Synergetische ontstekingsremmende effecten van Laminaria Japonica Fucoidan en Cistanche Tubulosa-extract

Als immuunrespons tegen vreemde antigenen geven macrofagen pro-inflammatoire cytokines vrij, zoals tumornecrosefactor (TNF-), interleukine-1 (IL- 1), IL-6 en andere. Dergelijke cytokinen induceren een chemotactische instroom van granulocyten, monocyten, lymfocyten en mestcellen naar beschadigd weefsel, wat de verwijdering van antigeen en weefselherstel bevordert. Overmatige infiltratie en activering van de cellen verergert echter weefselbeschadigingen, wat leidt tot oedeem (vasculaire exsudatie) en pijn, wat bekende ontstekingsverschijnselen zijn.

TNF- is een belangrijke factor voor het induceren van genexpressie van stikstofoxidesynthase (iNOS) in verschillende cellijnen. iNOS-activering leidt tot de productie van stikstofmonoxide (NO), die niet alleen verschillende fysiologische functies moduleert, zoals bacteriedodend vermogen en vasodilatatie, maar ook ontstekingen veroorzaakt. Na weefselbeschadiging genereert de afbraak door fosfolipasen van celmembraanfosfolipiden arachidonzuur. Arachidonzuur wordt verder afgebroken door cyclo-oxygenase (COX) tot prostaglandinen (PG's). Een overmatige hoeveelheid PGE2 gevormd door COX-II induceert verschillende cytokinen voor ontsteking. Omdat zowel NO als PGE2 fungeren als belangrijke factoren voor ontsteking en pijninductie, zijn de TNF-NO- en COX-II-PGE2-routes de belangrijkste stromen van het ontstekingsproces, die worden geremd door corticosteroïden en niet-steroïdale geneesmiddelen.ontstekingsremmende medicijnen(NSAID's), respectievelijk.

Ook al bestaan ​​er verschillende steroïden en NSAID's voorde therapie van ontstekingsziektenkunnen deze geneesmiddelen aanleiding geven tot nadelige effecten op het immuunsysteem, het maag-darmkanaal, de nieren, de lever, het centrale zenuwstelsel, de bloeddruk en het cardiovasculaire systeem. Daarom is het noodzakelijk om de nadelige effecten van chemische therapieën tot een minimum te beperken door ze te vervangen of te gebruiken in combinatie met natuurlijke producten.

Fucoidan, een sulfaatpolysacharidecomplex uit zeewieren zoals Laminaria japonica en Cladosiphon okamuranus, dat in veel landen wijd verspreid is, wordt in de oosterse geneeskunde gedurende een lange periode als therapie gebruikt. In eerdere onderzoeken is aangetoond dat fucoïdan anti-oxidatieve, anti-coagulatieve, anti-kanker en anti-kanker eigenschappen heeft.ontstekingsremmende activiteiten. Dienovereenkomstig trekken de gunstige effecten van fucoidan op ontstekingsziekten, ischemie, immuundisfunctie en tumoren de aandacht van onderzoekers. Aan de andere kant,Cistanche tubulosa(CT) wordt in China ook veel gebruikt als traditioneel medicijn. Er werd gerapporteerd dat CT-extracten de productie van TNF-á en IL- 4 verlagen, wat belangrijke factoren zijn voor NO-productie in ontstekingsroutes [19].

Dergelijke eerdere bevindingen brachten ons ertoe de gecombineerde werkzaamheid van fucoidan en CT-extract op de twee belangrijkste ontstekingsroutes te onderzoeken. Om het werkingsmechanisme op te helderen, analyseerden we NO en PGE2 in de exsudaten van door carrageen geïnduceerde luchtzakontsteking.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR PREVENTIEONTSTEKINGSACTIVITEITENPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materialen en methodes

Materialen

Halfgezuiverd fucoidan en waterextract van CT werden verkregen van Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Fucoidan en CT-extract werden vóór gebruik op 4 graden gehouden, gemengd (1:3), opgelost in gezuiverd water en oraal toegediend in een volume van 5 ml/kg.

Celcultuur en NO-kwantificering

De muizenmacrofaag RAW 264.7-cellijn werd gekocht bij de American Type Culture Collection (Manassas, VS) en gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (Sigma, St. Louis, VS) met 10% foetaal runderserum en antibiotica [100 U / ml penicilline (Sigma) en 100 µg/ml streptomycine (Sigma)]. De cellen werden geïncubeerd in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 graden.

Om de effecten van fucoidan en CT-extract op de uitscheiding van NO te beoordelen, werden RAW 264.7-cellen (1×106 cellen/ml) gedurende 5 minuten geïncubeerd met fucoidan of CT-extract (1–320 µg/ml). , gevolgd door interferon- (IFN-, 10 U/ml) en lipopolysacharide (LPS, 10 µg/ml) gedurende 24 uur. In onze voorlopige onderzoeken werd bevestigd dat behandeling met IFN-plus LPS voor de activering van RAW 264.7-cellen de levensvatbaarheid van de cellen tot 24 uur niet beïnvloedde en dat fucoidan en CT-extract niet cytotoxisch waren tot 1 mg/ml. De concentratie nitriet (NO2 – ), het geoxideerde product van NO, werd gemeten als indicator voor NO. Het kweekmedium werd gemengd met een gelijk volume Griess-reagens (1% sulfanilamide, 0,1% naftylethyleendiamine in 2,5% fosforzuur) [21], en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De nitrietconcentratie werd geanalyseerd bij 540 nm, waarbij NaNO2 werd gebruikt om een ​​standaardcurve te genereren.

Dieren en behandeling

Mannelijke ICR-muizen (7 weken oud) werden gekocht bij Daehan Biolink (Eumseong, Korea) en gehuisvest in een kamer met constante omgevingsomstandigheden (22±2ºC; 40-70% relatieve vochtigheid; 12-uur licht -donkere cyclus; 150-300 lux helderheid). Pelletvoer en gezuiverd water waren ad libitum beschikbaar. Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Chungbuk National University (CBNU), Korea, en uitgevoerd volgens de Standard Operation Procedures (SOP) van het Laboratory Animal Research Center, CBNU.

De muizen (n=8/groep) werden oraal behandeld met fucoidan (18 of 54 mg/kg), CT-extract (54 of 162 mg/kg) of hun mengsel (18+54, {{6 }} of 90+270 mg/kg) eenmaal daags gedurende 7 dagen. Lage doses fucoïdan (18 mg/kg) en CT-extract (54 mg/kg) waren afkomstig van geschatte menselijke doses van 100 mg/lichaam (70 kg) en 300 mg/lichaam na translatie van het lichaamsgewicht (Km{{14 }} voor mens/Km=3 voor muis), respectievelijk. Hoge doses fucoidan en CT-extract werden ingesteld op een drievoudige dosis, alleen of in een mengsel, en het mengsel met de hoogste dosis werd vastgesteld op een vijfvoudige dosis om de maximale synergetische effecten te beoordelen.

Op de eerste dag van de behandeling met fucoidan en CT-extract werden muizen subcutaan geïnjecteerd met 10 ml steriele lucht in de achterkant om een ​​zakje te vormen [22,23]. Na 2 en 5 dagen werd het zakje opnieuw geïnjecteerd met 5 ml lucht. Eén uur na de laatste behandeling werd 1 ml carrageen (1% in zoutoplossing; Sigma) of het vehikel (zoutoplossing) in het zakje geïnjecteerd.

Analyses van de exsudaten

Het luchtzakje werd 6 uur na de carrageeninjectie gewassen met 1 ml koude zoutoplossing en het nettovolume spoelvloeistof werd geregistreerd. Het totale aantal ontstekingscellen, neutrofielen, monocyten en lymfocyten werd bepaald met behulp van een kouterteller. De concentraties NO en PGE2 werden bepaald met behulp van respectievelijk Griess-reagens (Sigma) en enzymimmunoassay (EIA) met behulp van een Correlate-EIA-kit (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET BLOKKEREN VAN WERKING OP ONTSTEKINGSCEL CHEMOTAXIS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopathologisch onderzoek

Het weefsel van de zakvoering werd verwijderd en gefixeerd in een neutrale formaline-oplossing. In paraffine ingebedde weefselglaasjes werden gekleurd met hematoxyline-eosine en onder een lichtmicroscoop onderzocht op de ontstekingslaesies.

statistische analyse

De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SE. Experimentele groepsvergelijkingen werden gemaakt door middel van eenwegsvariantieanalyse, gevolgd door een Tukey-testcorrectie. AP-waarde<0.05 was considered statistically significant.

Resultaten

In vitro verhoogden RAW 264.7-celkweek, IFN- en LPS-behandeling de NO-productie aanzienlijk (Figuur 1). Voorbehandeling met fucoidan (1–320 μg/ml) had geen invloed op de NO-afgifte uit de macrofaagcellijn (Figuur 1A). Ter vergelijking: CT-extract (32-320 µg/ml) onderdrukte de NO-productie aanzienlijk, wat wijst op een ontstekingsremmende activiteit (Figuur 1B).

Injectie van carrageen in het luchtzakje van de muis verhoogde het exsudaatvolume in het zakje aanzienlijk (Figuur 2). Een dergelijke verhoogde exsudatie werd verzwakt door behandeling met fucoïdan (18 mg/kg) en CT-extract (54 en 162 mg/kg). Met name de combinatiebehandeling van fucoidan en CT-extract verminderde het exsudaatvolume verder, vergeleken met de individuele effecten, hoewel hogere dosiscombinaties (54+162 mg/kg en 90+270 mg/kg) geen extra werkzaamheid vertoonden. naar de laagste dosiscombinatie (18+54 mg/kg) (Figuur 2A). De N-graad in het zakje nam ook drastisch toe na injectie van carrageen (Figuur 2B). In vergelijking met het milde effect van fucoidan verlaagde CT-extract de N-graad aanzienlijk. Combinatiebehandeling van fucoidan en CT-extract verlaagde het NO-niveau verder op een dosisafhankelijke manier. Op dezelfde manier werd het verhoogde PGE2-gehalte synergetisch onderdrukt door de combinatietherapie van fucoidan en CT-extract (Figuur 2C).

Parallel met de ontstekingsmediatoren in de buidel nam het aantal ontstekingscellen drastisch toe door injectie van carrageen: respectievelijk 37,8, 4,8 en 24,1 maal de controleniveaus voor neutrofielen, monocyten en lymfocyten (Tabel 1). Fucoidan en CT-extract verminderden echter significant de infiltratie van ontstekingscellen, waarbij fucoidan enigszins superieur was aan CT-extract. Onverwacht werd er geen synergetisch effect bij de infiltratie van ontstekingscellen bereikt door gelijktijdige toediening van fucoidan en CT-extract.

Zoals afgeleid uit de infiltratie van ontstekingscellen in de exsudaten, vertoonde het onderhuidse weefsel rond de luchtzakken ernstige ontstekingslaesies (Figuur 3). Er werden enorm veel cellen waargenomen in het verdikte onderhuidse weefsel dat was blootgesteld aan carrageen (Figuur 3B), vergeleken met de bijna normale kenmerken bij controledieren (Figuur 3A). Dergelijke ontstekingslaesies werden opmerkelijk verzwakt door behandeling met fucoidan (figuren 3C en 3D) of CT-extract (figuren 3E en 3F).

Met name werden hogere ontstekingsremmende effecten verkregen door combinatietherapie met fucoidan en CT-extract (figuren 3G-3I).

Discussie

Met behulp van een in vivo arrageen-geïnduceerd luchtzakontstekingsmodel induceert injectie van lucht in de ruggen van knaagdieren de proliferatie van cellen die stratificeren op het oppervlak van de holte om een ​​structuur te vormen die lijkt op het synovium. In dit model verhoogde de injectie van door carrageen geïnduceerde infiltratie van ontstekingscellen het exsudaat, wat indicatief is voor vasculaire lekkage. Het luchtzakje dient als reservoir van ontstekingscellen en mediatoren die eenvoudig kunnen worden gemeten in de vloeistof die zich lokaal ophoopt.

Van de diverse ontstekingsmediatoren die vasculaire permeabiliteit kunnen induceren, is het algemeen bekend dat NO en PGE2 belangrijke factoren zijn die betrokken zijn bij de pathogenese van veel ontstekingsziekten. Ze staan ​​ook bekend als bemiddelaars van pijninductie en -perceptie. iNOS, dat in diverse celtypen tot expressie wordt gebracht en geactiveerd door stimulatie met TNF- en/of LPS tijdens ontstekingen, produceert hoge, aanhoudende concentraties NO. NO is een belangrijk regulerend molecuul in diverse fysiologische functies, zoals vasodilatatie die leidt tot vasculaire lekkage. PGE2, dat via COX's uit arachidonzuur wordt gegenereerd, draagt ​​bij aan de ontwikkeling van veel ontstekingsziekten, en overproductie van PGE2 als reactie op verschillende ontstekingsstimulaties wordt geassocieerd met opregulatie van COX-II-niveaus en progressie van ontstekingen. Daarom worden de TNF- - NO- en COX-II-PGE2-routes beschouwd als twee hoofdstromen van ontstekingsprocessen, die worden geblokkeerd door respectievelijk remmers van iNOS (corticosteroïden) en COX (NSAID's).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBODEN VAN ONTSTEKINGZIEKTEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

In de huidige studie verminderde gelijktijdige toediening van fucoidan en CT-extract het exsudaatvolume in het zakje, wat suggereert dat ze onderdrukkende activiteit tegen vasculaire lekkage bezitten (Figuur 2A). In vergelijking met de individuele effecten van elk fucoidan- en CT-extract nam de combinatiebehandeling verder toe, wat impliceert dat de tweegraden synergetisch werken. Dergelijke synergetische effecten tussen fucoidan en CT-extract werden ondersteund door hun activiteiten op de NO- en PGE2-niveaus in de exsudaten (figuren 3B en 2C).

Interessant genoeg werd echter bevestigd dat fucoïdan de activering van macrofagen in vitro-test niet direct remt (Figuur 1A). Op vergelijkbare wijze was het remmende potentieel van fucoïdan op de in vivo-test voor NO- en PGE2-accumulatie relatief lager dan dat van CT-extract (figuren 2B en 2C). Een dergelijk werkingsmechanisme van fucoidan verschilt van een directe inactivatie van de cellen door CT-extract (Figuur 1B). Ter vergelijking: fucoidan oefende een hoge werkzaamheid uit op de remming van de infiltratie van ontstekingscellen in de zakjes (Tabel 1). Fucoidan was superieur aan CT-extract bij het blokkeren van de migratie van neutrofielen, monocyten en lymfocyten naar de door carrageen geïnduceerde weefselbeschadigingsplaatsen. Interessant genoeg was er geen synergetisch antimigratie-effect, indicatief voor verschillende werkingsmechanismen tussen fucoidan en CT-extract: dwz fucoidan blokkeert de infiltratie van ontstekingscellen, terwijl CT-extract de activering van de cellen remt.

Polymorfonucleaire cellen, vooral neutrofielen, zijn de belangrijkste cellulaire componenten die worden gerekruteerd naar acute ontstekingsplaatsen die worden geïnduceerd door carrageen. Bovendien spelen daaropvolgende ontstekingscellen zoals macrofagen en lymfocyten ook een centrale rol in het ontstekingsproces door cytokinen uit te scheiden. Bij voorbehandeling met fucoidan of CT-extract werd het aantal witte bloedcellen dat naar de met carrageen geïnjecteerde luchtzakken migreerde aanzienlijk onderdrukt. Dit resultaat kwam overeen met een effect dat zou worden verkregen door corticosteroïden zoals dexamethason, maar niet door NSAID's zoals indomethacine. Daarom wordt aangenomen dat het fucoïdan- en CT-extract gedeeltelijk een eigenschap van steroïden hebben.

Naast de blokkerende werking op chemotaxis van ontstekingscellen, leek CT-extract de activering van macrofagen te onderdrukken. Dit werd bevestigd door de remmende werking ervan op NO in vitro en in vivo, de belangrijkste ontstekingsmediator die door macrofagen wordt geproduceerd. Het effect van CT-extract op macrofagen zou dus te wijten kunnen zijn aan een onderdrukking van mRNA-expressie en/of een directe remming van iNOS-activiteit in deze cellen.

PGE2 is ook een van de belangrijkste ontstekingsmediatoren. Het neemt parallel toe met weefseloedeem, dat wordt onderdrukt door NSAID's, COX-remmers. Carrageen kan de PGE2-productie verhogen door COX-II-mRNA en COX-II-eiwit in het exsudaat van de buidel te induceren. In dit model verhoogde carrageen de hoeveelheid PGE2 aanzienlijk en werd deze substantieel onderdrukt door CT-extract. Het is interessant om op te merken dat dit resultaat consistent was met een effect dat zou worden verkregen door een NSAID-indomethacine. Daarom wordt uit de resultaten afgeleid dat CT-extract aanvullende eigenschappen van NSAID's heeft. Alles bij elkaar genomen wordt aangenomen dat CT-extract zowel corticosteroïd- als NSAID-achtige effecten uitoefende in het door carrageen geïnduceerde ontstekingsmodel en dat fucoidan deontstekingsremmende effecten van CT-extractdoor de infiltratie van ontstekingscellen te blokkeren.

Hoewel het definiëren van het exacte werkingsmechanisme verder onderzoek vereist, verzwakte een mengsel van fucoidan en CT-extract de ontstekingsverschijnselen aanzienlijk door de TNF-NO- en COX-II-PGE2-routes te blokkeren bij door carrageen geïnduceerde luchtzakontsteking. Deze bevindingen leveren bewijs dat een combinatiebehandeling van fucoidan en CT-extract een veelbelovende kandidaat zou kunnen zijn voor de verlichting van verschillende soorten ontstekingen die reageren op corticosteroïden of NSAID's.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBODEN VAN ONTSTEKINGZIEKTEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%