Spermidine verlicht intra-uteriene hypoxie-geïnduceerde nakomelingen Pasgeboren myocardiale mitochondriale schade bij ratten door oxidatieve stress te remmen en mitochondriale kwaliteitscontrole te reguleren Deel 2

4.4. Effecten van spermadine op myocardiale antioxidatieve activiteit en apoptose bij pasgeboren nakomelingen die zijn blootgesteld aan intra-uteriene hypoxie

Glycoside van cistanche kan ook de activiteit van SOD in hart- en leverweefsels verhogen en het gehalte aan lipofuscine en MDA in elk weefsel aanzienlijk verminderen, waardoor verschillende reactieve zuurstofradicalen (OH-, H₂O₂, enz.) door OH-radicalen. Cistanche-fenylethanoïdeglycosiden hebben een robuust wegvangend vermogen van vrije radicalen, een hoger reducerend vermogen dan vitamine C, verbeteren de activiteit van SOD in spermasuspensie, verminderen het gehalte aan MDA en hebben een zeker beschermend effect op de functie van het spermamembraan. Cistanche-polysacchariden kunnen de activiteit van SOD en GSH-Px in erytrocyten en longweefsels van experimenteel senescente muizen veroorzaakt door D-galactose verbeteren, evenals het gehalte aan MDA en collageen in long en plasma verminderen en het gehalte aan elastine verhogen, hebben een goed wegvangend effect op DPPH, verlengt de tijd van hypoxie bij senescente muizen, verbetert de activiteit van SOD in serum en vertraagt ​​​​de fysiologische degeneratie van de longen bij experimenteel senescente muizen Met cellulaire morfologische degeneratie hebben experimenten aangetoond dat Cistanche het goede antioxiderende vermogen heeft en heeft het potentieel om een ​​medicijn te zijn om huidverouderingsziekten te voorkomen en te behandelen. Tegelijkertijd heeft echinacoside in Cistanche een aanzienlijk vermogen om DPPH-vrije radicalen op te vangen en reactieve zuurstofsoorten op te vangen, door vrije radicalen veroorzaakte collageenafbraak te voorkomen en heeft het ook een goed herstellend effect op anionschade door vrije radicalen van thymine.

Klik op Hoe Cistanche Tubulosa te gebruiken

【Voor meer informatie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

We maten de activiteiten van antioxidante enzymen SOD en CAT in het myocardium door middel van colorimetrie (figuren 4A en B). Er werd vastgesteld dat de activiteiten van SOD en CAT in de IUH-groep significant lager waren dan die in de controlegroep (P < 0.05); Vergeleken met de IUH-groep namen de activiteiten van SOD en CAT in de SPD-groep significant toe (P < 0.05), en DFMO heft het effect van SPD op (P < 0. 05). Vervolgens evalueerden we celapoptose door TUNEL-positieve kernen te detecteren (Figuur 4CandD) en de expressie van pro-apoptose-eiwit BAX en anti-apoptose BCl-2 (Figuur 4E en F). We merkten dat het aantal TUNEL-positieve cardiomyocyten en de BAX/BCL2-eiwitexpressieverhouding substantieel hoger waren in de IUH-groep dan die in de controlegroep (P < 0,05). Daarentegen was de verhouding van TUNEL-positieve cellen en de BAX/BCL2-eiwitexpressieverhouding lager in het myocardium van met SPD behandelde ratten dan in de IUH-groep (P <0,05). DFMO elimineerde het effect van SPD (P <0,05). Kortom, SPD die in utero wordt gegeven, kan de door IUH geïnduceerde afname van antioxiderende enzymactiviteiten en de toename van celapoptose in de harten van nakomelingen omkeren.

4.5. Effecten van spermadine op de productie van reactieve zuurstofsoorten, mitochondriaal membraanpotentieel en mitofagie in cardiomyocyten blootgesteld aan hypoxie

Mitochondriale disfunctie manifesteert zich voornamelijk als een toename van de ROS-productie, een afname van de ATP-synthese en de accumulatie van disfunctionele mitochondriën. Mitochondriale membraanpotentiaal (∆Ψm) is de elektrochemische protongradiënt (H plus concentratiegradiënt en transmembraanpotentiaalverschil) over de mitochondriale binnenmembraan, die wordt gevormd tijdens de elektronenoverdracht van de mitochondriale oxidatieve ademhalingsketen, waarin een klein aantal ROS's zijn geproduceerd. Dienovereenkomstig zijn het ROS-niveau en de ∆Ψm-veranderingen de belangrijkste indicatoren van de mitochondriale functie. Overmatige ROS-productie resulteert in de accumulatie van disfunctionele mitochondriën; de beschadigde mitochondriën worden voornamelijk verwijderd door mitofagie. Om te onderzoeken of exogene SPD de integriteit van de mitochondriale functie in cardiomyocyten onder hypoxie-omstandigheden zou kunnen beïnvloeden, hebben we eerst de ROS-niveaus onderzocht met behulp van een DHE-fluorescentiesonde (Figuur 5A). We zagen dat de ROS-productie toenam nadat cardiomyocyten gedurende 24 uur waren blootgesteld aan hypoxie (P < 0.05) en dat SPD de door hypoxie geïnduceerde ROS-productie remde (P < 0 .05); DFMO maakte echter een einde aan de afname van ROS-productie gemedieerd door SPD wanneer DFMO werd toegediend aan cardiomyocyten die werden behandeld met SPD (P < 0.05) (Afbeelding 5C). Bovendien werd ∆Ψm gedetecteerd met behulp van TMRE fluorescerende sonde (Figuur 5B). Hoe sterker de rode fluorescentie-intensiteit, hoe hoger het mitochondriale potentieel (P < 0.05). We merkten dat de intensiteit van rode fluorescentie significant lager was in de IUH-groep dan in de controlegroep (P < 0.05). Vergeleken met de IUH-groep was de rode fluorescentie-intensiteit hoger in de SPD-behandeling (P < 0,05) en DFMO schafte de effecten van SPD opnieuw af (P < 0,05) (Figuur 5D). Vervolgens schatten we de colokalisatie van de mitochondriën (gelabeld met MitoTracker groen) met de lysosomen (gelabeld door Lyso-Tracker rood), waardoor we de autofagische afbraak van mitochondriën konden meten (Figuur 5E). Zoals aangegeven in figuur 5F, verminderde hypoxie, vergeleken met de controle, de colokalisatie van Mito-Tracker Green en Lyso-Tracker Red in cardiomyocyten (P < 0,05). In vergelijking met de hypoxiegroep was het percentage gecolokaliseerde mitochondriën en lysosomen echter hoger in de SPD-behandelingsgroep (P < 0,05), en DFMO schafte het effect van SPD af (P < 0,05). Deze resultaten suggereren dat hypoxie de ROS-productie verhoogt en ∆Ψm en mitofagie verlaagt; SPD kan door hypoxie veroorzaakte mitochondriale schade verlichten door mitofagie te stimuleren en oxidatieve stress te remmen.

4.6. Effecten van SPD op het MQC-systeem van het myocard bij pasgeboren nakomelingen die zijn blootgesteld aan IUH

Mitochondriale kwaliteitscontrole (MQC), inclusief de processen van mitochondriale autofagie, mitochondriale biosynthese en mitochondriale fusie en kernsplijting, is van cruciaal belang voor het handhaven van de normale morfologie, kwantiteit en functie van mitochondriën en het waarborgen van de normale functie en het metabolisme van cellen. Mitofagie reguleert MQC en bemiddelt uitgebreide autofagische afbraak van mitochondriën als reactie op pad- en fysiologische verandering. We evalueerden eerst mitofagie door de vorming van mitofagosoom met TEM te observeren (Figuur 6A - C). Volgens de resultaten waren sommige abnormale structuren of fragmentatie-mitochondriën ingesloten in een autofagisch membraan met dubbel membraan, dat mitofagosomen waren, en gaven aan dat mitofagie actief was in de controlegroep. Het aantal mitofagosomen nam echter sterk af in het myocardium van de IUH-groep. Interessant genoeg vertoonde het myocardium van de SDP-groep bijna identieke mitofagie-fenotypes als die van de controlegroep, terwijl DFMO de door SPD veroorzaakte effecten teniet deed. Mitochondria zijn zeer dynamische organellen, die constante splijtings- en fusiegebeurtenissen ondergaan die verband houden met hun functie. Vervolgens onderzochten we mitochondriale fragmentatie met behulp van TEM (Figuur 6A). We ontdekten dat het aantal kleine en fragmentarische mitochondria significant toenam met IUH, in vergelijking met de controle (P < 0.05), wat aangeeft dat de mitochondriale splijting algemeen was toegenomen. Deze wijziging werd beperkt door de SPD-behandeling en DFMO schafte ook de rol van SPD opnieuw af (Figuur 6D). Verder werden DRP1 en MFN2 (regulerende eiwitten van mitochondriale dynamiek) gedetecteerd (Figuur 6E - G). MFN2 nam significant af, terwijl DRP1 toenam en werd waargenomen in de IUH-groep in vergelijking met de controlegroep (P < 0.05). Terwijl DRP1 naar beneden werd gereguleerd en MFN2 werd opgereguleerd met de behandeling van exogene SPD (P < 0.05), schafte DFMO de door SPD veroorzaakte effecten af. Mitochondriale biosynthese coördineert met mitofagie om beschadigde of overtollige mitochondriën te verwijderen, nieuwe mitochondriën te genereren en de homeostase van MQC onder stressomstandigheden te behouden. Ten slotte evalueerden we de expressie van mitochondriale biosynthese-gerelateerde eiwitten, waaronder SIRT-1, PGC-1, NRF-2 en TFAM, door de immunoblot-analyse (Figuur 6H - L). Vergeleken met de controlegroep nam de expressie van SIRT-1, PGC-1, NRF-2 en TFAM significant af in het myocardium van de IHU-groep (P < 0,05). Vergeleken met de IUH-groep namen de eiwitexpressies van SIRT-1, PGC-1 , NRF-2 en TFAM in de SPD-groep significant toe (P < 0,05). DFMO schafte het effect van SPD af (P < 0,05). Samenvattend geven deze resultaten aan dat IUH leidt tot MQC-disfunctie in het myocardium van één dag oude nakomelingen en dat de SPD-behandeling de onbalans van het MQC-systeem aanzienlijk remt bij neonatale nakomelingen die zijn blootgesteld aan IUH.

5. Discussie

Hartziekten vormen wereldwijd een grote uitdaging voor de gezondheid. Het is aangetoond dat chronische foetale hypoxie een foetale oorzaak van hartdisfunctie kan veroorzaken en een verhoogd risico op hartaandoeningen bij de volwassen nakomelingen kan programmeren. Het hart heeft een hoge stofwisselingssnelheid en zijn afhankelijkheid van de mitochondriale functie voor energieproductie is van cruciaal belang voor een normale hartfunctie. Het effect van IUH op de cardiale mitochondriale functie en het bijbehorende mechanisme en de focus van preventieve strategie voor cardiobescherming op mitochondriën bij pasgeboren nakomelingen zijn echter nog onbekend. In de huidige studie ontdekten we dat eendagsnakomelingen blootgesteld aan IUH significante afwijkingen vertonen in groei en ontwikkeling, de rijping van cardiomyocyten, vooral in de myocardiale mitochondriale structuur en functie, en exogene SPD-supplementen in utero kunnen deze door IUH veroorzaakte verlichting verlichten. veranderen door myocardiale oxidatieve stress te remmen en apoptose te verminderen. Belangrijk is dat we hebben opgemerkt dat prenatale SPD-behandeling de afwijkingen van mitofagie en biogenese en mitochondriale fragmentatie in het myocardium van pasgeboren ratten geïnduceerd door IUH aanzienlijk kan omkeren. Voor zover wij weten, was dit onderzoek het eerste rapport over het beschermende effect van SPD op IUH-geïnduceerde hartbeschadiging van pasgeboren nakomelingen door het MQC-mechanisme te reguleren en vervolgens de mitochondriale functie te verbeteren.

Er is voldoende bewijs dat intra-uteriene groeivertraging het ontwikkelingstraject van foetale systemen verstoort, wat later in het leven de hartfunctie kan schaden (5, 7, 37). In onze studie veroorzaakte IUH groeivertraging en hartbeschadiging bij pasgeboren ratten, aangezien de eendaagse pasgeboren ratten die werden blootgesteld aan IUH een significante afname van BW en HW en een toename van de HW / BW-verhouding vertoonden. Bovendien was de rangschikking van de myocardvezels verstoord, waren de myofilamenten gebroken, werd infiltratie van ontstekingscellen tussen de myofilamenten opgemerkt en nam de afzetting van myocardiaal collageen toe. Deze bevindingen komen overeen met bevindingen gerapporteerd door Ducsay et al. (2) en Thompson et al. (7). In verschillende diermodellen vertonen foetale harten die zijn blootgesteld aan chronische hypoxie een verminderde rijping en proliferatie van cardiomyocyten en een verminderde afgifte van cardiomyocyten (38, 39). Evenzo toonde ons onderzoek ook aan dat het aandeel binucleaire cardiomyocyten toenam en de expressie van Ki67 afnam in de IUH-groep. Het tijdstip waarop cardiomyocyten bi/meerkernig worden, valt samen met het tijdstip waarop zoogdieren hun regeneratieve potentieel verliezen (40). Foetale hartrijping is belangrijk voor de gezondheid van het nageslacht. Dienovereenkomstig zorgt IUH ervoor dat cardiomyocyten zich van tevoren uit de celcyclus terugtrekken, en de rijpingsstoornis van cardiomyocyten leidt tot verminderde plasticiteit van postnatale hartgroei.

Onnodig op te merken dat mitochondriën de belangrijkste cellulaire organellen zijn die betrokken zijn bij de productie van ROS; disfunctionele mitochondriën worden niet alleen geproduceerd als reactie op verminderde ATP-productie, maar ook op verhoogde oxidatieve stress en apoptose (41). In deze studie verminderde IUH significant de activiteit van antioxidatieve enzymen SOD en CAT, verminderde mitochondriale ademhalingsfunctie en ATP-niveaus, verhoogde de expressie van BAX / BCL2 en verminderde de mitochondriale structuur in het myocardium van eendagsgeboren nakomelingenratten. Deze bevindingen worden ondersteund door andere onderzoekers (11), die documenteerden dat blootstelling aan chronische hypoxie van de moeder tijdens de zwangerschap de activiteit van het mitochondriale complex IV zou kunnen verminderen en apoptose zou kunnen veroorzaken in de harten van foetale ratten op korte termijn. We voerden aan dat mitochondriaal compromis de oxidatieve stress en energiefalen tijdens de ontwikkeling van de foetus zou kunnen ondersteunen, met als hoogtepunt perinatale hartbeschadiging. Dit kan de belangrijkste reden zijn voor een verhoogd cardiovasculair risico bij nakomelingen van zwangerschappen gecompliceerd door chronische foetale hypoxie. Dienovereenkomstig is het implementeerbaar om mitochondriaal te nemen als het doelwit van therapeutische interventie om de hartfunctie bij het nageslacht te beschermen. Aljunaidy et al. rapporteerde dat maternale behandeling met mitochondriale antioxidant MitoQ placentale oxidatieve stress voorkwam, de groei van de foetus redde en de hartfunctie verbeterde bij nakomelingen die werden blootgesteld aan IUH (42).

Spermidine is een polyamine met verschillende biologische functies. Zoals we al zeiden, kan SPD de door H2O2- geïnduceerde ROS-accumulatie remmen en de afname van het mitochondriaal membraanpotentieel (MMP) en ATP-niveaus in de cardiomyocyten en H9C2-cellen van gekweekte neonatale ratten voorkomen. Bovendien kan SPD de mitochondriale biogenese bevorderen en de mitochondriale functie in het ouder wordende hart verbeteren (43). Polyamines spermine en spermidine kunnen het dynamische mitochondriale proteoom beïnvloeden, waardoor leeftijdsgebonden veranderingen in hartfuncties en cardiale veroudering worden voorkomen (36). Andere studies hebben ook aangetoond dat SPD-aanvulling de veroudering van het hart vertraagt ​​door mitofagie te verbeteren en mitochondriale ademhaling bij muizen te bevorderen (44). ODC is een sleutelenzym van de polyaminesynthese en er is gemeld dat de in vivo knockdown van ODC of de toepassing van DFMO, een onomkeerbare remmer van ODC, resulteert in een verstoorde ontwikkeling van de conceptus en foetale groeivertraging vanwege de onvoldoende beschikbaarheid van polyaminen (45, 46). Onze huidige studie geeft aan dat behandeling met 5 mg / kg / dag SPD bij ratten die zijn blootgesteld aan IUH groeivertraging en de verandering van de cardiale morfologische structuur en rijping bij pasgeboren nakomelingen voorkomt. Bovendien werden IUH-geïnduceerde cardiale oxidatieve stressverbetering, toename van apoptose en mitochondriale respiratoire achteruitgang bij neonatale nakomelingen ook voorkomen door SPD, terwijl DFMO die aan de moeder werd gegeven de SPD-gemedieerde bescherming voor het neonatale hart afschafte. Het is goed gedocumenteerd dat polyaminen betrokken zijn bij placentaire angiogenese en embryogenese, evenals bij de groei en ontwikkeling van embryo's en foetussen (47). Zhu et al. rapporteerden dat polyaminespiegels lager waren in het plasma van de navelstrengader van intra-uteriene groeirestrictie (IUGR) varkensfoetussen, en aanvullende SPD voor de moeder kan IUGR voorkomen (48). Spermidine is een verbinding met redelijke veiligheid en lagere toxiciteit (49). Het toenemende aantal preklinische en klinische onderzoeken heeft aangetoond dat SPD via de voeding gezondheidseffecten heeft, zoals anti-veroudering, cardiovasculaire bescherming, neuromodulatie en ontstekingsremmende functies, zoals intraperitoneale injectie van SPD (50 mg/kg) bij muizen beschermt tegen collageen-geïnduceerde artritis door de polarisatie van M1-macrofagen in synoviaal weefsel te remmen (50). Suppletie met 10 mg/kg/d SPD keerde leeftijdsgebonden hartverslechtering bij ratten om (36). Wat nog belangrijker is, de moeder was een interventie met 5 mg / kg / dag SPD tijdens de late zwangerschap om IUH-geïnduceerde cognitieve en neurale functieafname te verbeteren (51) en oxidatieve stressschade aan het hart bij nakomelingen van ratten (32). Dienovereenkomstig gebruikten we dezelfde dosis SPD (5 mg / kg / d) voor de zwangere rat die werd blootgesteld aan IUH als in onze vorige studie. We vermoedden dat SPD-suppletie van de moeder tijdens hypoxische zwangerschap SPD-niveaus in de foetale bloedsomloop zou kunnen verhogen, wat mogelijk verband houdt met bescherming tegen oxidatieve stress resulterend in de placenta, die de mitochondriën in het zich ontwikkelende hart zal beschermen tegen de programmering door IUH, de werking van SPD kan worden bereikt door zijn krachtige antioxidatieve, anti-apoptose- en proliferatiebevorderende mechanisme.

Mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen zijn essentieel voor het handhaven van de normale morfologie, het aantal en de functie van mitochondriën en het waarborgen van de normale functie en het metabolisme van cellen (16). Recent bewijs heeft aangetoond dat MQC-mechanismen een beslissende rol spelen bij de rijping van mitochondriën in het perinatale myocard en de ontwikkeling van het hart (14). Gong et al. rapporteerde voor het eerst dat de onrijpe foetaalachtige mitochondriën direct worden afgebroken door Parkine-gemedieerde mitofagie tijdens de vroege postnatale periode (19). Ondertussen neemt de mitochondriale biogenese dramatisch toe (52) en worden de mitochondriale fusie- en splijtingsfactoren transcriptioneel opgereguleerd in het hart na de geboorte (20, 21). Er is echter veel minder bekend over het effect van IUH op MCQ in het myocard van neonatale nakomelingen. In deze studie hebben we voor het eerst waargenomen dat het aantal mitofagosomen significant afnam in het myocardium van de IUH-groep, wat aangeeft dat IUH de myocardiale mitofagie van pasgeboren nakomelingen van ratten aantastte. Vervolgens zagen we een significant verminderde expressie van PGC-1 (een belangrijke regulator van de mitochondriale biogenese) en de expressie van de stroomopwaartse en stroomafwaartse signaalmoleculen, waaronder SIRT-1, TFAM en NRF{{10} } in het myocardium van de IUH-groep. Bovendien ontdekten we dat de IUH-blootstelling kleinere of gefragmenteerde mitochondriën maakte en dat de expressie van DRP1 toenam; de expressie van MFN2 nam echter af in het myocardium van pasgeboren ratten, wat suggereert dat mitochondriale splijting werd opgereguleerd en fusie werd gedownreguleerd. Deze bevindingen weerspiegelden de oorzaak-gevolg-relatie tussen de onbalans van het MQC-mechanisme en IUH-geïnduceerde myocardiumschade bij pasgeboren nakomelingen. Deze complexe MQC-processen werken samen om disfunctionele mitochondriën op een specifieke en gerichte manier te elimineren en de biogenese van nieuwe organellen te coördineren, wat essentieel is voor cardiovasculaire homeostase. Veel intracellulaire en extracellulaire signalen kunnen de MQC-gebeurtenissen reguleren, waaronder oxidatieve stress, mogelijke membraaninstorting, apoptose en andere. Hier kan de onbalans van mitochondriale MQC worden toegeschreven aan verhoogde oxidatieve stress en verhoogde apoptose in het hart van nakomelingen van ratten die zijn blootgesteld aan IUH. Daarom is het essentieel om een ​​geschikt MQC-mechanisme te behouden om te zorgen voor een gezond mitochondriaal netwerk in het hart van pasgeboren nakomelingen die zijn blootgesteld aan IUH.

Aangezien SPD-niveaus in de placenta sterk geassocieerd zijn met foetale groeirestrictie (53), kan SPD MQC reguleren in een ander diermodel. SPD is bijvoorbeeld een krachtige en specifieke inductor van autofagie voor het verlengen van de levensduur, wat het verouderingsproces van verschillende weefsels kan beschermen, waaronder het hart, de hersenen en de skeletspieren (44, 54, 55). Spermidine kan de veroudering van het hart verlichten door de mitochondriale biogenese te verbeteren (43). In deze studie pasten we SPD toe op moedermuizen en ontdekten dat SPD de onbalans van myocard MQC kon normaliseren bij nakomelingen die werden blootgesteld aan IUH. Maternale behandeling met ODC-remmer DFMO maakte echter een einde aan de effecten van SPD, wat aangeeft dat de SPD-interventie de abnormale MQC in het myocardium van eendaagse nakomelingenratten die aan IUH waren blootgesteld, kon voorkomen. Kortom, de uitstekende werking van MQC in het myocardium van pasgeboren nakomelingen zou de mitochondriale structuur, functie en rijping kunnen verbeteren, waardoor de transformatie van intra-uteriene glycolysecapaciteit naar postnatale vetzuuroxidatie-energievoorziening kan worden gerealiseerd en de toenemende hartbelasting na de geboorte kan worden opgevangen. . Bovendien suggereert ons experiment met cardiomyocyten dat SPD de toename van door hypoxie geïnduceerde ROS-productie, de afname van ∆Ψm en de verminderde autofagische afbraak van mitochondriën kan remmen. We concludeerden dat de gunstige effecten van SPD zouden kunnen bijdragen aan de verhoogde SPD-niveaus in de placenta en de bloedsomloop door moederlijke SPD toe te passen, waardoor myocardiale mitochondriale nakomelingen worden beschermd tegen ontwikkelingsprogrammering door IUH.

5.1. Conclusie

De huidige studie benadrukt dat SPD-therapie in utero het myocardium van één dag - het hart van het nageslacht - kan beschermen tegen de nadelige effecten van prenatale hypoxie. Deze postnatale veranderingen veroorzaakt door SPD kunnen worden bereikt door antioxidatie en anti-apoptose en door MQC-routes te reguleren, waardoor de mitochondriale ontwikkeling die is geprogrammeerd in het hart dat is blootgesteld aan IUH wordt verminderd. Er zijn enkele beperkingen aan deze studie. We hebben geen farmacokinetische experimenten uitgevoerd op SPD en daarom kunnen we de exacte SPD-niveaus in de foetale circulatie niet bepalen wanneer de moeder SPD kreeg toegediend. In onze toekomstige studies zullen we de effectieve bloedconcentratie van SPD verder onderzoeken met behulp van de placenta van de foetus. De huidige bevindingen bieden een nieuw raamwerk voor toekomstige studies om de rollen van SPD te definiëren bij het voorkomen van de myocardiale mitochondriën van IUH neonatale nakomelingen.

【Voor meer informatie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】