SLC37A2, een fosforgerelateerd molecuul neemt toe in gladde spiercellen in de verkalkte aorma

Vasculaire verkalkingis een belangrijke bron vanhart-en vaatziektebij patiënten met chronische nierziekte.Hyperfosfatemieleidt tot een verhoogde intracellulaire fosforinstroom, wat leidt tot een toename van osteoblastachtige cellen in de vasculaire gladde spiercellen. PiT-1 transporteert fosfaat naar vasculaire gladde spiercellen. Het mechanisme van vasculaire calcificatie wordt echter niet volledig begrepen. Deze studie onderzocht andere kandidaat-fosforgerelateerde moleculen dan PiT-1. We veronderstelden dat fosforgerelateerde moleculen behorend tot deopgeloste stof-drager(SLC) superfamilie zou betrokken zijn bij vasculaire calcificatie. Als resultaat van DNA-microarray-analyse hebben we ons geconcentreerd op SLC37A2 en hebben we aangetoond dat de mRNA-expressie van deze cellen toenam op verkalkte gladde spiercellen van de aorta (AoSMC). Er is gerapporteerd dat SLC37A2 zowel glucose-6-fosfaat/fosfaat als fosfaat/fosfaat-uitwisselingen transporteert. In vitro-analyse toonde aan dat de SLC37A2-expressie niet werd beïnvloed door ontsteking op AoSMC. De expressie van SLC37A2-mRNA en eiwit nam toe in verkalkt AoSMC. In vivo toonde analyse aan dat SLC37A2-mRNA-expressie in de aorta vanchronische nierziekteratten was gecorreleerd met osteogene markergenen. Bovendien werd SLC37A2 tot expressie gebracht in het vasculaire calcificatiegebied inratten met chronische nierziekte. Als resultaat hebben we aangetoond dat SLC37A2 een van de moleculen is die toenemenvasculaire calcificatiein vitro en in vivo.

Sleutelwoorden: SLC37A2,vasculaire calcificatiegladde spiercellen van de aorta,chronische nierziekte, hyperfosfatemie

KLIK HIER VOOR NATUURLIJK BIOLOGISCH CISTANCHE-EXTRACT MET 25% ECHINACOSIDE EN 9% ACTEOSIDE VOOR DE NIERFUNCTIE

Ondersteunende service van Wecistanche, de grootste cistanche-exporteur in China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Winkel voor meer specificaties:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Zoals het aantal patiënten metchronische nierziekte(CNZ) neemt toe, het aantal patiëntenwaarvoor dialyse nodig iszal ook toenemen. De meeste sterfgevallen onder patiënten die een behandeling ondergaandialysezijn als gevolg vanhart-en vaatziektenzoalshartfalen, cerebrovasculaire aandoeningenof een hartinfarct. (,2) Een belangrijke bron vanhart-en vaatziekteis ectopische calcificatie,() een afwijking veroorzaakt door de vorming en afzetting van calciumfosfaatkristallen in zachte weefsels. (4 6) Verschillende factoren zoals ontstekingen. oxidatieve stress en verhogingen van de calcium- (Ca)- en fosfor- (P)-niveaus in het plasma zijn betrokken bij de progressie van vasculaire calcificatie. Van deze factoren wordt hyperfosfatemie het sterkst geassocieerd met vasculaire calcificatie. (7.8) Hyperfosfatemie wordt veroorzaakt door overmatige inname van P in aanwezigheid van een verminderde nierfunctie. Daarom moeten patiënten die dialyse ondergaan de inname van P beperken. (79-12) Er is echter gemeld datvasculaire calcificatievordert al wanneer de dialyse wordt gestart; het is ook waargenomen bij patiënten met chronische nierziekte in een vroeg stadium, waarbij hyperfosfatemie niet evident is. (3) Daarom is het belangrijk om vasculaire calcificatie te voorkomen bij patiënten met chronische nierziekte in een vroeg stadium om de levensprognose te verbeteren.

wat leidt tot een verhoogde instroom van P in vasculaire gladde spiercellen (VSMC). P-instroom wordt uitgevoerd via PiT-1, een transporter op het celmembraanoppervlak van VSMC. PiT- is een lid van de superfamilie van opgeloste stoffen (SLC), die een natriumfosfaattransporter omvat die wordt gecodeerd door SLC20A1.04 PiT- transporteert fosfaat door Na-afhankelijke celmembranen en vervolgens matrixmineralisatie als gevolg van verhoogde p-niveaus. s) Als intracellulair P-niveaus nemen toe, VSMC begint osteogene transcriptiefactoren tot expressie te brengen, zoals runt-gerelateerde transcriptiefactor 2(Runx2)(16). Dit effect wordt gevolgd door verhoogde expressie van osteoblast-specifieke genen, zoals osteopontine en osteocalcine. Verminderde bovendien de expressie van gladde spierspecifieke eiwitten. zoals glad spiereiwit 22-0 (SM22-0), komt voor. Als gevolg hiervan wordt VSMC getransformeerd in osteoblastachtige cellen. (1718)Recente klinische onderzoeken hebben aangetoond dat de bloedspiegels van calcium. eiwitdeeltjes (CPP), die colloïdale calciumfosfaatdeeltjes vertegenwoordigen, nemen toe naarmate de nierfunctie afneemt. (19-21)Bovendien zijn er correlaties met CPP- en P-niveaus in het bloed gerapporteerd.2o2i) Het is mogelijk dat de CpP de progressie van vasculaire calcificatie kan veroorzaken.22-24)

Er is echter vasculaire calcificatie waargenomen bij patiënten met chronische nierziekte in een vroeg stadium met normale P-plasmaspiegels. (13) Bovendien wordt PiT-1-mRNA alomtegenwoordig in alle weefsels tot expressie gebracht. Een ander molecuul kan dus voornamelijk werkzaam zijn op het gebied van vasculaire calcificatie. Er zijn berichten datontstekingbevordert vasculaire calcificatie. Ontstekingsfactoren zoals interleukine (IL)-1B, IL-6 en tumornecrosefactor-alfa (TNF-a) induceerden differentiatie van VSMC in osteoblastachtige cellen (2s26) TNF-a induceert vasculaire calcificatie via de cAMP-route, die een rol speelt bij de differentiatie van osteoblasten.2728) IL-6 reguleert verschillende routes die leiden tot vasculaire calcificatie van VSMC2-31) Verder. IllB, IL-6 en TNF-a zijn ook factoren die geassocieerd zijn met verhoogde vasculaire calcificatie geïnduceerd door hoge p-niveaus.3233) Echter. de huidige gegevens verklaren het mechanisme van vasculair niet volledig

verkalking veroorzaakt door deze factoren. We veronderstelden dat er mogelijk andere P-gerelateerde moleculen zijn, zoals die in de SLC-superfamilie, die betrokken zijn bij vasculaire calcificatie. We concentreerden ons op membraaneiwitten in de SLC-superfamilie en onderzochten andere potentiële kandidaat-P-gerelateerde moleculen dan PiT-1 voor betrokkenheid bij vasculaire calcificatie. Verder onderzochten we de relatie tussen kandidaatmoleculen en vasculaire calcificatie in video en in vivo.

Materialen en methodes

Cel cultuur. Normale menselijke aorta-gladde spiercellen (AoSMC) werden verkregen van Lonza (Basel, Zwitserland). AoSMC werd gekweekt volgens de instructies van de fabrikant. AoSMC werd in stand gehouden in een groeimedium (basismedium van gladde spiercellen aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), epidermale groeifactor, insuline, fibroblastgroeifactor-B en gentamicine/amphotericine-B). Media werden om de dag veranderd. AoSMC werd gekweekt in een bevochtigde 5% CO2-incubator bij 37 graden en gehandhaafd totdat confluentie werd bereikt en vervolgens in experimenten gebruikt.

Verkalkt AoSMC. Verkalking van AoSMC werd geïnduceerd zoals eerder beschreven. 435) AOSMC werd gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium aangevuld met 15% FBS en penicilline-streptomycine en gekweekt met 2,6 mM P gedurende 3, 6, 9, 12 en 14 dagen. De P-concentratie werd aangepast met de P-bufferNaH, PO/Na en HPO. pH 7,2). Andere AoSMC's werden niet gekweekt met 2,6 mM P.

DNA-microarray. Totaal RNA van AoSMC-monsters gekweekt en niet gekweekt met 2,6 mM P werd gebruikt. Totaal RNA 5,0 ug werd geanalyseerd met behulp van een DNA-microarray (Agilent Technologies, Tokyo, Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray werd gebruikt om ongeveer 26,000 genen te onderzoeken. De verhouding werd berekend door het expressieniveau van AoSMC, gekweekt met 2,6 mM gedurende 12 dagen, te delen door het expressieniveau van AoSMC, niet-gekweekt met 2,6 mM P.

DNA-microarray

Totaal RNA van AoSMC-monsters gekweekt en niet gekweekt met 2,6 mM P werd gebruikt. Totaal RNA 5,0 ug werd geanalyseerd met behulp van een DNA-microarray (Agilent Technologies, Tokyo, Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray werd gebruikt om ongeveer 26,000 genen te onderzoeken. De verhouding werd berekend door het expressieniveau op AoSMC gekweekt met 2,6 mM gedurende 12 dagen te delen door het expressieniveau op AoSMC niet-gekweekt met 2,6 mM P. Expressie van SLC37A2 bij vasculaire ontsteking. Om een ​​ontstekingsreactie in AoSMC te induceren, werden de cellen gekweekt met groeimedium totdat ze samenvloeiing bereikten en vervolgens gedurende 24 en 72 jaar behandeld met 1 ugml lipopolysachariden (LPS) (LPS van escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO). 2,6 mM P. Andere AoSMC werden niet gekweekt met real-time polymerasekettingreactie (PCR) analyse. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit AoSMC behandeld met LPS gedurende 24 en 72 uur en cellen die niet met LPS waren behandeld. SYBR groen-gebaseerde kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van gesynthetiseerd cDNA en een geschikte primerset voor elk doelgen met een StepOnePlus real-time PCR-systeem (Applied Biosystems, FosterCity, CA). De primersequenties waren als volgt: menselijk IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' en 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; menselijk SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' en 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- en 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 en SLC37A2 mRNA-expressieniveaus werden berekend na normalisatie met GAPDH. Expressie van SLC37A2 in verkalkt AoSMC. Totaal werd geëxtraheerd uit AoSMC niet gekweekt met 2,6 mM P en AoSMC-cellen gekweekt met 2,6 mM P gedurende 3, 6, 9, 12 en 14 dagen. Real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van het gesynthetiseerde cDNA. De primersequenties waren als volgt: menselijke Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' en 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. De Runx2- en SLC37A2-mRNA-expressieniveaus werden berekend na normalisatie met APPH.

Western-blotting-analyse.

Totaal eiwit werd verzameld uit AoSMC-monsters gekweekt onder dezelfde omstandigheden als gebruikt voor real-time PCR-analyse. Deze monsters werden gelyseerd met behulp van Tris-gebufferde zoutoplossing (pH 75), aangevuld met 5% NP-40 en een cocktail van 1% proteaseremmers. De eiwitconcentratiemonsters werden gemeten met behulp van de BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). en de concentratie werd aangepast door Western blotting, 10 µg eiwit werd gescheiden in een 10% polyacrylamidegel met behulp van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Het membraan werd behandeld met SLC37A2-antilichaam (Novus Biologicals, Centennial, CO) of GAPDH-antilichaam (GeneTex, Irvine, CA) als de primaire antilichamen, geïncubeerd met Rabbit IgG Mierikswortelperoxidase-geconjugeerd antilichaam (R&D Systems, Minneapolis, MN) als het secundaire antilichaam. en gevisualiseerd met behulp van Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Engeland) en luminescente beeldanalysator (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokio, Japan). De band werd gekwantificeerd met behulp van Imagel.

Experimenteel

Alle onderzoeksprotocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Hyogo, School of Human Science and Environment. Twaalf weken oude mannelijke Sprague-Dawley-ratten werden gekocht bij Japan SLC (Shizuoka, Japan). Ratten werden op een 12-lichte, 12-uur donkere cyclus gehouden (09:00-21:00) en kregen vrije toegang tot voedsel en extra zuiver water.

De experimentele diëten omvatten een controle-P-dieet (1.0% P, 0.6Ca, 20% eiwit), een adeninedieet (0.75% adenine , 1.0% P, 0,6% Ca, 2,5% eiwit), een dieet met een laag P-gehalte (LP) (0,2% P,0 0,6% Ca, 10% eiwit) en een dieet met een hoog P (HP)-gehalte (1,0% P, 0,6% Ca, 10% eiwit) gebaseerd op het AIN93-G-dieet (Oosterse Gist, Tokyo, Japan) met caseïne als eiwitbron.3637) Er is gerapporteerd dat een eiwitarm dieet de vasculaire calcificatie bevordert bij ratten met door adenine geïnduceerd nierfalen, daarom werd eiwitrestrictie uitgevoerd.3738) Vóór de groepering werden alle ratten (n=23) kregen een week lang een standaard MF-dieet (Oosterse Gist) om te acclimatiseren. Toen ze 13 weken oud waren, werden ratten verdeeld in 2 groepen: de controlegroep (n=5) en de adenine-geïnduceerde CKD-groep (n=18). De controlegroep kreeg gedurende 6 weken het controle-P-dieet. . De door adenine geïnduceerde CKD-groep ontving het adeninedieet gedurende ongeveer 3 weken en werd vervolgens verder verdeeld in 2 subgroepen: de CKD-LP-groep (n=8) of de CKDHP-groep (n=10). Ratten van de CKD-LP-groep en de CKD-HP-groep kregen respectievelijk het LP-dieet en het HP-dieet gedurende 3 weken. Tijdens de experimentele periode werd de voedselinname dagelijks geregistreerd. Tijdens het adeninedieet werden tussen 10:00 AM en 11:00 AM eenmaal per week bloedmonsters uit de staartader afgenomen tot de tweede week, en daarna eenmaal per twee dagen om de plasmaspiegels te controleren. Tijdens het LP-dieet of HP-dieet werd één keer per week bloed afgenomen. Urinemonsters werden verzameld en het urinevolume werd eenmaal per week geregistreerd. Ratten werden opgeofferd onder verdoving met behulp van isofluraan (Wako Pure Chemical Industries, Osaka Japan) en laparotomieën. Bloedmonsters genomen uit de onderste vena cava en thoraco-abdominale aorta werden verzameld voor analyse.

SLC37A2-expressie op de aorta.

Ongeveer een derde van de verzamelde thoraco-abdominale aorta werd gebruikt om verkalking te visualiseren en immunokleuring uit te voeren. De aorta werd ingebed in paraffine en er werden 4-um secties gesneden. Secties werden gekleurd met behulp van een Von Kossa Method for Calcium Kit (Polysciences, Warrington, PA) volgens de instructies van de fabrikant. immunokleuringsanalyse werd uitgevoerd met seriële secties. De secties werden overnacht bij 4 graden geïncubeerd met SLC37A2-antilichaam en vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur behandeld met Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan). Daarna werden de coupes behandeld met een DAB-substraatkit (Nichirei).

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de rest van de bevroren thoraco-abdominale aorta. Real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van het gesynthetiseerde cDNA. De primersequenties waren als volgt: osteo-pontine van rat, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' en 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' en; rat SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' en 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. De mRNA-expressieniveaus van osteopontine en SLC37A2 werden berekend na normalisatie met GAPDH

Statistische analyse.

Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde + SE. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van de t-test. In door fosfaat geïnduceerde verkalkte AoSMC-experimenten werden verschillen geanalyseerd met behulp van een eenrichtingsvariantieanalyse gevolgd door de methode van Dunnett. In de CKD-modelexperimenten werden verschillen geanalyseerd met behulp van de K ruskal-Wallis-test gevolgd door de Steel-Dwass-methode. Correlatiecoëfficiënten (rs) werden bepaald met behulp van de Spearman's correlatiecoëfficiënt-rangtest. Voor alle testen. tweezijdige p-waarden<0.05 were considered statistically significant.