Veroudering en een lang leven zijn altijd verleidelijke onderwerpen geweest voor organismen. Als een soort volwassen stamcel met het vermogen tot zelfvernieuwing

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

Abstract:Senescentie in mesenchymale stamcellen (MSC's) belemmert niet alleen de toepassing van MSC's in de regeneratieve geneeskunde, maar is ook nauw gecorreleerd met biologische veroudering en de ontwikkeling van degeneratieve ziekten. In deze studie hebben we de anti-verouderingseffecten van curcumine (Cur) op van hondenbeenmerg afgeleide MSC's (cBMSC's) onderzocht en het potentiële werkingsmechanisme verder toegelicht op basis van de modulatie van autofagie. cBMSC's werden in vitro uitgebreid met standaardprocedures om een ​​celmodel van vroegtijdige veroudering te construeren.cistanche dosering redditOns bewijs geeft aan dat vergeleken met de derde passage van cBMSC's, veel typische senescentie-geassocieerde fenotypes werden waargenomen in de zesde passage van cBMSC's. Cur-behandeling kan de overleving van cBMSC verbeteren en cBMSC-senescentie vertragen volgens waarnemingen dat behandeling met Cur (1 uM) de efficiëntie van kolonievormende eenheid-fibroblasten (CFU-Fs) kan verbeteren en de mRNA-expressie van pluripotente transcriptiefactoren kan opreguleren (SOX{{5} } en Nanog), evenals het remmen van de senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase (SA- -gal)-activiteiten en mRNA-expressie van de senescentiegerelateerde markers (pl6 en p21) en pro-inflammatoire moleculen (tumornecrosefactor- (TNF-a) en interleukine-6(IL-6)). Verder werd waargenomen dat Cur（0.1 uM ~ 10μM） de autofagische activiteit verhoogde, zoals geïdentificeerd door opregulatie van microtubule-geassocieerde proteïne 1 lichte keten 3 (LC3), unc51-achtige autofagie-activerende kinase -1 (ULK1), autofagie-gerelateerd gen (Atg)7 en Atg12, en het genereren van type II van lichte keten 3 (LC3- II), waardoor autofagische vacuolen en zure vesiculaire organellen toenemen, zoals evenals het veroorzaken van een significante afname van het p62-eiwitniveau. Bovendien bleken de autofagie-activator rapamycine (RAP) en Cur de verouderingskenmerken van cBMSC's gedeeltelijk te verbeteren, terwijl de autofagieremmer 3-methyladenine (3-MA) de veroudering van cBMSC's verergerde en de behandeling met Cur was in staat om de onderdrukte autofagie te herstellen en 3-MA-geïnduceerde cBMSC-senescentie tegen te gaan. Daarom benadrukt onze studie de belangrijke rol van door Cur geïnduceerde autofagie en de effecten ervan op het verbeteren van cBMSC-senescentie en biedt het nieuw inzicht voor het vertragen van veroudering en het verbeteren van het therapeutisch potentieel van MSC's.

Klik hier om meer te weten

trefwoorden:curcumine;veroudering; autofagie; uit beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen van honden

1. Inleiding

Veroudering en een lang leven zijn altijd verleidelijke onderwerpen geweest voor organismen. Als een type volwassen stamcel met het vermogen tot zelfvernieuwing, immunosuppressie, differentiatie en migratie, bevinden mesenchymale stamcellen (MSC's) zich uitgebreid in verschillende weefsels en organen, zoals beenmerg, vetweefsel, vruchtwater, placenta, navelstreng koord en spieren [1,2], en spelen een essentiële rol bij het handhaven van de weefselhomeostase gedurende de levensduur van een organisme [3,4]. Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat biologische veroudering en de ontwikkeling van veel degeneratieve ziekten kunnen worden toegeschreven aan MSC-senescentie [5,6]. Bovendien zijn MSC's veelbelovende bronnen van celgebaseerde regeneratieve therapie, maar moeten ze gewoonlijk in vitro worden uitgebreid om het minimale aantal transplantaties van MSC's (20-100 miljoen) voor behandelingen te bereiken [7]. In vitro kweek is echter niet in staat om de in vivo micro-omgeving van MSC's volledig te simuleren, en veroorzaakt onvermijdelijk cellulaire veroudering [8,9] Veroudering in mitotische cellen treedt op als reactie op een verscheidenheid aan stressoren, zoals telomeerdisfunctie [10], DNA schade [11], oxidatieve stress [12] en oncogenactivering [13], en leidt uiteindelijk tot de beëindiging van de celdeling. Bovendien vertonen verouderde MSC's een negatief effect op biologische functies, waaronder immunomodulatie, differentiatie en migratie [14]. Er is veel werk gedaan om effectieve strategieën vast te stellen om veroudering bij MSC's te vertragen. Onlangs zijn verschillende van kruiden afgeleide producten gesuggereerd om de gezondheid en levensduur van organismen te bevorderen en kunnen veelbelovende hulpmiddelen zijn voor het vertragen van MSC-veroudering [15].

Cistanche kan anti-aging

Curcumine (Cur), een hydrofoob polyfenol geëxtraheerd uit kurkuma uit de traditionele Chinese geneeskunde, heeft veel aandacht getrokken vanwege zijn ontstekingsremmende, antioxiderende, anti-apoptotische, antitumor- en anti-verouderingseffecten in weefselcellen en sommige ziektemodellen [{ {4}}]. Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat Cur gezondheidsgerelateerde voordelen heeft bij leeftijdsgerelateerde ziekten, waaronder osteo-articulaire, neurologische, reproductieve en cardiovasculaire aandoeningen [20-24]. Veroudering gaat gepaard met veranderingen in het bewegingsapparaat en het ontstaan ​​en de progressie van osteoarticulaire aandoeningen. Chronische dieetinterventie met Cur bleek de motorische functie van de hand en vingers bij apen van middelbare leeftijd te verbeteren en had gunstige effecten op de oude skeletspieren [25,26]. Beschikbare gegevens van Buhrmann en collega's hebben onthuld dat Cur door de omgeving veroorzaakte artrose kan verminderen door de overleving van chondrocyten en ontstekingsreacties in evenwicht te brengen [27,28]. Bovendien oefent Cur neuroprotectieve effecten uit via het mediëren van autofagie en ontsteking en kan daarom een ​​effectieve therapie zijn voor patiënten met neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alexander, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson [29,30].

Het feit dat Cur pleiotrope activiteit bezit, kan inderdaad worden toegeschreven aan hun activerings- en beschermingseffecten op MSC's [31,32]. Verschillende onderzoeken hebben bevestigd dat Cur betrokken is bij het reguleren van de immunomodulerende vermogens; het differentiële potentieel van MSC's naar verschillende cellijnen (neurocyten, chondrocyten, adipocyten en osteoblasten) en in meerdere signaleringsmechanismen is bij dit proces betrokken [2831,33-35]. Bovendien wordt Cur ook beschouwd als een goede antioxidant om de levensduur van van rattenvetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (ADSC's) te verbeteren vanwege de toename van de telomerase reverse transcriptase (TERT) genexpressie [36]. Een recente studie toonde aan dat de remming van p65 door Cur cellulaire veroudering en ontstekingsactivering in menselijke navelstreng afgeleide MSC's kan voorkomen [37].voordelen van cistanche-extractHet is duidelijk dat er meer aandacht is besteed aan de anti-verouderingseffecten van Cur in MSC's vanwege hun enorme therapeutische potentieel, maar de mechanismen die aan dit effect ten grondslag liggen, zijn nog steeds onduidelijk. Enig bewijs uit in vitro-onderzoeken heeft bevestigd dat de gunstige effecten van Cur moeten worden toegeschreven aan de modulatie van autofagie [29,38-41]. Han en collega's hebben aangetoond dat Cur menselijke endotheelcellen van de navelstrengader (HUVEC's) kan beschermen tegen H2O2-geïnduceerde oxidatieve schade en dat positieve effecten optreden door de versterking van autofagie via fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt/ zoogdier doelwit van remming van rapamycine (mTOR) [40]. Een andere studie toonde aan dat Cur in staat is om celoverleving te bevorderen door hypoxie/reoxygenatie (H/R)-geïnduceerde apoptose en overmatige autofagie onder cardiomyocyten te remmen [41]. Of Cur als een positieve of negatieve regulator van autofagie presteert, hangt daarom af van de stressproducerende stimulus en cellulaire instelling, en er zijn meer details nodig om te bepalen of de modulatie van autofagie door Cur een effectieve strategie is voor het vertragen van MSC-senescentie. Als een principe van afbraak- en recyclingroute voor intracellulaire stoffen, speelt autofagie een cruciale rol bij het handhaven van cellulaire homeostase en het weerstaan ​​​​van omgevingsdruk en heeft het een enorm potentieel getoond voor het vertragen van cellulaire veroudering en het behandelen van leeftijdsgerelateerde ziekten. Disfunctie van organellen en accumulatie van giftige metabolieten zijn de belangrijkste kenmerken van senescente MSC's [42], wat wijst op een mogelijk verband tussen autofagie en veroudering. Ma en collega's ontdekten dat de autofagische activiteit van oude BMSC's was verminderd in vergelijking met jonge BMSC's en dat autofagieremmer 3-methyladenine (3-MA) de veroudering bij jonge MSC's zou kunnen versnellen; daarentegen ontdekten ze dat autofagie-activator rapamycine (RAP) de biologische eigenschappen van verouderde BMSC's [5] gedeeltelijk zou kunnen herstellen. Een recente studie onderzocht de rol van gemoduleerde autofagie door het gebruik van RAP en 3-MA bij MSC-senescentie geïnduceerd door D-galactose (D-gal) en toonde aan dat RAP MSC-senescentie opmerkelijk verlichtte [43]. Interessant is dat verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat een toename van autofagie wordt waargenomen bij senescente MSC's en dat autofagie onmisbaar is voor het in stand houden van de MSC-senescentieprocessen [44,45]. Daarom blijft het tegenstrijdig en dubbelzinnig of autofagie kan worden beschouwd als een positieve of negatieve regulator van senescentie in MSC's. Daarom zou het interessant zijn om de relatie tussen autofagie, MSC-senescentie en Cur te onderzoeken, wat een breder perspectief zou kunnen bieden voor het vertragen van veroudering en het verbeteren van het therapeutisch potentieel van MSC's.

In deze studie was ons primaire doel om op te helderen of Cur-behandeling de uit het beenmerg afkomstige MSC (cBMSC) senescentie van honden kon vertragen en of het onderliggende mechanisme gecorreleerd was met de modulatie van autofagie. Hiertoe evalueerden we de fenotypische karakterisering, autofagische activiteit en genexpressie na blootstelling aan Cur in senescente cBMSC's, evenals of de relatie tussen autofagie en de effecten ervan op de veroudering van cBMSC's wordt bepaald met behulp van 3-MA en RAP .

2. Resultaten

2.1. Kenmerken van cBMSC's

cBMSC's werden in vitro geëxpandeerd met standaardprocedures en er werd aangetoond dat ze stabiel werden gepasseerd over negen generaties (gegevens niet getoond). De cBMSC's vertoonden een plastic-aanhangend en fibroblast-achtig uiterlijk gedurende het hele kweekproces (Figuur 1A). De differentiatiecapaciteit van cBMSC's werd bevestigd door adipogene en osteogene inductie (Figuur 1B, C). Het immunofenotype van cBMSC's werd geëvalueerd met behulp van flowcytometrie. De resultaten toonden aan dat de celpopulatie CD90, CD105 en ITGB1 positief tot expressie bracht en CD31, CD34 en CD45 negatief tot expressie bracht, wat hun mesenchymale in plaats van hematopoëtische oorsprong suggereert (Figuur 1 en Tabel 1).

2.2.cBMSC's geven geleidelijk senescente functies weer bij uitbreiding in vitro

Early-passage cBMSC's (P1 en P3) vertonen een lange spoelvormige of driehoekige vorm en zijn gerangschikt in een draaikolk na groei in vitro (Figuur 2A). Vervolgens vertoonden cBMSC's geleidelijk senescentie-geassocieerde fenotypen in de loop van langdurige teelt in vitro, gekenmerkt door een vergrote en vlakke morfologie en een vermindering van proliferatie (Figuur 2A, B). Bovendien toonden de resultaten van een kolonievormende eenheid-fibroblast (CFU-F) -test aan dat zowel het aantal CFU-F als de grootte van de kolonies significant waren verminderd langs cultuurpassages (Figuur 2C), consistent met het gedownreguleerde mRNA expressie van pluripotente transcriptiefactoren Nanog en SOX -2 in de 6e en 9e passage (Figuur 2G).

Senescentie-geassocieerde -galactosidase (SA- -gal) is een lysosomaal enzym waarvan de activiteit sterk gecorreleerd is met cellulaire veroudering [46]. De resultaten van SA- -gal-kleuring gaven aan dat het aantal SA- -gal-positieve cellen groeide van 7,5 ± 2,4 procent (P3) tot 65.0 ±5.0 procent (P6) en 87,3 ± 3,3 procent (P9), respectievelijk (Figuur 2D).cistanche genghis khanBovendien werden verhogingen in de expressie van celcycluskinaseremmers (p21 en p16) en pro-inflammatoire moleculen (TNF- en IL-6), die werken als componenten van een senescentie-geassocieerd secretoir fenotype (SASP), gedetecteerd. in de 6e en 9e passage (Figuur 2E, F). Daarom vertonen cBMSC's een passage-afhankelijke toename van senescente fenotypes en stoppen ze de proliferatie bij de 9e passage.

2.3. Cur verlicht de senescentietoestand van cBMSC's

De cBMSC's van de 6e passage werden geïncubeerd in de afwezigheid of aanwezigheid van Cur in doses van 0,1,0,5,1,5 of 10μmol/mL（μM） voor 12 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur, en hun cellulaire levensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van CCK-8. De resultaten toonden aan dat Cur (0.1-10 uM) geen toxisch effect induceert in cBMSC's en tastbare effecten heeft op het verhogen van de levensvatbaarheid van cBMSC's na 24 uur behandeling (Figuur 3A). Om het effect van Cur op cellulaire veroudering te evalueren, werden cBMSC's gedurende 24 uur blootgesteld aan verschillende concentraties Cur (0, 1,1 en 10 uM). Het resultaat toonde aan dat het aantal SA- -gal-positieve cellen significant was afgenomen in cBMSC's na behandeling met Cur（1 M en 10uM） in vergelijking met de controlegroep (Figuur 3B). CFU-F-assays waren gebruikt om de effecten van Cur op de zelfvernieuwingsefficiëntie van cBMSC's (P6) te evalueren. De dosis van 1 uM Cur bleek de meest effectieve concentratie te zijn voor het verbeteren van de efficiëntie van de CFU-F van cBMSC's. De dosis van 10 μM Cur had echter nadelige effecten op de zelfvernieuwingsefficiëntie van cBMSC's (Figuur 3C). Bovendien werd het senescentie-verlichtende effect van Cur waargenomen bij een dosis van 1 μM, gemanifesteerd door de neerwaartse regulatie van p16, IL-6, en TNF- en opregulatie van de expressie van Nanoog en SOX-2 (Figuur 3D-F).cistanche levensverlengingAlles bij elkaar genomen geven deze resultaten aan dat Cur in een dosis van 1 uM effectief cytoprotectieve effecten kan uitoefenen op verouderde cBMSC's.

2.4. Cur-behandeling verbeterde autofagische activiteit in cBMSC's

Functionele activering van lysosoom speelt een cruciale rol in het beloop van autofagie en aandoeningen van lysosomale verzuring zijn nadelig voor de lysosomale afbraakfunctie [38]. Daarom werd autofagische activiteit voor het eerst gedetecteerd door LysoTracker-kleuring, die lysosomale verzuring kan volgen. Het resultaat gaf aan dat preconditionering met Cur dosisafhankelijk de intensiteit van rode fluorescentie in cBMSC's verhoogde, wat suggereerde dat lysosoomverzuring was toegenomen (Figuur 4D).

Om de effecten van Cur op de autofagie van cBMSC's verder te evalueren, hebben we gebruik gemaakt van de autofagosoommarkers microtubule-geassocieerd eiwit 1A/1Belight chain 3 (LC3) en p62/SQSTM1, die cruciale markers zijn voor het evalueren van autofagische flux [47,48 ]. De verhoogde autofagische activiteit werd waargenomen in cBMSC's na blootstelling aan Cur, zoals blijkt uit een dosisafhankelijke toename van de omzetting van LC{{10}}}I naar LC3-II, naast de versnellende p62 afbraak (Figuur 4A). Bovendien is de mRNA-expressie van ATG7, ATG12.LC3. en ULK1 werden opgereguleerd na Cur-behandeling (Figuur 4B). De ultrastructuur van cBMSC's werd onderzocht met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Vervolgens hebben we een toename waargenomen in de vorming van autofagosomen en autolysosomen in cBMSC's na behandeling met Cur in doses van 0,1, 1 en 10 M gedurende 24 uur (Figuur 4C).cistanche nzImmunofluorescentiekleuring toonde ook aan dat het aantal karakteristieke puntvormige fluorescerende stippen van LC3 aanzienlijk was verhoogd door Cur-behandeling (Figuur 4E). Deze resultaten gaven aan dat Cur lysosomale verzuring en autofagie-activering op een dosisafhankelijke manier kan bevorderen.

Dit artikel is afkomstig uit Int. J. Mol. Wetenschap. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms