Beschermende effecten van alfa-liponzuur tegen door 5-fluorouracil geïnduceerde gastro-intestinale mucositis bij ratten deel 1
Jul 04, 2023
Abstract: Alfa-liponzuur (ALA) wordt veel gebruikt in multivitamineformules en antiverouderingsproducten. Het doel van deze studie was het onderzoeken van de potentiële beschermende voordelen van ALA op 5-fluorouracil (5-FU)-geïnduceerde gastro-intestinale mucositis bij Wistar albinoratten. Weefsels uit de maag, dunne darm en dikke darm werden uitgesneden en bloedsera werden verkregen om biochemische indices te identificeren, zoals TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 en TIMP-1. Er werd ook een histopathologisch onderzoek uitgevoerd. De resultaten onthulden mucositis-verhoogde TNF-, IL-1-, MDA-, MMP-1-, -2-, -8- en TIMP-1-waarden in zowel weefsels als sera en deze waarden daalden dramatisch na ALA-behandeling. Verminderde SOD- en GPx-activiteiten in mucositisgroepen werden omgekeerd in met ALA behandelde groepen. De schade veroorzaakt door mucositis in de maag en dunne darm nam af in de met ALA behandelde groep, volgens histopathologische evaluatie. Bijgevolg kan de implementatie van ALA-suppletie in 5-FU-therapie fungeren als een beschermende interventie voor kankerpatiënten met gastro-intestinale mucositis. In het licht van de bevindingen kan ALA, een van voedsel afgeleide antioxidant met pleiotrope eigenschappen, een effectieve behandeling zijn voor 5-FU-geïnduceerde gastro-intestinale mucositis en oxidatieve stress, ontsteking en weefselbeschadiging voorkomen bij kankerpatiënten die {{ 24}}FU-therapie.
Glycoside van cistanche kan ook de activiteit van SOD in hart- en leverweefsels verhogen en het gehalte aan lipofuscine en MDA in elk weefsel aanzienlijk verminderen, waardoor verschillende reactieve zuurstofradicalen (OH-, H₂O₂, enz.) door OH-radicalen. Cistanche-fenylethanoïdeglycosiden hebben een robuust wegvangend vermogen van vrije radicalen, een hoger reducerend vermogen dan vitamine C, verbeteren de activiteit van SOD in spermasuspensie, verminderen het gehalte aan MDA en hebben een zeker beschermend effect op de functie van het spermamembraan. Cistanche-polysacchariden kunnen de activiteit van SOD en GSH-Px in erytrocyten en longweefsels van experimenteel senescente muizen veroorzaakt door D-galactose verbeteren, evenals het gehalte aan MDA en collageen in long en plasma verminderen en het gehalte aan elastine verhogen, hebben een goed wegvangend effect op DPPH, verlengt de tijd van hypoxie bij senescente muizen, verbetert de activiteit van SOD in serum en vertraagt de fysiologische degeneratie van de longen bij experimenteel senescente muizen Met cellulaire morfologische degeneratie hebben experimenten aangetoond dat Cistanche het goede antioxiderende vermogen heeft en heeft het potentieel om een medicijn te zijn om huidverouderingsziekten te voorkomen en te behandelen. Tegelijkertijd heeft echinacoside in Cistanche een aanzienlijk vermogen om DPPH-vrije radicalen op te vangen en reactieve zuurstofsoorten op te vangen, door vrije radicalen veroorzaakte collageenafbraak te voorkomen en heeft het ook een goed herstellend effect op anionschade door vrije radicalen van thymine.
Klik op Cistanche Tubulosa
【Voor meer informatie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
1. Inleiding
Alfa-liponzuur (ALA) is aanwezig in een breed scala aan voedingsmiddelen, waaronder groenten (spinazie, broccoli, tomaten) en vlees (vooral ingewanden), evenals verschillende voedingssupplementen [1,2]. ALA heeft tal van antioxiderende effecten, waaronder de activering van endogene antioxiderende mechanismen en de chelatie van metaalionen zoals ijzer, zink en koper [3,4]. Als organozwavelmolecuul kan ALA reactieve zuurstofspecies (ROS) wegvangen en de activiteit van weefselantioxidant-enzymen stimuleren, zoals glutathionperoxidase (GPx) en superoxidedismutase (SOD) [5-7]. Vanwege zijn antioxiderende eigenschappen is gevonden dat ALA ALA-afhankelijke celdood vermindert bij longkanker [8], borstkanker [9] en darmkanker [10]. Bovendien heeft eerder onderzoek aangetoond dat ALA ontstekingsremmende eigenschappen bezit [11-16]. ALA werkt om ontstekingen te verminderen door de expressie van inflammatoire cytokines te moduleren, zoals tumornecrosefactor-alfa (TNF-) en interleukine-1 (IL-1) [17,18]. De farmacologische voordelen van ALA zijn bewezen in een breed scala van medicinaal gerelateerde gebieden, waaronder cardiovasculaire, neuroprotectieve, cognitieve en anti-verouderingsmodellen [19].
Kanker is de belangrijkste doodsoorzaak in elk land en een grote belemmering voor een lang leven [20]. De bijwerkingen van chemotherapeutica zijn een van de belangrijkste slopende factoren in de strijd tegen kanker, en mucositis is een van de meest voorkomende ziekten bij kankerpatiënten [21]. Mucositis is een pathologische inflammatoire aandoening die wordt gekenmerkt door ulceratie en ontsteking van het slijmvlies van het maagdarmstelsel [22]. Mucositis verhoogt het gebruik van opioïde analgetica vanwege pijn en versnelt de overgang naar totale parenterale voeding vanwege voedingsproblemen [23]. Mucositis en aan mucositis gerelateerde problemen verminderen de kwaliteit van leven van de patiënt, terwijl de ontwikkeling van levensbedreigende aandoeningen en negatieve reacties op therapie een reden tot zorg zijn vanwege een slechte laesiebehandeling [24].
Het meest gebruikte chemotherapeutische geneesmiddel bij gastro-intestinale maligniteiten is de pyrimidine-analoog 5-fluorouracil (5-FU). 5-FU oefent zijn kankerbestrijdende effecten uit door thymidylaatsynthase (TS) te remmen en zijn metabolieten te integreren in RNA en DNA [25]. Dit middel veroorzaakt echter gastro-intestinale mucositis, een ernstige slopende bijwerking [26]. Met name de afbraak van de oxidant-antioxidant balans, een stijging van pro-inflammatoire cytokine niveaus en proteolytische enzymactiviteit spelen een belangrijke rol bij het ontstaan van deze bijwerkingen. Hoewel antioxidant- en ontstekingsremmende medicijnen zijn gebruikt in een poging om dit probleem aan te pakken, moet er nog een bijzonder robuuste therapeutische methode worden geïdentificeerd [27,28].
Tot nu toe hebben verschillende onderzoeken het gebruik van 5-FU en ALA samen bij verschillende vormen van kanker gerapporteerd; deze omvatten cervicale en colorectale tumoren [29,30]. Bovendien zouden ondersteunende medicijnen die kunnen worden opgenomen in behandelingsprocedures om te voorkomen dat kankerpatiënten de bijwerkingen van gastro-intestinale mucositis veroorzaakt door 5-FU, voordelig zijn. Het doel van deze studie was dus om de biologische effecten te bepalen van het gebruik van ALA bij ratten met een mucositismodel gemaakt door 5-FU, naast het onderzoeken van het mogelijke gebruik ervan als een kandidaat-agent in behandelingsprotocollen.
2. materialen en methoden
2.1. Dieren
De dieren zijn afkomstig van de Animal Experiments Units van de Near East University. De ratten (Wistar albino, beide geslachten) werden vanaf het begin onder een 12:12 uur donker/licht-cyclus gehouden bij een kamertemperatuur van 22 ± 2 ◦C in een vochtigheidsgecontroleerde faciliteit (50 ± 5 procent). Het voeren was ad libitum zonder enige beperking tot hun standaard rattenvoer en drinkwater. Ratten werden gehuisvest in een kooi van plexiglas (4 ratten per kooi met afmetingen van 60 x 40 x 40 cm). Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de ethische commissie voor lokale dierexperimenten van de Near East University (goedkeuring nr. 2019/01 op 17 januari 2019 en 2020/11 op 27 november 2020), en de ethische richtlijnen die worden vermeld in de Verklaring van Helsinki uit 1964 en de latere wijzigingen daarvan werden gevolgd.
Tweeëndertig Wistar Albino-ratten van beide geslachten met een gewicht van 200-250 g werden ingedeeld in vier groepen van elk acht ratten (n=8): controle-, ALA-, Mucositis- en Mucositis plus ALA-groepen. De controlegroep kreeg gedurende een week slechts één keer per dag intraperitoneale (ip) zoutoplossing (SF). De ALA-groep kreeg vanaf dag 1 alleen ALA in een dosis van 100 mg/kg ip eenmaal daags gedurende één week [31,32]. De Mucositis-groep werd behandeld met SF (ip) op dag 1 en 400 mg/kg 5-FU ip vanaf dag 2 tot het einde van het experiment [33]. De Mucositis plus ALA-groep kreeg 100 mg/kg ip ALA op dag 1 en 400 mg/kg ip 5-FU op dag 2. Daarna werd de toediening van 100 mg/kg/dag ip ALA voortgezet tot het einde van het experiment . De dieren werden gedurende een week gevolgd zonder dat er gedurende die tijd sterfte werd ervaren. De dieren in alle groepen werden aan het einde van de onderzoeksperiode geëuthanaseerd door toediening van een combinatie van een overdosis ketamine/xylazine. Laboratoriumtesten werden uitgevoerd in het Diagnostisch Laboratorium en Histopathologisch Laboratorium van het Dierenziekenhuis, Near East University.
2.2. Verzameling van bloed- en weefselmonsters
Er werden bloedmonsters genomen en in serumseparatorbuizen naar het laboratorium gestuurd. De serummonsters werden gedurende 10 minuten gescheiden bij 2000 x g en bewaard bij -80 ◦C tot verdere analyse. Om extra bloed te verwijderen, werden maag-, dunne darm- en dikke darmweefsels verzameld en gespoeld met fosfaatbufferoplossing (pH=7.4). Vervolgens ondergingen ze, nadat ze aan het laboratorium waren afgeleverd, een homogenisatieprocedure. Weefselhomogenisatie werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant met behulp van RIPA-buffer (art.nr. 10010263, batchnr. 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, VS) en Dounce tissue grinder set (D8938, lot. 3110, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, VS) op ijs. Na homogenisatie werden de monsters gecentrifugeerd bij 1600 x g gedurende 10 minuten bij plus 4 ◦C. De Bradford-eiwitbepalingstechniek werd gebruikt om eiwitniveaus in weefselmonsters te kwantificeren, en supernatanten werden vervolgens ingevroren bij -80 ◦C voor verder onderzoek.
2.3. Metingen van biochemische indexen
Activiteiten van alaninetransaminase (ALT), aspartaattransaminase (AST), alkalische fosfatase (ALP), lactaatdehydrogenase (LDH), lipase (LIP), amylase (AMY), creatinine, bloedureumstikstof (BUN), totaal eiwit (TP) en albumineniveaus werden gemeten als biochemische indices in serummonsters met behulp van een geautomatiseerde BS-240 VET Clinical Chemistry Analyzer (Mindray, Shenzhen, China).
2.4. Meting van cytokines in sera en weefsels
TNF- en IL-1-concentraties in sera en weefselmonsters werden gemeten met behulp van in de handel verkrijgbare rat-specifieke enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) assaykits (ELR-TNF- en ELR-IL1 -, RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, VS) volgens de instructies van de fabrikant.
2.5. Meting van matrixmetalloproteïnasen (MMP's) en weefselremmers van metalloproteïnase-1 (TIMP-1) in sera en weefsels
MMP's en TIMP-1, die betrokken zijn bij een verscheidenheid aan biologische processen, zoals kanker en ontsteking, werden gemeten in zowel weefselhomogenaten als sera volgens de instructies van de fabrikant en aanbevelingen van in de handel verkrijgbare ratspecifieke ELISA-assays (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Wuhan, China; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, VS). Serumconcentraties van de MMP's en TIMP-1 werden uitgedrukt als pg/ml, terwijl de weefselconcentraties werden uitgedrukt als pg/mg eiwit.
2.6. Meting van malondialdehyde (MDA), GPx en SOD in weefsels
MDA-niveaus in weefsels werden geëvalueerd met behulp van in de handel verkrijgbare assaykits om de lipideperoxidatietoestand te bepalen (TBARS Assay Kit, artikelnr. 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, VS). Het meetprincipe is gebaseerd op de reactie met thiobarbituurzuur (TBA) in kokend water gedurende 60 minuten in zuur milieu en de meting van de absorptie van het reactiemengsel bij 532 nm (Ohkawa et al., 1979). Een VersaMax Tunable Microplate Reader werd gebruikt om de absorptie te meten (Molecular Devices, San Jose, CA, VS). MDA-concentraties in weefsels werden uitgedrukt als nmol MDA/mg eiwit.
In weefsels werden GPx- en SOD-activiteit geëvalueerd met gebruiksklare assaykits. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, VK) met behulp van een geautomatiseerde BS{4}} VET Clinical Chemistry Analyzer (Mindray, Shenzhen, China). De hoeveelheden GPx en SOD in de weefselmonsters (maag, dunne darm en dikke darm) werden uitgedrukt als U/mg eiwit.
2.7. Histopathologische evaluatie
De weefsels van de maag, dunne darm en dikke darm die onmiddellijk na de experimentele periode werden verkregen, werden gedurende 24 uur bij kamertemperatuur gefixeerd in 10 procent (v/v) neutrale formaline. Na fixatie werden de weefsels op een weefselvolgapparaat geplaatst, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Duitsland). Weefsels die uit het weefselvolgapparaat waren gehaald, werden vervolgens ingebed in paraffine. Secties van 5-µm dikte werden uit de weefsels gesneden met behulp van een microtoom Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Duitsland) en routinematige hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring werd uitgevoerd. Secties werden histomorfologisch onderzocht met een Leica DM500-lichtmicroscoop gekoppeld aan het Leica Microsystem Framework geïntegreerde digitale beeldanalysesysteem (Leica Application Suite versie 3.0 Series 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Duitsland).
2.8. Statistische analyse
GraphPad Prism-software werd gebruikt voor statistische analyse (versie 7.04, GraphPad Software, San Diego, CA, VS). De gegevens werden allemaal uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (X ± SD). Een variantieanalyse (ANOVA)-test werd gebruikt om gegevensgroepen te vergelijken, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Bovendien werd de Kruskal-Wallis-test gebruikt om histomorfologische scores tussen groepen te vergelijken. Een verschil van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
3. Resultaten
3.1. ALA heeft een positieve invloed op biochemische indices
Tabel 1 geeft de serumenzymactiviteit en metabolietconcentraties weer. In vergelijking met de controlegroep had de mucositisgroep aanzienlijk hogere niveaus van albumine, ALT, AST, ALP, LDH, amylase, lipase, BUN, creatinine en TP (p < 0.05 –0.0001). Er was echter een significant verschil in albumine-, AST-, ALT-, ALP-, LDH-, BUN-, creatinine-, amylase-, BUN- en creatininespiegels tussen de ALA plus Mucositis-groep en de Mucositis-groep (p < 0,05-0,001). ALP-, ALT-, AST-, LDH- en amylaseniveaus waren ook aanzienlijk verschillend tussen de Mucositis- en ALA-groepen (p < 0,05-0,0001). Dienovereenkomstig werd waargenomen dat de niveaus van leverenzymen, pancreasenzymen en metabolieten drastisch werden verlaagd in de Mucositis-groep wanneer ALA aan de behandeling werd toegevoegd.
3.2. ALA vermindert de productie van pro-inflammatoire cytokines
De niveaus van pro-inflammatoire cytokines TNF- en IL-1 in serum-, maag-, dunne darm- en dikke darmmonsters zijn te zien in figuur 1. De TNF- en IL-1-niveaus in sera en alle weefsels van dieren in de Mucositis-groep waren significant hoger in vergelijking met de controle-, ALA- en Mucositis plus ALA-groepen (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). De TNF- en IL-1-niveaus in de sera en alle weefsels namen echter significant af in de Mucositis plus ALA-groep in vergelijking met de Mucositis-groep (p < 0.05–0.0001). Tussen de controle- en mucositis plus ALA-groepen was er een aanzienlijk verschil in de niveaus van TNF- in de dunne en dikke darm. (p < 0,01). Er waren ook significante verschillen in TNF-niveaus in de dikke en dunne darm tussen de ALA- en Mucositis plus ALA-groepen. (respectievelijk p < 0,01, p < 0,001). Bovendien waren er statistisch significante verschillen tussen de controlegroep en de mucositis plus ALA-groep in termen van IL-1-waarden in de maag (p < 0,05). Daarom leek ALA de niveaus van pro-inflammatoire cytokines bij mucositis significant te onderdrukken.
3.3. ALA-behandeling vermindert de peroxidatie van lipiden en verhoogt de activiteit van antioxidante enzymen in weefsels
MDA-niveaus, GPx- en SOD-activiteiten werden gekwantificeerd om peroxidatie en antioxidantstatus op weefselniveau te beoordelen (figuur 2). MDA-niveaus in de maag, dunne darm en dikke darm van de Mucositis-groep waren significant hoger dan in de controle-, ALA- en Mucositis plus ALA-groepen (p < 0.05–0 .0001). Bovendien waren de niveaus van MDA in de dikke darm van de Mucositis plus ALA-groep aanzienlijk verschillend van die van de controle- en ALA-groepen (p < 0,0001).
Ratten in de controle- en ALA-groep hadden significant hogere SOD-waarden in alle weefsels dan ratten in de mucositis-groep (p < {{0}}.05–0.{{8 }}{{10}}01). SOD-niveaus in de dikke darmmonsters waren significant verschillend in de ALA- en Mucositis plus ALA-groepen (p < 0,01). In de maagmonsters waren de SOD-waarden significant lager in de ALA- en Mucositis plus ALA-groepen (p < 0,05). Bovendien waren de SOD-waarden in de dunne darm van ratten uit de Mucositis-groep substantieel lager dan de SOD-waarden in de ALA-groep (p < 0,05). De SOD-niveaus in de maag en dikke darm van dieren in de Mucositis- en Mucositis plus ALA-groepen waren echter aanzienlijk verschillend (p < 0,05-0,0001).
3.4. ALA-behandeling verhoogt de niveaus van weefsel-MMP's en TIMP-1
MMP{{0}}-, MMP-2-, MMP-8- en TIMP-1-activiteiten (tabel 2) in serum, maag, dunne darm en dikke darm waren significant hoger in de Mucositis-groep in vergelijking met de controle- en ALA-groepen (p < 0.05–0.0001). De verhoging van MMP-1-, MMP-2-, MMP-8- en TIMP-1-waarden in de sera van Mucositis-ratten en maag, dunne darm en dikke darm werden significant onderdrukt in Mucositis plus ALA-ratten (p < 0,05-0,0001), hoewel er geen significant verschil was in serum MMP-8-waarden tussen de Mucositis plus ALA- en Mucositis-groepen.
