De huidige status van neuroprotectie bij aangeboren hartziekten Deel 3

3.2. Semi-kwantitatieve evaluatie van ectopisch mitochondriaal DNA

Afbeeldingen van Hsp60-kleuring (de mitochondriale matrix) en histon-H2B-kleuring (de nucleaire marker) werden afgetrokken van afbeeldingen van dsDNA-kleuring. Vervolgens werden de beelden gebinariseerd met behulp van de "AdjustThreshold"-functie van de Image]-software (National Institutes of Health).

Mitochondria zijn de energiefabrieken in cellen, verantwoordelijk voor de synthese van ATP om de energie te leveren die cellen nodig hebben. De mitochondriale matrix is ​​de interne vloeistof van de mitochondriën, die een verscheidenheid aan enzymen en ionen bevat en een sleutelplaats is voor verschillende biochemische reacties van de mitochondriën. Geheugen is een van de belangrijkste cognitieve vermogens van de mens. Hoewel de twee niets met elkaar te maken lijken te hebben, zijn ze nauw verwant.

Onderzoek toont een interactie aan tussen de mitochondriale matrix en het geheugen. Enzymen en ionen in de mitochondriale matrix kunnen de prikkelbaarheid van neuronen rechtstreeks beïnvloeden door het energiemetabolisme en de ionkanaalstatus in neuronale cellen te reguleren, waardoor het geheugen wordt beïnvloed. Bovendien zijn er verschillende signaalmoleculen in de mitochondriale matrix, die via de axonen en synapsen van neuronen naar stroomafwaartse neuronen kunnen worden overgedragen, waardoor de signaaltransductie-efficiëntie van neuronen wordt beïnvloed, waardoor de vorming en consolidatie van het geheugen wordt beïnvloed.

Tegelijkertijd heeft geheugenactiviteit ook rechtstreeks invloed op de toestand van de mitochondriale matrix. Geheugenactiviteiten zullen het energieverbruik van neuronen verhogen en de redoxreactie in de mitochondriale matrix bevorderen, waardoor het metabolische niveau van de mitochondriën en de intracellulaire ionenbalans worden beïnvloed, wat de prikkelbaarheid en signaaltransductie-efficiëntie van neuronen verder beïnvloedt.

Daarom is het behouden van een goede mitochondriale gezondheid cruciaal voor het behouden van een goede geheugenfunctie. Door goede leefgewoonten aan te houden, zoals een regelmatig dieet, matige lichaamsbeweging, voldoende slaap, enz., kunt u helpen de gezondheid van de mitochondriale matrix te behouden. Bovendien kan de geheugenfunctie ook worden verbeterd door passende farmaceutische interventies om biochemische reacties en signalering binnen de mitochondriale matrix te bevorderen.

In het dagelijks leven kunnen we ons geheugen op vele manieren oefenen, zoals lezen, studeren, denken, spelletjes, enz. Tegelijkertijd moeten we ook aandacht besteden aan het behouden van een goede gezondheid om de gezondheid van de mitochondriale matrix beter te behouden. Ik geloof dat we door deze inspanningen zeker een beter geheugen zullen hebben en beter zullen kunnen omgaan met verschillende uitdagingen in het leven en op het werk. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche deserticola kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche deserticola ook de balans van neurotransmitters kan reguleren, zoals het verhogen van de niveaus van acetylcholine en groeifactoren. Deze stoffen zijn erg belangrijk voor het geheugen en het leren. Bovendien kan Cistanche deserticola ook de bloedstroom verbeteren en de zuurstoftoevoer bevorderen, wat ervoor kan zorgen dat de hersenen voldoende voedingsstoffen en energie ontvangen, waardoor de vitaliteit en het uithoudingsvermogen van de hersenen worden verbeterd.

Klik op supplementen kennen om het geheugen te vergroten

We selecteerden dsDNA-puncta variërend in grootte van 2 tot 20 um' (circulariteit 0.1-1.0) met behulp van de functie "Analyze-Analyze Particles". indien nodig werden de originele beelden onderzocht voor de definitieve telling. Als het signaal van histon H2B klein was. vervolgens vertoonden de afgetrokken afbeeldingen donutachtige structuren.

Deze vertegenwoordigen cytosolisch dsDNA van nucleaire oorsprong en moeten worden geëlimineerd uit de hoeveelheid cytosolisch dsDNA van mitochondriale oorsprong. Het groottebereik kan worden aangepast afhankelijk van het celtype of de oorsprong van histologische monsters. Figuur lE toont een voorbeeld van het tellen van ectopisch mitochondriaal DNA

punten met 1B D.

Als alternatief werden afbeeldingen van Hsp60-kleuring afgetrokken van afbeeldingen van dsDNA-kleuring. Vervolgens werd het aantal dsDNA-puncta geteld met behulp van de functies "Adjust-Threshold"Analyze-Analyze Particles". Vervolgens werden dsDNA-puncta zonder het histon-H2B-signaal geteld door directe observatie. De laatste methode is geschikt wanneer de histon-H2B-afbeeldingen vertonen een lage signaal-ruisverhouding.

Alles bij elkaar kan deze methode duidelijk aantonen dat ectopisch mitochondriaal DNA in het cytoplasma lekt en maakt een objectieve en statistische evaluatie van dergelijk ectopisch mitochondriaal DNA in cellen mogelijk.

4. Discussie

In onze studie hebben we een methode ontwikkeld die het tellen van cytoplasmatisch mitochondriaal DNA mogelijk maakt. Detectie van cytoplasmatisch mitochondriaal DNA is gerapporteerd met behulp van immunofluorescentietechnieken, maar de methoden waren in de meeste gevallen niet kwantitatief voor de evaluatie van cytoplasmatisch mitochondriaal DNA [15,25]. In een ander onderzoek werd druppeltjes-PCR uitgevoerd om het circulerend mitochondriaal DNA te kwantificeren [9].

onlangs hebben Sato et al. [26,27]publiceerde een uitstekend protocol om cytoplasmatisch DNA te evalueren door middel van immunofluorescentiemicroscopie met behulp van Lamin B1 (LMNB1)-antilichamen als een nucleaire structuurmarker en cytochroom c-oxidase-subeenheid 4 (COX4) als een mitochondriale structuurmarker. Dit protocol lijkt erg nuttig voor het kwantificeren van cytoplasmatisch dsDNA van nucleaire oorsprong.

Toen we echter COX4 of andere mitochondriale membraanmarkers probeerden, inclusief zowel binnen- als buitenmarkers, was het erg moeilijk om het cytoplasma nauwkeurig te onderscheiden van de mitochondriën.

Als we bijvoorbeeld cirkelvormige signalen zouden waarnemen met behulp van een mitochondriale membraanmarker en dsDNA-signalen daarin zouden waarnemen, dan zou dit dsDNA ofwel mitochondriaal DNA binnen de circulaire mitochondriën (normaal) ofwel cytoplasmatisch mitochondriaal DNA buiten de donutachtige mitochondriën (ectopisch) kunnen vertegenwoordigen. We gebruikten dus Hsp60 als een marker die de itochondriale matrix labelde om het ectopische mitochondriale DNA in het cytoplasma te evalueren.

Zoals beschreven in een recent overzicht [23] zijn er veel verschillende soorten cytoplasmatisch DNA van nucleaire oorsprong, en de meeste daarvan zijn positief voor histonmarkers. Vanwege de beperking van de combinatie van antilichamen die voor drievoudige kleuring worden gebruikt, hebben we histon H2Bas als histonmarker gebruikt.

Als deze beperking echter wordt opgelost, kan H2AX een betere marker zijn voor cytoplasmatisch dsDNA van nucleaire oorsprong. Histone-H2B-negatief cytoplasmatisch dsDNA werd zelden waargenomen in de controle-HeLa-cellen die in dit onderzoek werden gebruikt, maar dergelijk dsDNA van nucleaire oorsprong kan aanwezig zijn als andere cellijnen of omstandigheden worden gebruikt.

De in situ hybridisatie van mitochondriaal DNA die in ons recente artikel wordt gebruikt, is geschikt voor kwalitatieve evaluatie, maar het kan moeilijk zijn om in situ hybridisatie te gebruiken voor kwantitatieve evaluatie [8].

In situ hybridisatie stelt het monster bloot aan hoge temperaturen, wat kan resulteren in vervorming of ruis van sommige delen van het monster. Aan de andere kant kan de immunocytochemische methode die in dit artikel wordt gepresenteerd signalen verkrijgen met weinig achtergrondruis. In ons recente artikel hebben we in de menselijke cellen en zebravissen die worden gebruikt als modellen voor de ziekte van Parkinson aangetoond dat mitochondriaal DNA naar het cytoplasma is gelekt, wat giftig is voor de ziekte van Parkinson. cellen. We hebben ook waargenomen dat de hoeveelheid cytosolisch mitochondriaal DNA was toegenomen in het postmortale hersenweefsel van patiënten met de ziekte van Parkinson [8].

Deze bewijslijnen suggereren dat een grotere hoeveelheid ectopisch mitochondriaal DNA dat uit de mitochondriën lekt, acute en chronische ontstekingen kan veroorzaken, resulterend in verschillende ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson en hartfalen; dus de opregulatie van de afbraak van cytosol-DNA of remming van de sensoren ervan zou een potentieel therapeutisch doelwit voor deze ziekten kunnen zijn [8,28].

De in dit artikel geïntroduceerde methode voor de kwantitatieve evaluatie van ectopisch mitochondriaal DNA dient als een belangrijk hulpmiddel voor verder onderzoek op dit gebied.

Bijdragen van de auteur: HM en MTH formuleerden de hypothesen, ontwierpen het merendeel van de experimenten, voerden de experimenten uit, analyseerden de gegevens en schreven het manuscript. NMvoerde de experimenten uit met betrekking tot gekweekte cellen. Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.

Financiering: Dit werk werd ondersteund door subsidies van AMED (subsidienummers JP21gm6110028 enJP19dm0107154 (HM)), de Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (subsidienummers JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) en JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D; subsidienummerJPMJMS2024 (HM)) en Grants-in-Aid van TBRF (subsidienummer TBRF-RF 21-135 (HM)).

Verklaring over beschikbaarheid van gegevens: De gegevens en hulpmiddelen die in dit manuscript worden beschreven, zijn op aanvraag verkrijgbaar.

Dankbetuiging: Wij danken Shinano Kobayashi voor zijn deelname aan nuttige discussies en het bieden van voortdurende ondersteuning. Wij erkennen de Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) voor het verstrekken van een TBRF postdoctorale beurs voor buitenlandse onderzoekers aan MH (TBRF-RF 21-135).

Belangenverstrengeling: De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Referenties

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Zon, L.; Chen, ZJ Centrale rollen van cGAS-cGAMP-signalering bij antivirale verdediging en immuunadjuvante effecten. Wetenschap 2013, 341, 1390–1394. [Kruisref] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Door herpesvirusgenoomherkenning geïnduceerde acetylering van nucleair IFI16 is essentieel voor de cytoplasmatische translocatie, ontstekings- en IFN-reacties. PLoS-pathog. 11, 2015, e1005019. [Kruisref] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Hancks, gelijkstroom; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, DM cGAS-gemedieerde stabilisatie van IFI16 bevordert aangeboren signalering tijdens herpes simplex-virusinfectie. Proc. Nat. Acad. Wetenschap VS 2015, 112, E1773–E1781. [Kruisref] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavaron, AT; Portnoy, DA c-di-AMP uitgescheiden door intracellulaire Listeria monocytogenes activeert een gastheertype I-interferonreactie. Wetenschap 2010, 328, 1703–1705. [Kruisref] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; et al. Cytoplasmicchromatine veroorzaakt ontstekingen bij veroudering en kanker. Natuur 2017, 550, 402–406. [Kruisref]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Kapper, GN; et al. Downregulatie van cytoplasmatische DNAsen is betrokken bij cytoplasmatische DNA-accumulatie en SASP in verouderde cellen. Nat.Commun. 9, 1249 2018. [Kruisref]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.; Chin, HS; et al. BAK/BAX-macroporiën vergemakkelijken mitochondriale herniatie en mtDNA-efflux tijdens apoptose. Wetenschap 2018,359, eaao6047. [Kruisref]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Cytosolisch dsDNA van mitochondriale oorsprong induceert cytotoxiciteit en neurodegeneratie in cellulaire en zebravismodellen van de ziekte van Parkinson. Nat. Gemeenschappelijk. 12, 3101 2021. [Kruisref]

9. Snijmachine, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Zon, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; et al. Parkine en PINK1 verminderen door STING geïnduceerde ontstekingen. Natuur 2018, 561, 258–262. [Kruisref]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, parlementslid; Croteau, DL; Bohr, VA NAD(+)-suppletie vermindert neuro-inflammatie en celveroudering in een transgeen muismodel van de ziekte van Alzheimer via cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Wetenschap VS 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com