Regeneratieve geneeskunde heeft zich onlangs ontwikkeld als een opkomend veld
Sep 06, 2022
Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie
Abstract:We hebben eerder gerapporteerd dat c-KIT plus htaman vruchtwater afgeleide stamcellen verkregen uit overgebleven monsters van routinematige Ⅱ trimester prenatale diagnose (foetale hAFS) begiftigd zijn met regeneratief paracrien potentieel dat pro-overleving, anti-fibrotische en proliferatieve effecten stimuleert. kunnen ook worden geïsoleerd uit III trimester klinische afvalmonsters tijdens geplande C-secties (perinatale hAFS), waardoor een gemakkelijker toegankelijk alternatief wordt geboden in vergelijking met foetale hAFS. Desalniettemin is er weinig bekend over het paracriene profiel van perinataal hAFS. Hier geven we een gedetailleerde karakterisering van het totale hAFS-secretoom (dwz het geheel van oplosbare paracriene factoren die worden afgegeven door cellen in het geconditioneerde medium, hAFS-CM) en de extracellulaire blaasjes ( hAFS-EV's) erin, van Ⅱtrimester foetale versus III trimester perinatale cellen. Foetale en perinatale hAFS werden gekarakteriseerd en onderworpen aan hypoxische preconditionering om hun paracriene potentieel te verbeteren. hAFS-CM- en hAFS-EV-formuleringen werden geanalyseerd op eiwit- en chemokine/cytokine-gehalte en de EV-lading werd verder onderzocht door middel van RNA-sequencing. Het fenotype van foetale en perinatale hAFS, samen met hun corresponderende secretome formuleringen, overlapt; toch vertoonde foetale hAFS onrijpe oxidatieve fosforyleringsactiviteit in vergelijking met perinatale. De profilering van hun paracriene lading onthulde enkele verschillen volgens het zwangerschapsstadium en hypoxische preconditionering. Beide celbronnen leverden formuleringen die verrijkt waren met neurotrofe, immunomodulerende, antifibrotische en endotheliale stimulerende factoren, en het onvolgroeide foetale hAFS-secretoom werd gedefinieerd door een meer uitgesproken pro-vasculogeen, regeneratief, pro-oplossend en anti-verouderingsprofiel. Kleine RNA-profilering toonde microRNA-verrijking in zowel foetale als perinatale hAFS-EV-lading, met een stabiel tot expressie gebrachte pro-oplossende kern als een moleculaire referentiesignatuur. Hier bevestigen we dat hAFS een aantrekkelijke bron van regeneratieve paracriene factoren vertegenwoordigt; de selectie van foetale of perinatale hAFS-secretoomformuleringen voor toekomstige paracriene therapie moet worden geëvalueerd rekening houdend met het specifieke klinische scenario.
trefwoorden:vruchtwater; stamcellen; paracriene effecten; extracellulaire blaasjes; celgeconditioneerd medium; chemokine; cytokinen; proteomica; RNA-sequencing; microRNA
1. Inleiding
Regeneratieve geneeskunde heeft zich onlangs ontwikkeld als een opkomend gebied om functioneel herstel van beschadigd weefsel te bieden door middel van verschillende strategieën. Aangezien de benaderingen van weefselengineering de afgelopen jaren aanzienlijk zijn gevorderd, is het onderzoek naar paracriene effecten van stamcellen tegelijkertijd steeds intensiever geworden. Het is algemeen aangetoond dat het therapeutische potentieel van getransplanteerde stamcellen voornamelijk wordt gemedieerd door hun uitgescheiden oplosbare factoren, die een pro-regeneratieve micro-omgeving in het gastheerweefsel kunnen orkestreren en tegelijkertijd de activering van endogene mechanismen van functioneel herstel kunnen activeren [1,2]. Daarom wordt het stamcelsecretoom het geheel van door cellen afgegeven paracriene trofische moleculen, evenals membraangebonden extracellulaire blaasjes, in toenemende mate voorgesteld als een innovatief therapiegeneesmiddel door meerdere onafhankelijke preklinische onderzoeken die zich richten op cardiovasculaire, neurologische en/of inflammatoire ziekte. Dienovereenkomstig kunnen stamcellen worden gezien als biologische fabrieken voor de exploitatie van hun therapeutische secretoom door het aanbieden van kant-en-klare en kant-en-klare regeneratieve behandelingen. Door een dergelijke celgebaseerde, maar celvrije strategie toe te passen, kunnen veel beperkende aspecten die verband houden met canonieke celtherapie worden overwonnen, terwijl toch gunstige effecten worden gegarandeerd.wat is een cistanche?In dit perspectief zijn mesenchymale stromale cellen (MSC) uitgebreid getest als mogelijke celkandidaten? Inderdaad, MSC en stam/voorlopercellen zijn gemanipuleerd en/of gestimuleerd door verschillende preconditioneringsstrategieën om hun regeneratieve capaciteit en secretiepotentieel te verbeteren [3,4] met een expliciete interesse in de biologische relevantie van hun uitgescheiden extracellulaire blaasjes (EV's).
EV's zijn deeltjes van nanogrootte die worden begrensd door een lipide dubbellaag en actief worden uitgescheiden door alle celtypen. EV's omvatten zeer kleine (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); ze werken als kritische biologische transporteurs van intercellulaire signalering door hun moleculaire lading van een oudercel af te leveren aan een responder/doelwit [5,6]. Aangezien hun eigenaardige paracriene potentieel bij het uitoefenen van gunstige effecten vergelijkbaar is met hun cellen van oorsprong, zijn stamcel-EV's ontstaan als aantrekkelijke therapeutische opties in preklinische modellen van ziekten, zoals ischemie, ontsteking of letsel, zoals uitgebreid besproken in [{{3 }}]. Vanuit een translationeel perspectief zijn, naast het celmodulerende potentieel, de haalbaarheid van isolatie en verhoogde zelfvernieuwing belangrijke aspecten van de ideale bron van therapeutische EV's en oplosbare factoren. In een dergelijk scenario kunnen foetale en perinatale MSC een interessante optie bieden gezien hun proliferatieve potentieel en ontwikkelingsonrijp profiel met intermediaire kenmerken tussen embryonale en volwassen somatische voorlopers [10,11]. Foetale MSC kan worden geïsoleerd uit extra-embryonale bijlagen tijdens de dracht als overgebleven monster verkregen tijdens prenatale screening (dwz chorionvlokken [12-14] en vruchtwater [15,16]) of verkregen als perinatale voorlopers bij de geboorte, uit klinisch afvalmateriaal (dwz vruchtwater- en placentamembranen [17-21], navelstrengcomponenten [22-24] en term vruchtwater [25,26]).
Cistanche kan anti-aging
Met name zijn menselijke vruchtwaterstamcellen (hAFS) gemarkeerd als veelbelovende therapeutische strategieën in de regeneratieve geneeskunde. en waarvan is aangetoond dat ze breed multipotent zijn in vitro en in vivo [16,27,28], bijdragen aan de hematopoëtische lijn na transplantatie in de baarmoeder [29], en transplanteren in beschadigde organen terwijl ze immunomodulerende effecten uitoefenen [26,30] en activeren endogene herstellende reacties, zoals uitgebreid beschreven in [31]. Ons team en anderen hebben verder aangetoond dat hAFS een secretoom afgeeft dat sterk verrijkt is met bioactieve trofische moleculen die in staat zijn om verschillende reparatiemechanismen aan te pakken. Van paracriene factoren van hAFS is gemeld dat ze pro-overlevingsstimuli verschaffen met het doven van ontsteking [32], cardioprotectie bieden tegen langdurige ischemie [33.34] en cardiotoxiciteit [35], en lokale angiogenese stimuleren met re-entry van de cardiomyocytcelcyclus [ 34,36]. Aangezien is aangetoond dat de meeste van deze effecten worden gerecapituleerd door toediening van hAFS-EV alleen, hebben onafhankelijke onderzoeken zich gericht op het ontleden van hun regeneratieve profiel tegen verschillende pathologische achtergronden, waaronder skelet- en hartspierletsel, nierziekte, osteoartritis, osteoporose, necrotiserende enterocolitis en neurodegeneratieve modellen [34,37-44].
Hoewel bewijs de klinische vertaling van hAFS-EV's voor toekomstige paracriene therapie kan ondersteunen, is het belangrijk om te bedenken dat de meeste van deze onderzoeken voornamelijk het modulerende potentieel van foetaal hAFS hebben onderzocht dat is verkregen tijdens prenatale screening van Ⅱ trimester. Inderdaad, een volledig profiel van het secretoom van de perinatale tegenhanger (dwz vanaf III trimester c-secties) is nog niet in detail onderzocht. Perinatale hAFS in het derde trimester hebben onderscheidende immuunregulerende eigenschappen laten zien in vergelijking met die van mij- en II-trimester [26], terwijl het relevante endotheliale regeneratieve potentieel behouden blijft [25].hoeveel cistanche moet je nemen?Merk op dat het recente rapport over de heterogene morfologie van foetaal hAFS [45] nieuwe inzichten heeft opgeleverd in hun stamheid en genexpressieprofiel.bioflavonoïdenDit heeft geheel nieuw licht geworpen op de regeneratieve waarde van de verschillende cellulaire fracties van hAFS[46]. Daarom trekt een uitgebreide karakterisering van de verschillende subpopulaties van hAFS steeds meer aandacht. We hebben eerder gemeld dat een 24-uurs hypoxische en serumvrije stimulatie een effectieve strategie vertegenwoordigt om het paracriene potentieel van foetaal hAFS in het Ⅱ trimester te verhogen [34,35,37]. Omdat er weinig bekend is over de samenstelling van het secretoom van III trimester hAFS, rapporteren we hier de uitgebreide vergelijking van Ⅱ versus Ⅲ trimester hAFS en hun secretoomfracties (inclusief hats-EV's), om de invloed van zwangerschapsstadium en hypoxische cel aan te pakken preconditionering op cel- en secretoomkenmerken.
2. Resultaten
2.1.Perinatale hAFS Presenteert een nauwe fenotypische match met foetale heeft
Er werd geen statistisch relevant verschil gewaardeerd in donorleeftijd tussen foetaal Il-trimester en perinataal III-trimester vruchtwatermonsters. Foetaal c-KIT* hAFS (f-hAFS uit II trimester vruchtwatermonsters) en perinataal c-KIT* hAFS (p-hAFS uit III trimester vruchtwater klinisch afval) bevestigden vergelijkbare kenmerken met fibroblast-achtige en ovale ronde morfologie (Figuur 1A) en mesenchymaal stromaal fenotype (gegevens niet getoond), zoals eerder gerapporteerd [16,25]. Zowel f-hAFS als p-hAFS gekweekt in vitro tot passage 5 vertoonden verwaarloosbare niveaus van veroudering van senescentie-geassocieerde - -galactosidase (SA- -Gal) activering in ongeveer 4 procent van de cellen (Figuur 1B) . Zowel f-hAFS als p-hAFS vertoonden een hoog niveau van co-expressie van de mesenchymale markers CD107a en CD146, waarvan recent is gerapporteerd dat ze een zeer secretoir fenotype definiëren [47]. CD107at CD146*-cellen vertegenwoordigden de meerderheid van de f-hAFS-populatie (ongeveer 64 procent,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">
Figuur 1. Foetale heeft en perinatale hebben fenotypische evaluatie. (A) representatieve beelden van foetale hAFS (f-hAFS, linkerpaneel) en perinatale hAFS (p-hAFS, rechterpaneel) in vitro gekweekt onder standaardomstandigheden; schaalbalk: 200 um. (B) Analyse van de verouderingsmarker beta-galactosidase (SA- -Gal, in blauw) via cytochemische kleuring op f-hAFS en p-hAFS na 5 passages in kweek; representatieve beelden worden gerapporteerd in het linkerdeelvenster, schaalbalk: 200 um. Het overeenkomstige percentage -Gal-positieve cellen/veld wordt weergegeven in de grafiek in het rechterdeelvenster (f-hAFS:4.12±0.58 procent en p-hAFS:3.88±2.10 procent;p=0.1424,n{ {24}} experimenten). (C) Immunofenotype van hAFS dat CD146- en CD107a-mesenchymale markers tot expressie brengt. Representatieve flowcytometrie plots van f-hAFS en p-hAFS (linker paneel) en overeenkomstige waarden verwezen naar dubbel positieve CD107a plus CD146 plus cellen; CD107a plus CD146* f-hAFS:63,68 ± 5,82 procent,*p=0,016 vergeleken met restg36,32 ± 5,82 procent f-hAFS (overig); CD107 bij CD146 plus p-hAFS: 52,07 ± 6,76 procent met de rest47. 93±56,76 procent p-hAFS (overig); CD107a plus CD146 plus f-hAFS vs CD107a plus CD146 plus p-hAFS p=0.2403,n=4 experimenten. Overig: totale hoeveelheid resterende CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS en CD107 bij CD146-hAFS. Alle waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± sem van onafhankelijke experimenten. SA- -Gal: senescentie-geassocieerd- -galactosidase.
2.2. Foetale hAFS vertoont een ander metabolisme dan perinatale hAFS
Om te evalueren of het zwangerschapsstadium het mitochondriale metabolisme kan beïnvloeden, werden f-hAFS en p-hAFS geanalyseerd in standaard in vitro kweekomstandigheden door middel van biochemische analyses. Evaluatie van het aerobe metabolisme toonde aan dat de zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) en ATP-synthese lager waren in f-hAFS ten opzichte van p-hAFS, beide wanneer gestimuleerd met pyruvaat plus malaat (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">
Hypoxische preconditionering heeft geen invloed op foetale en perinatale levensvatbaarheid en ondersteunt hun secretoire activiteit
Om hAFS-secretoomformuleringen te definiëren, werden cellen gekweekt in serumvrije omstandigheden om verontreiniging door FBS te voorkomen. We hebben eerder aangetoond dat 24 uur serumvrije (SF) en 1 procent O2 hypoxische kweekomstandigheden de levensvatbaarheid van Ⅱtrimester foetaal hAFS (f-hope) niet significant veranderden, terwijl ze de afgifte van regeneratieve paracriene factoren in hun celgeconditioneerde medium ondersteunden. (hAFS-CM) en in extracellulaire blaasjes (hAFS. EV's) [34,35,37,49]. Hierin hebben we, naast het voor het eerst profileren van de p-hAFS-secretoomfracties, geëvalueerd of p-soortgelijk gedrag vertoonde onder hetzelfde preconditioneringsregime, met behulp van de normoxische kweekconditie als de controle. De levensvatbaarheid van f-hAFS en p-hAFS werden geanalyseerd na 24 uur in de volgende instellingen: normoxische (20 procent O2) toestand in volledige controle (Ctrl) kweekmedium (Ctrlf-hAFSnormo en Ctrl p-hAFSnormo), een normoxische toestand in SF-medium (SF f-hAFSnormo en SF p-hAFSnormo), hypoxische (1 procent O2) toestand in volledig controlemedium (Ctrlf-heeft hypo en Ctrl p-hAFSnypo), en hypoxische toestand in SF medium (SF f-heeft hypo en SF p -heeft hypo, figuur 3A). We hebben bevestigd dat de levensvatbaarheid van f-has ongewijzigd was in zowel Ctrl- als SF-omstandigheden en onder hypoxische stimulatie, waarbij meer dan 80 procent (tot bijna 88 procent) van de totale cellen onaangetast bleef. Vroege en late apoptotische cellen varieerden van ca. 13 tot 18 procent in SF-omstandigheden, zonder enige statistisch significante relevantie. Evenzo lag de levensvatbaarheid van perinataal in het bereik van 80-92 procent, en vroege en late apoptotische cellen vertegenwoordigden tot 18 procent in SF-omstandigheden. p-hAFS werd alleen marginaal beïnvloed onder de gecombineerde hypoxische en SF-omstandigheden; inderdaad, terwijl preconditionering de celoverleving niet beïnvloedde wanneer p-hAFS in een compleet medium werd gekweekt, vertoonde de overeenkomstige SF-conditie een toename met ca. 4-vouw (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">
Figuur 2. Metabolische karakterisering van foetale en perinatale AFS. (A) Zuurstofverbruik (OCR), ATP-synthese via F1-F.ATP-synthase en P/O-verhouding in f-have en-have in aanwezigheid van pyruvaat plus malaat (P/M) of succinaat (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustraliëDe vergelijking van het percentage remming van OCR en ATP-synthese in f-en-hAFS als gevolg van de hierboven aangegeven remmers wordt gerapporteerd in het onderste deelvenster B. Voor OCR-experimenten: hAFS plus Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">
Vervolgens evalueerden we de opbrengst van secretoomfracties verkregen uit f-hAFS versus p-hAFS op basis van eiwitverrijking. Het totaal heeft een secretoom, aangezien het geheel van de door cellen uitgescheiden paracriene factoren hier wordt weergegeven door de hAFS-CM. De eiwitconcentratie van f-hAFS-CM en p-hAFS-CM in SF-medium na hypoxische celvoorconditionering versus controle normoxische toestand als basislijn (namelijk f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo en p -hAFS-CMHypo,) werd geëvalueerd door BCA-assay en gemeten volgens 10'-cellen.cistanchDe verkregen resultaten suggereerden dat f-has-CM en p-hAFS-CM een gelijke positieve trend in eiwitverrijking vertoonden na hypoxische priming (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 graden cellen; p-hAFS-CMNypo∶182.30±29.71 ug/10 graden cellen） over hun normoxische tegenhangers (f-hAFS-CMnormo:105.50±19.89 ug/10 graden cellen; p- hAFS-CMhypoi 91,12 ± 24,39 ug/10 graden cellen A. Evenzo werd de oppervlakte-eiwitconcentratie van hAFS-EV's gemeten in f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo en p-hAFS-EVShypo EV's vertoonden vergelijkbare opbrengst wanneer verkregen uit f-hAFS of p-hAFS. Wat betreft hAFS-CM-formuleringen, een positieve trend in de toename van het eiwitgehalte op f-hAFS-EV's en p-hAFS. EV's werden gewaardeerd na hypoxische stimulatie over de overeenkomstige normoxische toestand （f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 graden cellen en p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 graden cellen;f-have-EVsnormo∶1,28±0,36ug/10 graden cellen en p -hAFS-EVsnormo-1,19 ± 0,31 ug/10 graden cellen, figuur 3C).
2.4.Fetale en perinatale hAFS geven EV's vrij met analoge morfologie en grootteverdeling
Morfologische analyse door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) verhoogde de hoge EV-secretoire proliferatie van zowel f-hAFS als p-hAFS (Figuur 4). We onderzochten verder de grootte en het gebied van f-hAFS-EV's en p-hAFS-EV's (Figuur 4B) na hypoxische preconditionering in vergelijking met normoxische baseline. Foetaal en perinataal hebben EV's vrijgegeven die heterogeen in grootte zijn, in het bereik van 40-250 nm, dus inclusief zowel exosomen/kleine EV's als microblaasjes/afscheidende blaasjes. De gemiddelde grootte van EV's/veld in de verschillende groepen was vergelijkbaar, foetale hAFS-EV's gemeten 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) en perinatale gemeten 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, figuur 4B, linkerpaneel). Wat de opbrengst betreft, vertoonde hAFS gestimuleerd onder hypoxie een positieve trend in de toename van het aantal kleine EV's, hoewel deze toename niet statistisch significant was. f-hAFS-EVStypo mat 40-70 nm, wat bijna het dubbele was in vergelijking met hun normoxische tegenhanger. Perinatal-has-EVSHypo dat 40-70 nm, 70-100 nm en 100-130 nm gemeten, was bijna driemaal de hoeveelheid die werd verkregen in normoxische cultuur (Figuur 4B).
Nanodeeltjesvolganalyse (NTA) toonde een verhoogd aantal deeltjes in zowel f-hAFS-EV- als p-hAFS-EV-preparaten en bevestigde de toename van EV's in de hypoxische monsters, zoals ook waargenomen bij de vorige analyses (f-hAFS- EVsnormo: 182±0.10'deeltjes/10 graden cellen; f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10 graden deeltjes/10 graden cellen ;p-hAFS-EVsnormo:2,43±0,80×10 graden deeltjes/10 graden cellen;p-hAFS-EVshypo:3,05±0,62x10 graden deeltjes/10 graden cellen, figuur 4C).
Figuur 4. Morfologische karakterisering van foetale en perinatale have-EV's. (A) Representatieve beelden van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van f-hAFS en p-hAFS (respectievelijk bovenste en onderste linkerpaneel, met zwarte pijlen die intracytoplasmatische multi-vesiculaire lichamen aangeven met kleine EV's/exosomen erin), en van f -hAFS-EV's en p-hAFS-EV's (respectievelijk bovenste en onderste rechterpaneel) afgegeven in serumvrije omstandigheden en onder normoxische versus hypoxische preconditionering (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; en f-hAFS-EVshypo, respectievelijk), schaalbalken: 200 nm. (B) linkerpaneel: TEM-analyse van de grootteverdeling van hAFS-EV's; rechterpaneel: verdeling van het aantal f-hAFS-EV's en p-hAFS-EV's per veldgrootte-intervallen van 40 nm tot 250 nm werden overwogen; waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± sem van n=3 onafhankelijke experimenten. (C) Nanodeeltjes-trackinganalyse voor hAFS-grootte en distributie. Linkerpaneel: representatief beeld van de grafische uitvoer; rechterpaneel: hAFS-EVs-concentratie gemeten als 10 graden deeltjes per 10 graden afscheidende cellen; nm: nanometer; ml: milliliter.
2.5. Proteomische karakterisering van foetale versus perinatale hAFS benadrukt verschillen in hun secretome-samenstelling volgens zwangerschapsduur en hypoxische preconditionering
Proteomische karakterisering van zowel f-hAFS- als p-hAFS-secretoomformuleringen werd uitgevoerd door middel van een shotgun-labelvrij platform, gebaseerd op de koppeling van nano-vloeistofchromatografie en hoge-resolutie massaspectrometrie (nLC-HRMS). Achtenveertig proteomische profielen werden verkregen door de dubbele analyse van drie biologische replica's van hAFS-CM en hebben-EV's van f-hAFS en p-hAFS die hypoxische celvoorconditionering ondergingen in vergelijking met de normoxische toestand als controle. Een totaal van 4179 verschillende eiwitgroepen werden geïdentificeerd met ten minste één uniek peptide en met molecuulgewichten variërend van 2 tot 3900 kDa en iso-elektrische punten van 3,6 tot 13. Er werd een hogere gemiddelde eiwitexpressie waargenomen in hAFS-EV's in vergelijking met hAFS-CM . De rangschikking van alle verkregen eiwitlijsten werd uitgevoerd op basis van geïdentificeerde eiwitten. Voor elke experimentele conditie werd een unieke lijst gemaakt die de peptidespectrumovereenkomstwaarden (PSM's) normaliseerde en gemiddeld [50] die aan de eiwitten worden toegeschreven, die het aantal aan elk toegewezen massaspectra vertegenwoordigen en indirect hun overvloed in de monsters vertegenwoordigen. De volledige lijst van eiwitten die zijn geïdentificeerd in hAFS-CM- en have-EV-formuleringen wordt gerapporteerd in tabel S1.
De toepassing van lineaire discriminantanalyse (LDA[51]) op deze hoofdlijst maakte de extractie van statistisch significante eiwitten mogelijk (Fratio groter dan of gelijk aan 4,5 en** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 in hAFS-CM en hebben-EV-formuleringen afzonderlijk beschouwd. Terwijl ongeveer 69,5 procent en 69,9 procent van de eiwitten werden gedeeld door respectievelijk hAFS-EV's en hAFS-CM-omstandigheden, leek de resterende inhoud exclusief in verschillende verhoudingen, variërend van 3,7 procent tot 13,4 procent, tussen de formuleringen.
Om de proteomische veranderingen kwantitatief te onderzoeken, werd een labelvrije differentiële analyse uitgevoerd met behulp van de zelfgemaakte MAProMa-software en twee algoritmen toe te passen, DAve (Differential Average) en DCI (Differential Confidence Index, die de verhouding en het vertrouwen in differentiële expressie vertegenwoordigen, respectievelijk), op de PSM's van elk afzonderlijk eiwit tussen de twee vergeleken termen. Gebruik van stringente filters voor DAve en DCI om het vertrouwen van identificatie te maximaliseren en om eiwitten te overwegen met een variatie groter dan een voudige verandering van 1,5, paarsgewijze vergelijkingen van f-hAFS-CM versus p-hAFS-CM en van f-hAFS-EV's versus p-hAFS-EV's werden gemaakt volgens het zwangerschapsstadium van de cel. Er werden in totaal 58 en 109 eiwitten gevonden die differentieel tot expressie werden gebracht in respectievelijk de bovenstaande has-CM- en have-EV-compartimenten (Figuur S1B, C voor geselecteerde details en tabellen S2-S3 in uitgebreide vorm). Hiervan resulteerden 30 eiwitten omhoog gereguleerd in f-hAFS-CM en 28 werden opwaarts gereguleerd in p-hAFS-CM (Figuur S1B); evenzo resulteerden 44 verschillende eiwitten in opgereguleerd in f-have-EV's en 65 werden opgewaardeerd in p-hAFS-EV's (Figuur S1C). Met name eiwitten die resulteerden in opwaartse regulatie in f-have moeten worden beschouwd als neerwaarts gereguleerd in p-has en vice versa.
waarden worden gerapporteerd; zie Tabel S2 voor de volledige lijst en gedetailleerde parameters van de gerapporteerde eiwitten. (C) Biologische processen verrijkingsanalyse van eiwitten geïdentificeerd met een frequentie van ten minste 2 in foetale hAFS-CM (linker paneel) en perinatale have-CM (rechter paneel) volgens celhypoxische preconditionering. Op basis van de FunRich-tool worden termen voor genontologie weergegeven in staafdiagrammen die het percentage genen weergeven dat voor elke categorie is verrijkt (roze balken voor-hebben-CMnormo, paarse balken voor f-hAFS-CMhypor lichtblauwe balken voor p-hAFS-CMnormo, en blauwe ballen voor p-hAFS-CMhypo).cistanche kopenAlleen termen voor genontologie met Bonferroni gecorrigeerd met *p<0.05 are="">
Dit artikel is afkomstig uit Int. J. Mol. Wetenschap. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms
