Stx2 induceert differentiële genexpressie en verstoort circadiane ritmegenen in de proximale tubulus

Samenvatting: Shigatoxine-producerende Escherichia coli(STEC) veroorzaakt proximale tubulaire defecten in de nier. Factoren die door Shiga-toxine (Stx) in de proximale tubuli worden veranderd, moeten echter nog worden aangetoond. We bepaalden de Stx-receptor Gb3 in de nieren van muizen en mensen en bevestigden de receptorexpressie in de proximale tubuli. Stx2-injecteerde nierweefsel van muizen enMet Stx2-behandelde menselijke primaire proximale tubulaire epitheelcellen van de nieren(RPTEC) werden verzameld en microarray-analyse werd uitgevoerd. We vergeleken muizennier- en RPTEC-arrays en selecteerden 58 gemeenschappelijke genen die differentieel tot expressie komen versus controle (0 uur, niet behandeld met toxine). We ontdekten dat het meest tot expressie gebrachte gen GDF15 was, dat mogelijk betrokken is bij door Stx2-geïnduceerd gewichtsverlies. Genen geassocieerd met eerder gerapporteerde Stx2-activiteiten zoals src-kinase Ja fosforylatieroute-activatie ongevouwen eiwitrespons (UPR) en ribotoxische stressrespons (RSR) vertoonden differentiële expressies. Bovendien werden circadiane klokgenen op verschillende manieren tot expressie gebracht, wat erop wijst dat Stx2-geïnduceerde verstoringen van het circadiane ritme in de nieren veroorzaken. De circadiane ritmegereguleerde proximale tubulaire Na+ -glucosetransporter SGLT1 (SLC5A1) werd naar beneden gereguleerd, wat wijst op functionele verslechtering van de proximale tubulus, en muizen ontwikkelden glucosurie, wat de proximale tubulaire disfunctie bevestigde. Stx2 verandert de genexpressie in de proximale tubuli van muizen en mensen door bekende activiteiten en nieuw onderzochte circadiane ritmestoornissen, die kunnen resulteren in disfuncties van de proximale tubuli.

Trefwoorden:Shiga-toxine type 2 (Stx2);proximale niertubulus; muis; menselijke proximale tubulaire epitheelcel van de nier (RPTEC); microarray; circadiaans ritme

Belangrijkste bijdrage:Differentieel tot expressie gebrachte genen uit met Stx2-behandelde muizennieren en menselijke primaire proximale tubulaire cellen werden geanalyseerd. Naast de eerder bekende genen die door Stx2- worden aangetast, werd aangetoond dat circadiaanse ritme-geassocieerde genen hun expressie veranderen en een invloed hebben op de proximale tubulaire functie.

1. Inleiding

Shigatoxine-producerende Escherichia coli(STEC)-infectie veroorzaakt ernstige symptomen van het hemolytisch-uremisch syndroom (HUS), dat wordt gedefinieerd door de triade van acuut nierfalen, trombocytopenie en hemolytische anemie [1]. Er wordt aangenomen dat shigatoxinen (Stxs) een belangrijke rol spelen bij het beschadigen van cellen bij deze infectieziekte. De karakteristieke renale histopathologie van HUS omvat respectievelijk glomerulaire en tubulaire schade zoals capillaire fibrineafzetting in glomeruli en tubulaire necrose [1,2]. Eerder optreden van disfunctie in de proximale tubuli van met STEC geïnfecteerde patiënten is gemeld door urineanalyse. De proximale tubulaire functionele urinemarkersN-acetylglucosaminidase(NAG) en 2 microglobuline (2MG) uit urine in het acute stadium van STEC O157- of O111--geassocieerde HUS-patiënten bleken zeer verhoogd te zijn, wat wijst op een vroege disfunctie van de proximale tubuli [3].

Stxs, inclusief Stx2, bestaan ​​uit een enkele A-subeenheid en vijf B-subeenheden (A1B5-toxine), waarin A-subeenheid enzymatische activiteit bezit die adenine 4324 depurineert uit 28S-rRNA van de 60S-ribosoomsubeenheid, terwijl B-subeenheden nodig zijn om gastheercellen te binden via globotriaosylceramide (Gb3). Er zijn verschillende bekende invloeden die Stxs op de cellen uitoefenen. (I) Door zich te binden aan zijn receptor Gb3, veroorzaakt het toxine signaaltransductie via Src-familiekinase Ja [4,5]. Na binding aan de receptor internaliseren Stxs zich in de cel door endocytose en worden ze retrograde naar het ER getransporteerd. Stxs gaan door het endosoom en het Golgi-apparaat waar de A-subeenheid door furine wordt gesplitst tussen katalytische A1- en C-terminale A2-fragmenten [6], hoewel A1- en A2-fragmenten nog steeds verbonden zijn met een disulfidebinding. Toxine bereikt het ER en de disulfidebinding kan worden verminderd; vervolgens wordt een A1-fragment van holotoxine vrijgegeven [7,8]. Dit is wanneer beïnvloeding door (II) ER-stress plaatsvindt met ongevouwen eiwit-nabootsende toxinefragmenten, die ongevouwen eiwitrespons (UPR) induceren. Zowel A- als B-subeenheden zijn in staat Bip te binden, wat indicatief is voor het induceren van ER-stress [9,10]. Het gesplitste Al-fragment wordt naar het cytoplasma getransloceerd en zuivert een adenine van 28S-rRNA om de eiwitsynthese (III) te remmen. De wijziging die Stxs veroorzaakt aan 28S-rRNA induceert (IV) een ribotoxische stressreactie (RSR), die de stroomafwaartse signaalcascade activeert [11]. Het is bekend dat invloeden (II) en/of (IV) bepaalde gentranscriptie induceren, wat leidt tot cytokinesecretie [12]. Ook zijn (II) en (IV) betrokken bij (VI) Stxs-geïnduceerde apoptose [13-15].

In vitro-experimenten met menselijke proximale tubuli en in vivo muismodellen verbinden proximale tubulaire schade sterk met Stxs. Zowel primaire culturen als cellijnen van menselijke proximale tubuli zijn zeer gevoelig voor Stxs en vertonen cytokine-afgifte en celdood, inclusief apoptose [16-20]. Menselijke primaire renale proximale tubulaire epitheelcellen (RPTEC's) brengen de receptor Gb3 tot expressie, zijn zeer gevoelig voor Shiga-toxinen en zijn in veel artikelen gebruikt om biologische reacties te analyseren, zoals remming van de eiwitsynthese, cytokineproductie en inductie van apoptose [17,20]. . Met Shigatoxine type 1 (Stx1) geïnjecteerde muizen vertoonden glucosurie, wat duidt op een verminderde reabsorptie van glucose door de proximale tubulus [21]. Deze suggereren Stxs-toxiciteit voor de proximale tubuli, zowel in vitro als in vivo. In met STEC geïnfecteerde muismodellen zijn frequente bevindingen in de histopathologie necrose van tubulaire epitheelcellen en afgestoten cellen in het lumen van de proximale tubuli [22-24]. Gezuiverde met Stx (ofwel Stx1 of Stx2) geïnjecteerde muizen vertonen ook vervelling van de proximale tubuli met relatief intacte kernen [25-27].

Hoewel schade aan de proximale tubuli geassocieerd met Stx-injectie of STEC-infectie functioneel en histologisch is beschreven, moeten gendoelen die betrokken zijn bij het beschadigen van proximale tubuli nog worden aangetoond.

Hier analyseerden we genexpressies in met Stx2-geïnjecteerde muizennieren en met Stx2-behandelde menselijke primaire renale proximale tubulaire epitheelcelkweek (RPTEC) om proximale tubulus-geassocieerde genveranderingen aan te tonen die door Stx2 werden geïnduceerd.

2. Resultaten

2.1. Stx2-Nierpathologie bij geïnjecteerde muizen

Om Stx{{0}}-geassocieerde nierpathologie bij muizen te identificeren, werden nierweefselcoupes van met Stx2-geïnjecteerde muizen gekleurd met Periodic Acid-Schiff (PAS). Een duidelijke, sterke roze vlek aan de luminale zijde van tubulaire epitheelcellen duidt op de glycocalyx van de borstelrand, wat kenmerkend is voor de proximale tubulaire cellen. We bepaalden dat cellen/kernen buiten de glycocalyx (binnen de luminale ruimte) los stonden van aangrenzende cellen en basaalmembranen (dat wil zeggen afgestoten cellen). In Figuur 1B (8 uur na Stx2), C en D (48 uur na Stx2) worden afgestoten cellen met relatief intacte kernen weergegeven met pijlen. We hebben ook celafval waargenomen in het proximale tubulaire lumen (pijlpunten in Figuur 1). Na toediening van Stx2 verschenen deze laesies vrij duidelijk, terwijl ze na 0 uur (Figuur 1A, zonder Stx2) verwaarloosbaar waren.

Figuur 1. Stx2 induceert het afsterven van proximale tubulaire cellen in de muizennier. Perjoodzuur Schiff (PAS)-vlekken van met Stx2-geïnjecteerde niercoupes van muizen worden getoond. (A) 0 uur (naïef), (B) 8 uur en (C) 48 uur na Stx2-injectie. Pijlen geven vervelling van proximale tubulaire cellen aan. Pijlpunten geven celresten aan. Een vergroot veld binnen (C) wordt weergegeven in (D) met vervellingscellen die met pijlen zijn aangegeven. Staven in (A – C) geven 50 µm aan. De schaalbalk in (D) geeft 10 µ aan

2.2. Gb3-expressie in muizen- en menselijke nieren

2.2.1. Muis niercortex Gb3-expressie

Omdat de proximale tubulaire cellen histologische schade vertoonden als gevolg van een Stx2-beschadiging, testten we de expressie van de Stx2-receptorglobotriaosylceramide (Gb3) in de niercortex van muizen samen met een proximale tubulaire marker aquaporine-1 (AQP1). Zoals weergegeven in Figuur 2 vertoonden AQP1-positieve cellen Gb3-positiviteit voornamelijk aan de luminale zijde van de cellen (cellen zijn gemarkeerd met gesloten pijlpunten, terwijl lumina zijn gemarkeerd met sterretjes). We hebben ook waargenomen dat AQP1-negatieve tubulaire Gb3-vlekken vermoedelijk ductcellen verzamelen (Figuur 2, open pijlpunt), zoals gerapporteerd [28]. De intensiteit van de Gb3-kleuring was sterker in de AQP1 (-) cellen, maar het aantal van dit type tubuli was kleiner vergeleken met Gb3/AQP1 dubbel-positieve proximale tubuli in de cortex. CD31-positieve endotheelcellen zijn Gb3-negatief in de muizennier. Als negatieve controle werd een op isotype afgestemde antilichaamcontrole voor Gb3 (ratten-IgM) gebruikt. IgM van ratten reageerde niet met nierweefsel van muizen (Figuur S1)

2.2.2. Menselijke niercortex Gb3-expressie

In menselijk nierweefsel was Gb3 ook positief in AQP1-positieve proximale tubuli (Figuur 3, gesloten pijlpunten). De lokalisatie van Gb3 in de proximale tubulaire cellen was sterker aan de luminale zijde. We hebben ook AQP1(-)Gb3(+)-cellen waargenomen (Figuur 3, open pijlpunten) zoals we deden in muizenweefsel. Menselijke endotheelcellen brengen Gb3 tot expressie (CD31/Gb3 dubbel positief, Figuur 3, asterisk). Isotype-controlesecties met ratten-IgM vertoonden geen positieve reactie in menselijk nierweefsel (Figuur S2).

2.3. Microarray-analyse

Omdat zowel proximale tubulaire epitheelcellen van muizen als mensen Gb3-positief zijn, suggereert dit dat dit celtype rechtstreeks door Stx2 wordt beïnvloed. Om door Stx2-aangetaste genen in zowel muizen- als menselijke proximale tubulaire cellen te bepalen, hebben we totaal RNA uit de nieren van met Stx2-geïnjecteerde muizen en met Stx2-behandelde menselijke primaire RPTEC's geëxtraheerd en geanalyseerd genexpressie door microarray

2.3.1. Differentieel tot expressie gebrachte genen in zowel muizennier als RPTEC

Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's), die gemeenschappelijk zijn voor zowel muizennieren als RPTEC, werden geselecteerd. De basis voor het selecteren van gemeenschappelijke DEG's is dat (1) genen met een log{1}}voudige verandering (tegen 0 h) van meer dan 1 of minder dan −1 in zowel de nier van de muis als de RPTEC-microarray, tenminste in één- tijdstip en (2) verdeling van log{7}}voudige verandering van een gen past in kubieke curven in plaats van kwadratische curven om beter rekening te houden met genexpressiepieken halverwege het tijdsverloop in de niermicroarray. Met de twee bovenstaande criteria selecteerden we 58 gemeenschappelijke genen tussen de met Stx2-behandelde muizennier en menselijke RPTEC (Figuur 4A). Expressiepatronen van deze 58 genen in de muizennier worden weergegeven in een heatmap (Figuur 4B). De meeste genen werden later op de uren na de Stx2-injectie opgereguleerd; Sommige genen hadden echter eerdere expressiepatronen. Genen met meer dan één log2-voudige verandering werden voor elk tijdstip vermeld (tabel 1).

Figuur 4. Microarray-analyse. (A) Van de genen die met microarray zijn geanalyseerd, werd gedetecteerd dat 147 genen (groen omcirkeld) en 4013 genen (rood omcirkeld) uit respectievelijk de met Stx2-behandelde muizennier en RPTEC log{ {4}}voudige verandering minder dan −1 of meer dan 1. Het aantal genen dat werd gewijzigd door Stx2-behandeling tegen 0 uur in beide microarrays (algemene differentieel tot expressie gebrachte genen/DEG's) bedroeg in totaal 58 (rood en groen overlappend gebied). (B) De heatmap van de gemeenschappelijke 58 genen wordt weergegeven in de tijdlijn voor het nemen van nierbemonsteringen bij muizen. Z is gelijk aan 0 geeft een gemiddelde van log2-voudige veranderingswaarden van een gen aan en weerspiegelt een trend in genexpressie. Een groenachtige kleur vertegenwoordigt dus een lagere waarde dan het gemiddelde van een bepaald gen op een rij, terwijl een roodachtige kleur een bovengemiddelde verandering vertegenwoordigt. Log2-voudige gegevens van de 58 genen uit de PBS-geïnjecteerde dataset van 72 uur vergeleken met 0 uur worden ter referentie weergegeven als Tabel S3. (C) Het Metascape GO-verrijkingsstaafdiagram wordt weergegeven. De X-as toont -log10 p-waarden van verrijkte GO-termen over 58 veel voorkomende DEG's, waarbij een groter aantal van de verrijkte GO-termen waarschijnlijker relevant is voor het systeem. De top 20 verrijkte GO-termen worden getoond. (D) STRING-analyse van 58 gemeenschappelijke DEG's wordt getoond in de zes meest verbonden/gerelateerde clusters. Bolvormige kleuren duiden genen aan die tot hetzelfde cluster behoren. Relaties van acties tussen genen worden weergegeven op een kleur- en eindvormgecodeerde manier. ENSG00000279576 is nu gecodeerd als ENSP00000485396, wat de menselijke ID van gen MALAT1 aangeeft.

Om de functionaliteit van veelgebruikte DEG's te analyseren, hebben we het Metascape-platform gebruikt. Het wijst Gene Ontology (GO)-termen, die bestaan ​​uit moleculaire functie, cellulaire component en biologisch proces, toe aan geselecteerde genen. We hebben de gemeenschappelijke 58 DEG's bij Metascape gedeponeerd en de top 20 GO-termen verkregen waarin deze DEG's thuishoren (Figuur 4C). GO-termen worden vermeld met overeenkomstige genen in Tabel S1. Als u een genenlijst wilt zien binnen elke GO-term die wordt weergegeven in figuur 4C, raadpleegt u Tabel S2 Metascape-verrijking. GO-termen die verband houden met celdood, ontsteking en signaalcascades werden zoals verwacht in de top 20 gerangschikt; het circadiane ritme trok echter de aandacht als een nieuwe GO-term. Bekende verbindingen van gemeenschappelijke genen werden getoond met STRING-analyse (Figuur 4D). In deze analyse werden genen geclusterd in zes verschillende groepen, waarbij rekening werd gehouden met een sterke associatie van binding, invloeden (katalyse, activering of remming), evenals co-expressie van genen.

2.3.2. Trend van genexpressie

Sporen van verschillende genexpressies worden weergegeven in grafieken met de x-as voor de tijd (h) na Stx2-injectie en de y-as voor log2-voudige verandering ten opzichte van 0 h (Figuur 5). De waarde op de y-as is dus gelijk aan 1 en betekent een 2-voudige verandering versus 0 h-expressie.

Figuur 5. Differentieel tot expressie gebrachte genen met tijdlijn voor bemonstering van muizen. (A) PDK4- en CEBPB-mRNA-expressiepatronen worden getoond. (B) onmiddellijke vroege genen. (C) Matricellulaire eiwitten CYR61 (CCN1) en CTGF (CCN2) expressies. (D) UPR-gerelateerde genen DDIT3 (CHOP, GADD153), DDIT3-bindingspartner CEBPB en negatieve feedbackfactor PPP1R15A (GADD34) worden getoond. (E) Transcriptiefactoren DDIT3 (CHOP, GADD153) en ATF3 en GDF15, die transcriptioneel door deze factoren worden gereguleerd, worden getoond. (F) UPR- en RSR-geassocieerde genen worden getoond. (G) EDN1 in relatie tot UPR-genen is uitgezet. (H) Vroege pieken van EDN1 en EGR1 en de volgende piek van PER1 worden getoond met een latere geleidelijke toename in alle drie de genen. (I) Genen uit de paarse cluster van Figuur 4D zijn circadiane ritme-gerelateerde genen. (J) Circadiane kerngenen PER1, Arntl (BMAL1), Cry1 en Clock worden getoond. (K) PER1 en circadiane klok-gereguleerde niergenen worden getoond. (L) Ontstekingsgenen met NF-kB-pathway-gerelateerde genen worden getoond. Raadpleeg aanvullende figuur S4 om individuele log2-gegevenspunten te bekijken. Figuur S5, die de gemiddelde log2 toont met staven voor de standaardafwijking, wordt ter referentie gepresenteerd.

Ondersteunende service van Wecistanche, de grootste cistanche-exporteur in China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Winkel voor meer specificaties:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KRIJG NATUURLIJK BIOLOGISCH CISTANCHE-EXTRACT MET 25% ECHINACOSIDE EN 9% ACTEOSIDE VOOR NIIERINFECTIE