Genklonering, functionele identificatie, structurele en expressieanalyse van sucrosesynthase uit Cistanche Tubulosa Ⅱ

Resultaten en analyse

1 Mijnbouw van sucrosesynthasegenen in Cistanche tubulosa en klonering van het CtSus-gen

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>luchtdeel.

Hoogwaardige Cistanche Tubulosa voor de gezondheid van mannen

Daarom werden de FPKM-waarden op expressieniveau van de twee kandidaat-sucrosesynthasegenen verkregen bij de initiële screening in de transcriptoomgegevens van verschillende delen van Cistanche tubulosa genormaliseerd door Z-Score en werd differentiële analyse uitgevoerd (Figuur 1A). De resultaten toonden aan dat het CtSus-gen het hoogste expressieniveau had in het haustorium, en dat het expressieniveau in het ondergrondse deel hoger was dan dat in het bovengrondse deel, wat consistent was met het accumulatiepatroon van glycosideverbindingen in verschillende delen van Cistanche tubulosa. terwijl het expressieniveau van het CtSus1-gen in het haustorium laag was. Daarom werd op basis van de bovenstaande resultaten het CtSus-gen geselecteerd voor daaropvolgende sequentieamplificatie, exogene expressie en functionele identificatie. Met behulp van cDNA van Cistanche tubulosa als matrijs werd na PCR-amplificatie een product met enkele band verkregen bij ~2500 bp (Figuur 1B). Het PCR-product werd uit de gel gewonnen en aan de kloneringsvector geligeerd, en het coderende gebied met de volledige lengte van het doelgen werd verkregen door middel van sequencing. De lengte van de CtSus-sequentie was 2418 bp.

Figuur 1 Genonderzoek en klonering van CtSus uit C. tubulosa en bioinformatische analyse van het gecodeerde eiwit ervan. A: Expressieniveaus van de CtSus- en CtSus1-genen in verschillende delen van C. tubulosa genormaliseerd als Z-Scores op basis van hun FPKM-waarden; B: Genamplificatie van CtSus; M: DNA-marker; C: Conservatief domein van CtSus-eiwit voorspeld door SMART; D: Uitlijning van meerdere sequenties van CtSus en sucrosesynthasen geïdentificeerd uit andere planten, waaronder Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum en Albuca bracteata. Het sucrosesynthesedomein en het suikeroverdrachtsdomein worden respectievelijk weergegeven door rode en blauwe vakken; E: Fylogenetische analyse van CtSus en sucrosesynthasen van andere planten; F: SDS-PAGE-analyse van de heterologe expressie van CtSus met behulp van pColdTM I-vector in E. coli. Laan 1: Eiwitmarker; Baan 2: Supernatantfractie; Laan 3: Neerslagfractie. De rode pijl toont het CtSus-eiwit. G: Kolonie-PCR van een enkele kloon die beide recombinante plasmiden bevat. M: DNA-marker; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Tabel 2 Overeenkomsten in aminozuursequentie tussen CtSus en sucrosesynthasen geïdentificeerd uit andere planten

2.3 Fylogenetische analyse

De fylogenetische boom geconstrueerd door MEGA-software werd gebruikt om de fylogenetische relatie tussen de sucrosesynthase CtSus van Cistanche tubulosa en andere van planten afkomstige sucrosesynthasen te analyseren. De resultaten worden weergegeven in Figuur 1E. Van planten afkomstige sucrosesynthasen vertonen verschillende evolutionaire vertakkingen in tweezaadlobbigen (regio I en II) en eenzaadlobbigen (regio III). CtSus bevindt zich in de tweezaadlobbige tak en de sequenties die het nauwst verwant zijn aan CtSus zijn allemaal afkomstig van Lamiaceae-planten (Cistanche tubulosa is een Lamiaceae Orobanchaceae-plant), terwijl de andere tak voornamelijk bestaat uit Solanales-planten, wat verder wijst op de hoge conserverings- en homologie van van planten afkomstige sucrosesynthasegenen in de evolutie van planten in dezelfde volgorde. Onder hen is de sucrosesynthase PrSus (AEN79500.1) uit Phelipanche ramosa van de Orobanchaceae-plant het nauwst verwant aan CtSus.

3 Exogene expressie- en activiteitsanalyse van CtSus

3.1 Exogene expressie van het CtSus-gen De pET-28a-CtSus-, pET-24b-CtSus- en pCold™ I-CtSus-plasmiden, geverifieerd door sequencing, werden overgebracht naar de expressiecompetente E. coli Transetta (DE3), en de positieve klonen werden gescreend door kolonie-PCR voor verificatie van de sequentie. De verkregen recombinante expressiestammen werden geïnduceerd door IPTG lage temperatuur voor eiwitexpressie, de bacteriën werden verzameld door centrifugatie en de lysisbuffer werd toegevoegd om de bacteriën te breken om het supernatant en het neerslag te verkrijgen, en SDS-PAGE werd uitgevoerd voor detectie. De resultaten toonden aan dat wanneer pET-28a en pET-24b werden gebruikt als expressievectoren, CtSus niet tot expressie werd gebracht in E. coli, terwijl wanneer pCold™ I werd gebruikt als expressievector, er wel een duidelijke CtSus-vector werd gebruikt. recombinante eiwitband werd gedetecteerd in het gebied van ~100 kDa, wat consistent was met de theoretisch voorspelde relatieve molecuulmassa van 92,2 kDa (Figuur 1F).

3.2 Transformatie van hele cellen

Om de katalytische functie van CtSus voorlopig te verifiëren, werd een co-expressiestam van CtSus en het glycosyltransferasegen UGT71BD1 geconstrueerd. UGT71BD1 werd gekloond en geïdentificeerd uit Cistanche tubulosa en is een UDP-glucosyltransferase die aromatische verbindingen zoals fenylethanoïdeglycosiden, verschillende soorten flavonoïden, stilbeen en coumarine op grote schaal als receptoren kan accepteren en de glucosyleringsreactie van de substraatfenolische hydroxylgroep kan katalyseren met behulp van UDP-glucose als suikerdonor [18]. De introductie van CtSus kan theoretisch voldoende glycosyldonor UDP-glucose opleveren voor de glucosyleringsreactie die wordt gekatalyseerd door UGT71BD1, waardoor het reactie-evenwicht wordt bevorderd om te evolueren naar de vorming van glycosyleringsproducten, waardoor de opbrengst aan glycosyleringsproducten wordt verhoogd. Het pCold™ I-CtSus-plasmide en het pET-28a-UGT71BD1-plasmide werden gelijktijdig getransformeerd in de expressiecompetente E. coli Transetta (DE3). Afzonderlijke klonen die beide recombinante plasmiden bevatten, werden gescreend door kolonie-PCR, en positieve recombinante expressiestammen werden verkregen door verificatie van de sequentie (Figuur 1G). De co-expressie van twee genen werd in vitro geïnduceerd en de pET-28aUGT71BD1-stam met enkele genexpressie werd als controlegroep gebruikt. De activiteit van CtSus bij het katalyseren van de generatie van UDP-glucosedonor werd voorlopig geverifieerd door transformatie van hele cellen. De resultaten van HPLC en massaspectrometrie met hoge resolutie toonden aan dat wanneer een transformatiereactie van hele cellen werd uitgevoerd met aconitine 1 en resveratrol 2 als substraten, de vorming van duidelijke glycosyleringsproducten werd gedetecteerd na 24 uur transformatie, zoals weergegeven in Figuur 2.

Figuur 2 Biotransformatie van hele cellen van substraat 1 of 2 door respectievelijk een recombinante stam die UGT71BD1 herbergt of een recombinante stam die UGT71BD1-koppeling met CtSus herbergt. A: HPLC-chromatogrammen van de biotransformatie van gehele cellen van substraat 1. De detectiegolflengte was 360 nm; B: HRESI-MS en MS2spectra van product 1a; C: HPLC-chromatogrammen van de biotransformatie van de gehele cel van substraat 2; De detectiegolflengte was 330 nm. D: HRESI-MS-spectra van producten 2a en 2b

Wanneer 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, molecuulformule C9H6O4) werd als substraat gebruikt, de productchromatografische piek 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, voorspelde molecuulformule C15H16O9) werd na 5,39 minuten gedetecteerd, wat consistent was met de UV-straling absorptie van het substraat en het controleproduct. Tegelijkertijd werd een fragmentpiek van m/z 179.033 4 [M+H]+ gedetecteerd in het MS2-spectrum van 1a, die werd geproduceerd doordat 1a een glucosemolecuul (162 Da) verloor, wat aangeeft dat La was het product van substraat 1 verbonden met een glucosemolecuul. Het conversiepercentage werd berekend door het piekoppervlak te integreren. Er werd gevonden dat de conversiesnelheid van hele UGT71BD1-cellen die substraat 1 katalyseren om geglycosyleerd product la te genereren 71,87% was, terwijl de toevoeging van CtSus de conversiesnelheid van de reactie verhoogde tot 95,84%, 1,3 maal die van de controlegroep. Toen het substraat verbinding 2 was (m/z 227.072 5 [MH]-, molecuulformule C14H12O3), piekte het product chromatografisch 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, voorspelde moleculaire formule C20H22O8) en 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, voorspelde molecuulformule C26H32O13) consistent met de karakteristieke UV-absorptie van het substraat en het controleproduct werden respectievelijk na 10,32 en 6,52 minuten gedetecteerd . Er werd een fragmentpiek gedetecteerd bij 3 [MH]-, die werd gegenereerd door het verlies van één glucosemolecuul (162 Da), wat aangeeft dat 2a het product was van substraat 2 verbonden met één glucosemolecuul. Door vergelijking met de gegevens in de literatuur [18] en de voorspellingsinformatie van de massaspectrometrie werd vastgesteld dat product 2b het product was van substraat 2 verbonden met twee glucosemoleculen. Het conversiepercentage werd berekend met behulp van het geïntegreerde piekoppervlak. Er werd gevonden dat de toevoeging van CtSus de conversiesnelheid van de glycosyleringsreactie van substraat 2 zou kunnen verhogen van 64,01% naar 78,51%, waarbij de opbrengst aan monosacharideproduct 2a toenam van 45,09% naar 63,58%, en de opbrengst aan disaccharideproduct 2b gewijzigd van 18,92% naar 14,93%.

3.3 Zuivering van CtSus-recombinant eiwit en identificatie van in vitro enzymatische activiteit

De resultaten van het hele celtransformatie-experiment suggereren dat CtSus de activiteit heeft van het katalyseren van de productie van actieve glucosedonor UDP-glucose. Om deze katalytische activiteit verder rechtstreeks te verifiëren via in vitro enzymatische katalytische reactie, werd het fusie-eiwit van het CtSus-gen in het pCold™-expressiesysteem gescheiden en gezuiverd door affiniteitschromatografie. De resultaten toonden aan dat wanneer pCold™ I als expressievector werd gebruikt, het recombinante eiwit in grote hoeveelheden tot expressie werd gebracht, maar vooral in het neerslag. Toen pCold™ TF als expressievector werd gebruikt, werd het CtSus-gen in grote hoeveelheden tot expressie gebracht in E. coli (Figuur 3A). Het fusie-eiwit werd gezuiverd door middel van HisTrap FF-affiniteitschromatografie en onderworpen aan in vitro enzymatische katalytische reactie. De resultaten worden weergegeven in Figuur 3B. Wanneer sucrose en UDP als substraten werden gebruikt, werd, vergeleken met de negatieve controlegroep, een nieuwe productpiek gedetecteerd na 10,32 minuten. De retentietijd en UV-absorptie waren consistent met UDP-glucose. Het product bleek UDP-glucose te zijn in vergelijking met de standaard. Omdat het door de pCold™ TF-expressievector tot expressie gebrachte fusie-eiwit echter een grote triggerfactor-oplosbare tag bevat (de grootte van de tag-eiwit is 48 kDa), zal dit een grote invloed hebben op de katalytische activiteit van het eiwit. Daarom werd de tag van het fusie-eiwit verder geknipt door Factor Xa-enzym en werd het CtSus-eiwit zonder exogene tags gezuiverd (Figuur 3A). Het eiwit werd onderworpen aan in vitro enzymatische katalyse en de resultaten toonden aan dat de opbrengst aan UDP-glucose toenam van 3,53% naar 10,66%.

(Figuur 3B). De bovenstaande resultaten bevestigden de activiteit van CtSus bij het katalyseren van de productie van UDP-glucose door in vitro enzymatische katalyse, en toonden ook aan dat de aanwezigheid van een grote affiniteitstag bevorderlijk is voor de oplosbare expressie van CtSus, maar dat deze ook de in- vitrokatalytische activiteit van het enzym.

Figuur 3 Heterologe expressie en functionele identificatie van CtSus. A: SDS-PAGE-analyse van CtSus-eiwitten. Laan 1: Eiwitmarker; Laan 2: Recombinant CtSus met triggerfactor; Laan 3: Triggerfactor-tagsplitsing met behulp van Factor Xa-protease om het CtSus-eiwit op te leveren dat is gelabeld door de rode pijl. B: In vitro enzymatische tests waarbij gebruik wordt gemaakt van fusie-eiwit en trigger-factorvrije CtSus-eiwitten om de synthese van UDP-glucose te katalyseren in aanwezigheid van respectievelijk sucrose en UDP, met referentiestandaard UDP-glucose. Gekookt eiwit werd onder dezelfde omstandigheden als controlegroep gebruikt. De detectiegolflengte was 260 nm