen de transcriptionele niveaus van HO-1 significant toe nadat PC12-cellen 12 uur waren voorbehandeld met de aangegeven concentraties van caleolarioside B, paraboside B en paraboside II (p < 0.05).="" zoals="" getoond="" in="" figuur="" 7(b),="" namen="" de="" transcriptionele="" niveaus="" van="" gclc="" ook="" significant="" toe="" in="" pc12-cellen="" die="" 12="" uur="" waren="" voorbehandeld="" met="" de="" aangegeven="" concentraties="" van="" caleolarioside="" b.="" de="" niveaus="" van="" gclc="" in="" pc12-cellen="" die="" 12="" uur="" waren="" voorbehandeld="" met="" paraboside="" b,="" namen="" echter="" significant="" af="" in="" vergelijking="" met="" die="" in="" de="" modelgroep="" (p=""><0,05; figuur="" 7="" (d)).="" bovendien="" waren="" met="" paraboside="" ii-behandeling="" de="" niveaus="" van="" gclc="" in="" pc12-cellen="" niet="" significant="" verschillend="" in="" vergelijking="" met="" die="" in="" de="" modelgroep="" (p=""> 0,05; Figuur 7 (f)).
Expressie van HO-1 en GCLC
HO{{0}} en GCLC zijn belangrijke cellulaire antioxidant-enzymen en beide zijn Nrf2-gereguleerde stroomafwaartse genen. De eiwitexpressie van HO-1 en GCLC werd ook waargenomen na behandeling [6]. Figuur 8 toont de eiwitniveaus van HO-1 en GCLC in PC12-cellen na behandeling met 400 M H2O2; de resultaten gaven aan dat de FL-fluorescentie-intensiteiten van HO-1 in de groepen met caleolarioside B en paraboside B groter waren dan die in de met H2O2- behandelde groepen (Figuur 8(a,c)). De expressie van GCLC werd echter niet significant veranderd door de verbindingen, behalve voor caleolarioside B (Figuur 8(b)). Vervolgens werden chemische remmers van HO-1 gebruikt om de rol van antioxidante enzymen bij het reguleren van de beschermende effecten van caleolarioside B, paraboside B of paraboside II tegen H2O2-geïnduceerde cytotoxiciteit verder te evalueren. Caleolarioside B, paraboside B en paraboside II (3,125 µM) voorkwamen H2O2-geïnduceerde cytotoxiciteit, maar dergelijke beschermende effecten werden ongedaan gemaakt door de HO-1-remmer ZnPP (p < 0,01)="" bij="" 15="" µm="" (figuur="" 8="">
Het voordeel van Cistanche: Verhoog de mannelijke reproductie
Discussie
De vergrijzing van de bevolking is een ernstig wereldwijd probleem. Veel ziekten zijn gerelateerd aan seniliteit, zoals AD en PD, die ernstige bedreigingen vormen voor de volksgezondheid. AD en PD zijn naar voren gekomen als de derde meest dodelijke ziekten wereldwijd, na hart- en vaatziekten en kanker. Daarom is neurodegeneratie wereldwijd een urgent onderzoeksonderwerp geworden. De pathogenese van AD en PD, neurodegeneratieve ziekten van het centrale zenuwstelsel, is tot op heden echter onduidelijk gebleven. Bovendien zijn er maar een paar medicijnen die AD of PD effectief kunnen behandelen vanwege hun complexe pathogene mechanismen [23]. Eerdere studies toonden aan dat ROS, zoals superoxide-anion (O2−) en H2O2, de belangrijkste factoren zijn die bijdragen aan neurodegeneratieve ziekten. Pathologische veranderingen tijdens PD omvatten neuronale degeneratie en dood van de substantia nigra en striatale dopamine [24,25]. Dienovereenkomstig is het belangrijk om effectieve antioxiderende geneesmiddelen te ontwikkelen om PD te behandelen, en dergelijke ontdekking van geneesmiddelen is een belangrijke onderzoeksrichting geworden [26]. Momenteel lijkt de Nrf2 / ARE-signaalroute de belangrijkste endogene antioxidant-stressroute [27]. Ares bevindt zich in de 5'-rangschikkingsregio's van genen, zoals HO-1 en GCLC [28,29]. HO-1 en GCLC zijn Nrf2-gerelateerde genen die stroomafwaarts van dit eiwit worden gereguleerd [6]. ARE's kunnen vervolgens de niveaus van antioxidanten beïnvloeden en de stroomafwaartse expressie van HO-1 en andere beschermende genen activeren, wat de celbeschermingsactiviteiten zou kunnen verbeteren [30,31]. Bovendien suggereerden bevindingen dat de beschermende effecten van resveratrol tegen A {{2{{50}}}}-geïnduceerde toxiciteit in PC12-cellen optreden door de opregulatie van HO-1-expressie via activering van de Nrf2 intracellulaire signaalroute [32].PC12-cellen zijn een geaccepteerd model van neurale cellen en worden uitgebreid gebruikt in onderzoeken naar neuroprotectieve effecten [33]. H2O2 kan gemakkelijk door het celmembraan gaan en zich combineren met ijzer om zeer actieve vrije radicalen te vormen, die oxidatieve stress en celbeschadiging veroorzaken [34]. H2O2 is een belangrijke ROS en vrije radicalen worden gemakkelijk gegenereerd en zijn relatief stabiel. Daarom worden ze meestal gebruikt om een oxidatief stressmodel op te zetten met behulp van PC12-cellen [5]. In deze studie induceerde voorbehandeling van PC12-cellen met niet-toxische concentraties van het plantenextract cellen tegen H2O2- die cytotoxiciteit induceerden door de vorming van ROS te verminderen. Fenylethaanglycosiden bevatten veel fenolische hydroxylgroepen die antioxiderende en antiverouderingsactiviteiten hebben. In deze studie ontdekten we dat extractie met n-butanol een betere bescherming opleverde dan andere polariteitsfracties (Figuur 3). Zo hebben we de beschermende activiteiten van acht verbindingen geïsoleerd uit de n-butanolfractie verder gescreend. De resultaten toonden voor het eerst dat Figuur 8. Analyse van HO-1- en GCLC-eiwitniveaus op PC12-cellen. (a) Western-blotanalyse van de expressie van HO -1 en GCLC en GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. (b) Western-blot-analyse GCLC-eiwitexpressie. (c) Western blot-analyse HO -1 eiwitexpressie. (d) HO-1-remmer ZnPP verminderde het neuroprotectieve effect. Gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± SD, n=3. ***p < 0.001="" versus="" controlegroep;="" #p="">< 0,05="" versus="" h2o2="" groep="" (zonder="" znpp="" behandeld),="" ##p="">< 0,01="" versus="" h2o2="" groep="" (zonder="" znpp="" behandeld),="" ###p=""><0,001 versus="" h2o2="" groep="" (zonder="" znpp="" behandeld);="" en="" p="">< 0,01,="" versus="" h2o2-groep="" (met="" znpp="" behandeld),="" en="" &p=""><0,001, versus="" h2o2-groep="" (met="" znpp="" behandeld).="" (controlegroep;="" modelgroep:="" h2o2;="" znpp-negatieve="" groep:="" caleolarioside="" b="" plus="" h2o2,="" paraboside="" b="" plus="" h2o2,="" paraboside="" ii="" plus="" h2o2;="" znpp-positieve="" groep:="" znpp="" plus="" caleolarioside="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" ii="" plus="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" gedownload="" van="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" door="" gast="" op="" 27="" augustus="" 2021caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" en="" paraboside="" ii="" hebben="" significante="" beschermende="" effecten="" tegen="" h2o2--geïnduceerde="" oxidatieve="" schade="" in="" pc12-cellen.="" de="" resultaten="" gaven="" ook="" aan="" dat="" h2o2-behandeling="" significante="" pc12-celbeschadiging="" en="" verminderde="" levensvatbaarheid="" van="" de="" cellen="" veroorzaakte,="" terwijl="" behandeling="" met="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" en="" paraboside="" ii="" deze="" effecten="" significant="" verzachtte="" (figuur="" 6).="" een="" eerdere="" studie="" meldde="" dat="" de="" nrf2="" are-route="" een="" van="" de="" belangrijkste="" endogene="" antioxidantroutes="" is="" en="" de="" expressie="" van="" stroomafwaartse="" markers,="" zoals="" ho-1,="" kan="" opreguleren="" om="" cellen="" te="" beschermen="" [7].="" de="" resultaten="" van="" qrt-pcr="" en="" western="" blotting-analyses="" toonden="" aan="" dat="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" en="" paraboside="" ii="" de="" niveaus="" van="" ho-1="" significant="" verhoogden.="" de="" transcriptionele="" niveaus="" van="" gclc="" namen="" echter="" significant="" toe="" in="" pc12-cellen="" die="" waren="" voorbehandeld="" met="" caleolarioside="" b,="" maar="" namen="" af="" in="" die="" voorbehandeld="" met="" paraboside="" b="" in="" vergelijking="" met="" die="" in="" de="" modelgroep.="" verder="" veranderde="" paraboside="" ii="" de="" expressie="" van="" deze="" marker="" niet,="" vergeleken="" met="" die="" in="" de="" modelgroep="" (figuren="" 7="" en="" 8="" (a-c)).="" bovendien="" werden="" de="" beschermende="" effecten="" van="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" en="" paraboside="" ii="" tegen="" h2o2-geïnduceerde="" pc12-celbeschadiging="" ongedaan="" gemaakt="" door="" de="" ho-1-remmer="" znpp="" (figuur="" 8(d)).="" concluderend="" beschermden="" de="" fenylethanoïde="" glycosiden="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" en="" paraboside="" ii="" pc12-cellen="" effectief="" tegen="" h2o2-geïnduceerde="" oxidatieve="" schade.="" dienovereenkomstig="" zouden="" deze="" verbindingen,="" geïsoleerd="" uit="" p.="" martini,="" potentiële="" geneesmiddelkandidaten="" kunnen="" zijn="" voor="" de="" behandeling="" van="" neurodegeneratieve="">
Het voordeel van Cistanche:behandeling van neurodegeneratieve ziekten
Referenties
[1] Butterfield DA. Perspectieven op oxidatieve stress bij de ziekte van Alzheimer en voorspellingen van toekomstig onderzoek benadrukt. J Alzheimer Dis. 2018;64:1–11.
[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Oxidatieve stress en het amyloïde-bèta-peptide bij de ziekte van Alzheimer. Redox Biol. 2018;14:450-464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Schade aan dopaminerge neuronen door oxidatieve stress bij de ziekte van Parkinson (review). Int J Mol Med. 2018;41:1817-1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. Associatie van rs823128-, rs1572931- en rs823156-polymorfismen met verminderde risico's op de ziekte van Parkinson. Neurorapport. 2017;27:936-941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, et al. Antioxiderende werking van 7,8-dihydroxyflavone beschermt PC12-cellen tegen 6-hydroxydopamine-geïnduceerde cytotoxiciteit. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Neuroprotectieve effecten van vier fenylethanoïde glycosiden op H2O2-geïnduceerde apoptose op PC12-cellen via de Nrf2/ARE-route. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Nrf2-ARE-route: een opkomend doelwit tegen oxidatieve stress en neuro-inflammatie bij neurodegeneratieve ziekten. Pharmacol Therapeut. 2016;157:84-104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP, et al. De effecten van fenylethanoïde glycosiden, afgeleid van:Herba cistanche, over cognitieve gebreken en antioxiderende activiteiten bij mannelijke SAMP8-muizen. J Toxicol Env Heal A. 2017; 80: 1180-1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Fenylethanoïde glycosiden van teakhouten knopen en hun antioxiderende werking. J Biol Actief Prod Nat. 2016;6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, et al. Antioxiderende activiteit van caffeoylfenylethanoïde glycosideverbindingen van Lindernia ruellioides in vitro. Cent Zuid-Pharm. 2017;15:1687-1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. De rol van de Nrf2-ARE-route bij schade door oxidatieve stress en de relatie met andere signaalroutes. Anim Veeteelt Sci. 2016;37:42-48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, et al. Vooruitgang in de studie van Gesneriaceae. Chin J Nieuw medicijn. 2003;12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. Onderzoek vooruitgang op Gesneriaceae plant. Chin Wild Plant Resour. 2006;25:1-6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, et al. Onderzoeksvooruitgang van triterpenoïden van Gesneriaceae-planten. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.
[15] Chinees kruidengeneeskundig bedrijf. De bronnen van de Chinese traditionele geneeskunde. China: Wetenschappers; 1994.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG, et al. Distributie van fenylethanoïde glycosiden in geneeskrachtige planten van Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267-4270.
[17] Hij ZD, Lau KM, Xu HX, et al. Antioxiderende activiteit van fenylethanoïde glycosiden van Brandisia hancei. J Ethnopharmacol. 2000;71:483-486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG, et al. Onderzoek naar de antioxidantactiviteiten vanfenylethanoïde glycosiden van Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835-15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. Beschermende effecten vanglycosiden van cistancheover de beschadiging van PC12-cellen PARABOLA MARTINI BESCHERM PC12-CELLEN TEGEN H2O2-VERWEZENLIJKT LETSEL 2211
